引物设计实例分析.ppt

1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不能大于38，因为过长 会导致其延伸温度大于74℃，即 Taq酶(Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中
分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。 对于PCR的应用有里程碑的意 义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶， 使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量 应用，并逐步应用于临床。 与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使片
6.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ引物自身
引物间3’端的互补、二聚体或发 夹结构也可能导致PCR反应失败
引物自身不应存在互补序列，否则引物自 身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与 模板的复性结合。若用人工判断，引物自 身连续互补碱基不能大于3bp。
7. 引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′ 端的互补重叠以防引物二聚体的形成。 一对引物间不应多于4个连续碱基的同 源性或互补性。
的最适温度 段3'端凸出一个A,应注意)
2.产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对.
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一 般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相 对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一 定的退火温度.
Tm=2(A+T)+4(C+G)
第一步：检索DJ-1mRNA基本序列
LOCUS NM_057143
1097 bp mRNA linear ROD
1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg 61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc tgtgcagagc 121 cgtctggcag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg 181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc 241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg 301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt 361 cctgtggaca tcatgcggcg agctgggatt aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag 421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca 481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac 541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcctacggcc ctgctggctc acgaagtagg ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tggaccctgg acccccaggc 901 tgagcaggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比 例为40-60%，过高或过低都 不利于引发反应。上下游引 物的GC含量不能相差太大。
5.碱基础随机分布
• 引物中四种碱基的分布最好是随机的， 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不应超过3个连续的G或C，因这样会 使引物在G+C富集序列区错误引发。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进 行任何修饰。3′端也不能有形成任 何二级结构可能，
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大。因此，可以被修 饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰 包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序
引物设计实例分析
引物设计基本原则
• 引物长度（primer length） • 产物长度（product length） • 序列Tm值 (melting temperature) • G+C含量（composition） • 引物二聚体及发夹结构
（duplex formation and hairpin） • 阅读框
列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码 子的第3位，因密码子的第3位易发生简并， 会影响扩增特异性与效率。
11.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要 超过70%或有连续8个互补碱基同源。
任务
设计DJ-1蛋白表达引物
Plasmid 1:
Plasmid 2