引物设计ppt
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引物设计ppt
PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
《引物设计教程》课件
退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
❖ 先调整 premer5 的flie 的 pr源自ferences 的 默认碱基长度
❖ 4、要设计两条链的引物，Sense链和AntiSense链，注意上下游引物： Sense链是上游 引物， Anti- Sense链是下游引物（如何判断）
❖ 5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物 长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基
❖ 其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，
❖ 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。
❖
❖ Tm温度过高过低会出现问题
❖ 7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
❖ 8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何
修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
❖ 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
十条PCR引物的设计原则总述
❖ ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ❖ ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ❖ ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ❖ ④ G+C含量在40%~60%之间。 ❖ ⑤ 碱基要随机分布。 ❖ ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ❖ ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ❖ ⑧ 引物5’端可以修饰。 ❖ ⑨ 引物3’端不可修饰。 ❖ ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
❖ 4、要设计两条链的引物，Sense链和AntiSense链，注意上下游引物： Sense链是上游 引物， Anti- Sense链是下游引物（如何判断）
❖ 5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物 长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基
❖ 其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，
❖ 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。
❖
❖ Tm温度过高过低会出现问题
❖ 7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
❖ 8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何
修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
❖ 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
十条PCR引物的设计原则总述
❖ ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ❖ ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ❖ ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ❖ ④ G+C含量在40%~60%之间。 ❖ ⑤ 碱基要随机分布。 ❖ ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ❖ ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ❖ ⑧ 引物5’端可以修饰。 ❖ ⑨ 引物3’端不可修饰。 ❖ ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
第五章PCR引物设计-精选.ppt
ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
《引物设计教程》课件
引物长度：通 常为15-30bp， 过长可能导致 非特异性扩增
引物GC含量： 尽量控制在 40-60%，避
免形成二级结 构
引 物 Tm 值 ： 应接近目标序 列 的 Tm 值 ， 以提高扩增效
率
引物3'端：避 免形成发卡结 构，以免影响
扩增效果
引物特异性： 确保引物与目 标序列具有高 度特异性，避 免非特异性扩
增效率和稳定性
引物3'端：避免3'端 出现连续3个或以上 的碱基，以降低错配
率
引物二级结构：使用 软件预测引物二级结 构，避免形成发卡结 构，提高扩增效率
引物特异性：通过 BLAST比对，确保引 物特异性，避免非特
异性扩增
引物浓度：优化引物 浓度，以提高扩增效
率和稳定性
引物纯度：确保引物 纯度，避免污染和降 解，提高扩增效率和
引物GC含量：尽量保持 50%左右，避免过高或 过低
引 物 Tm 值 ： 确 保 引 物 Tm 值在55-65℃之间，以提 高扩增效率
引物特异性：确保引物与 目标序列具有高度特异性， 避免非特异性扩增
引物错配：避免引物内部 错配，以提高扩增效率和 准确性
引物设计软件：可使用 Primer3、OligoT等软 件辅助设计引物
引物设计不当导 致扩增失败
引物设计不当导 致非特异性扩增
引物设计不当导 致扩增效率低
引物设计不当导 致扩增产物长度 不均一
引物设计软件：选择 合适的引物设计软件， 如Primer3、Primer-
BLAST等
引物长度：确保引物 长度在18-25bp之间， 以提高特异性和扩增
效率
引物GC含量：保持 引物GC含量在4060%之间，以提高扩
《基因引物设计》课件
引物的长度一般在15-30bp之间，根据目 标基因序列的特性和实验要求选择合适的 长度。
选择合适的引物序列
避免引物二聚体和发夹结构
引物的序列应与目标基因序列完全互补， 且在3’端应有一个突出的单链区域，以便 于DNA聚合酶的结合和延伸。
引物自身不能形成二聚体或发夹结构，否 则会影响引物的结合和DNA聚合酶的延伸 。
2023
PART 03
基因引物设计的实践应用
REPORTING
基因克隆与表达
基因克隆
基因引物设计是基因克隆过程中的关键 步骤，通过设计特异性的引物，可以实 现对目标基因的特异性扩增，进而进行 克隆和表达。
VS
基因表达
在基因表达方面，基因引物设计可用于检 测基因的表达水平，通过设计特异性引物 ，对特定基因的表达产物进行扩增和检测 ，从而了解该基因的表达情况。
2023
PART 02
基因引物设计的基本步骤
REPORTING
选择合适的引物设计软件
总结词
选择合适的引物设计软件是基因引物设计的重要步骤，有助于提高引物设计的 效率和准确性。
详细描述
在选择引物设计软件时，应考虑其功能、易用性、准确性和可靠性。一些常用 的引物设计软件包括Primer3、Oligo、Beacon Designer等，这些软件可根据 用户需求提供不同的引物设计方法和功能。
基因引物设计的重要性
确保基因复制的准确性和完整性
基因引物是DNA复制的起始点，设计合理的引物能够确保复制的 准确性和完整性，避免出现突变或缺失。
提高PCR扩增效率
设计合理的基因引物可以提高PCR扩增效率，缩短扩增时间，提高 实验效率。
应用于基因克隆、测序等领域
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引物与PCR
引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L
引物浓度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328
＋T×303-61）/VH2O
VH2O (单位：L)
退火温度
最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7
× (Tm of product) – 25
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据
Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学
参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这 也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。
如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与
模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
引物的保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽可能多的型别
特异性：避免非特异性扩增
扩增区域的二级结构
模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，
物
选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源
的序列作为引物
引物（primers)
引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。 5’ 3’
Sense primer 5’
→
Antisense primer
←
3’
引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的
如何使用Primer Premier 5.0
引物设计
一般引物设计 5’带酶切位点引物设计 巢式PCR引物设计 多重PCR引物设计
探针设计
引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作
为引物
选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引
5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生
物素、地高辛等）。
引物的内部稳定性
过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低
引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多
碱基互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则
将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个
碱基与模板DNA均需严格配对，不能进
行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，
甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密
地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA
特异结合，不与其他非目的DNA结合，
PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物
进行有效的延伸，可见引物设计好坏与
PCR结果密切相关。
引物设计原则Biblioteka 引物长度
碱基分布的均衡性
Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端
引物的内部稳定性
引物的保守性与特异性
在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些 区域。
扩增区域的自由能（△G。）小于
58.61kJ/mol
引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃
Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) - 500/length
码子的简并性，引物3’端最后一个碱基
最好不与密码子第三个碱基配对。
引物5’端
引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切
位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产
物中引入该位点的点突变以作研究。
扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个
GC含量一般40-60%
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低
的退火温度不利于提高PCR的特异性
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。
引物设计软件
Primer Premier 5.0
生物软件网下载 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer