引物设计 例子

从NCBI里面搜索基 因序列，方法如下
PCR引物设计的原则


1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 3.引物GC含量在40%~60%之间，上下游引物Tm差值不 大于4度。 4.引物3′端要避开密码子的第3位 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 6.碱基要随机分布。
常见生物医学 软件操作


1.引物设计 2.graphpad grism5 数据分析 3.endnote X7 插入文献 4.lightcycler@96 实时定量
1.引物设计

采用Primer Premier 5.0 进行引物设计 首先打开Primer Premier 5.0 ，输入序列

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
点开红色所指图示

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。尤其应避免3′端的 互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的 形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其 △G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生 引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能 正常进行。 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 △G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结 构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。 应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低 （绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易 在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位 置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）