生物工程上游技术实验-生工16级

五、实验结果
观察并分析电泳图片
六、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验三 质粒DNA的片断化及分离
一、实验目的
1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量
2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通
过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。
二、实验原理
DNA的吸收峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的 OD值，当OD260=1时，双链DNA含量为50 µ g/mL，据此可 用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。蛋白质的吸收峰在 280 nm处，在测定DNA时，通过计算OD260/OD280值，可了 解所测DNA的纯度，如该值为1.7～2.0时，DNA纯度高。 已知Ⅱ型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在 该处切断双链DNA，形成一定长度的片段。酶切反应需 Mg2+等盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离 子浓度使用不当或甘油含量过高（﹥5%），会使酶的识别 位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度37℃。
7. 上层水相吸入另一干净1.5mL离心管中，加入2/3体积 的异丙醇，轻轻混匀，静置5min，使核酸沉淀下来； 8. 室温下10000 rpm离心10min； 9. 弃去上清液，加入500µ L洗涤缓冲液，悬浮混匀；
10. 4℃条件下，14000 rpm离心10min；
11. 在室温下使DNA沉淀干燥至周围透明，中间有少许白 色为止； 12. 将DNA沉淀溶于20µ L TE中，-20℃保存备用； 13. 取5uL DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取 DNA的完整性； 14. 利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。 （方法同实验二）
分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去。
有效制备大分子DNA的两个原则：
1）防止和抑制内源DNase对DNA的降解。 2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；所有操作 均须温和，避免剧烈震荡。
三、实验材料：水稻叶片约0.2克 四、实验试剂
1M Tris-HCl (pH8.0)(提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏) CTAB分离缓冲液：2% CTAB，1.4mol/L NaCl， 20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巯基 乙醇 (EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供
含质粒的大肠杆菌的接种、培养与保藏 一、实验目的
1、了解培养基的配制原理，掌握配制培养基的一
般方法和步骤；
2、了解常见灭菌基本原理及方法，掌握高压蒸汽
灭菌的操作方法； 3、了解菌种保藏的基本原理，掌握菌种保藏方法 和无菌操作技术。
二、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖 和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的 原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。 LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养 基，含有酵母抽提物、蛋白胨和氯化钠。
三、实验材料与主要试剂
实验一的材料：含质粒pEGFP或pUC19 的大肠杆菌DH5α
主要试剂：
溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、氯仿 TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含RNA酶（RNaseA）: 20 µ g/mL 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇
（自己拍照）。
6、菌种保藏（本次实验不做）
取500 µ L 过夜培养的菌液加入到已灭菌的1.5mL
离心管中，再加入500 µ L 已灭菌甘油水溶液（浓
度为30~50%）；充分混匀，写明菌种名称、日期；
将离心管置入装有液氮的容器浸泡处理，用镊子 取出后立即放入-80℃冰箱中保存。
六、实验报告的要求
包括本次实验的实验目的、实验原理、实验材料 及试剂、实验步骤、真实的实验结果及详细的结 果分析、教材后面的思考题。
100mL 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入
5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备 用。
15) 每位同学各取5µ L质粒DNA加入1µ L 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝 胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
实验二 质粒DNA的制备与质量鉴定
一、实验目的
学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质 粒DNA的提取方法。
二、实验原理
在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结 构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小， 且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互 补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒 DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色 体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成 不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的 RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋 白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。
四、实验步骤
1) 吸取1.4 mL菌液至1.5 mL离心管中。
2) 离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判 断是否需要重复1~2次）。 3) 加入150 µ L 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 4) 加入200 µ L溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透 明状。此步骤在5分钟内完成。 5) 加入150 µ L预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直 至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。 6) 离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心 管。
六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验五 RNA的制备和质量鉴定
一、实验目的
掌握利用试剂盒提取植物细胞总RNA的方法。
二、实验原理
四、主要试剂
酵母抽提物、蛋白胨、氯化钠、氨苄青霉素等。
五、实验步骤
1、配制LB液体培养基
称胰蛋白胨0.4 g，酵母提取物0.2 g，NaCl 0.4 g，
加入40 mL蒸馏水搅拌溶解， 分装于2个三角瓶中，
每瓶20 mL，用4层报纸包扎瓶口。 2、培养基的灭菌 将配制好的培养基放入高压灭菌锅中灭菌备用。
2、酶切反应
酶切反应液的配制: Xba I 1μL 10×M buffer 2μL 0.1%BSA 2μL 质粒DNA 2μL (根据浓度确定用量) ddH2O 到 20μL 酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
3、电泳检测
反应结束后，向反应液加2或4μ L 10×或6×loading buffer，混匀，以停止酶切反应，所有样品均点在一个点 样孔。电泳条件：100V, 20分钟左右。
生物工程上游技术实验 （生工16级）
实验项目（64学时）
1、含质粒的大肠杆菌的接种、培养与保藏（4学时） 2、质粒DNA的制备与质量鉴定（6学时） 3、质粒DNA的片段化与分离（6学时） 4、大分子DNA的制备和质量鉴定（6学时） 5、RNA的制备和质量鉴定（6学时） 6、PCR反应（6学时） 7、利用RT-PCR技术分析基因表达（6学时） 8、PCR产品纯化及克隆（6学时） 9、感受态细胞制备及转化（6学时） 10、利用不同的方法筛选和鉴定转化子
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验四 大分子DNA的制备和质量鉴定 一、实验目的
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织 中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖 凝胶电泳检测。
二、实验原理
核酸是生物体的重要成分，在细胞中常与蛋白质结合在一 起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。 在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度大， RNA核蛋白的溶解度小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度小，RNA核蛋白的溶解度大。因此，可 利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品 中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。
3、液体培养基接种
将灭菌培养基移入超净工作台内；当培养基温度降 至55~60℃后，加20 µ L氨苄青霉素（100 mg/mL ）， 然后接种含不同质粒的菌种。
4、大肠杆菌的培养 大肠杆菌在液体培养基中，37℃，200转/分钟的摇 床培养过夜。 5、实验结果的观察
第二天取出培养物，观察记录不同菌种生长情况
（综合设计实验，12学时）

实验要求


两人一组，独立实验
每次实验完成均要求写实验报告及做思考题 不得旷课，特殊情况可补实验 每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶

考核


前9个实验共计50分（实验报告和思考题） （本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩） 综合实验（包括设计报告）共计50分
实验一
高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从 而达到杀死微生物的效果。 微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基 本操作技能，分为斜面接种、液体接种、固体接种和穿 刺接种等。
三、实个）
2. 含pUC19质粒的大肠杆菌DH5α 3. 含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α