生物工程上游技术实验-生工16级

2、酶切反应
酶切反应液的配制: Xba I 1μL 10×M 源自文库uffer 2μL 0.1%BSA 2μL 质粒DNA 2μL (根据浓度确定用量) ddH2O 到 20μL 酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
3、电泳检测
反应结束后，向反应液加2或4μ L 10×或6×loading buffer，混匀，以停止酶切反应，所有样品均点在一个点 样孔。电泳条件：100V, 20分钟左右。
100mL 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入
5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备 用。
15) 每位同学各取5µ L质粒DNA加入1µ L 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝 胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。
3、液体培养基接种
将灭菌培养基移入超净工作台内；当培养基温度降 至55~60℃后，加20 µ L氨苄青霉素（100 mg/mL ）， 然后接种含不同质粒的菌种。
4、大肠杆菌的培养 大肠杆菌在液体培养基中，37℃，200转/分钟的摇 床培养过夜。 5、实验结果的观察
第二天取出培养物，观察记录不同菌种生长情况
五、实验结果
观察并分析电泳图片
六、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验三 质粒DNA的片断化及分离
一、实验目的
1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量
2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通
过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。
二、实验原理
DNA的吸收峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的 OD值，当OD260=1时，双链DNA含量为50 µ g/mL，据此可 用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。蛋白质的吸收峰在 280 nm处，在测定DNA时，通过计算OD260/OD280值，可了 解所测DNA的纯度，如该值为1.7～2.0时，DNA纯度高。 已知Ⅱ型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在 该处切断双链DNA，形成一定长度的片段。酶切反应需 Mg2+等盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离 子浓度使用不当或甘油含量过高（﹥5%），会使酶的识别 位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度37℃。
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验四 大分子DNA的制备和质量鉴定 一、实验目的
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织 中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖 凝胶电泳检测。
二、实验原理
核酸是生物体的重要成分，在细胞中常与蛋白质结合在一 起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。 在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度大， RNA核蛋白的溶解度小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度小，RNA核蛋白的溶解度大。因此，可 利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品 中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。
7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出 现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µ L）于另一干净离心管， 加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min， 5min)，溶液将出现分层。 9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的 醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。
（自己拍照）。
6、菌种保藏（本次实验不做）
取500 µ L 过夜培养的菌液加入到已灭菌的1.5mL
离心管中，再加入500 µ L 已灭菌甘油水溶液（浓
度为30~50%）；充分混匀，写明菌种名称、日期；
将离心管置入装有液氮的容器浸泡处理，用镊子 取出后立即放入-80℃冰箱中保存。
六、实验报告的要求
包括本次实验的实验目的、实验原理、实验材料 及试剂、实验步骤、真实的实验结果及详细的结 果分析、教材后面的思考题。
10) 离心(14 000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。
11) 加0.5 mL 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次， 离心5 min，倒掉上清液。
12)真空抽干或室温自然干燥.
13)加20~30µ L TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置 10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检 测，剩余质粒-20℃保存备用。 14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入
四、实验步骤
1) 吸取1.4 mL菌液至1.5 mL离心管中。
2) 离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判 断是否需要重复1~2次）。 3) 加入150 µ L 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 4) 加入200 µ L溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透 明状。此步骤在5分钟内完成。 5) 加入150 µ L预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直 至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。 6) 离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心 管。
含质粒的大肠杆菌的接种、培养与保藏 一、实验目的
1、了解培养基的配制原理，掌握配制培养基的一
般方法和步骤；
2、了解常见灭菌基本原理及方法，掌握高压蒸汽
灭菌的操作方法； 3、了解菌种保藏的基本原理，掌握菌种保藏方法 和无菌操作技术。
二、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖 和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的 原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。 LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养 基，含有酵母抽提物、蛋白胨和氯化钠。
三、实验材料：实验二提取的质粒DNA 四、试剂
限制性核酸内切酶Xba I；缓冲液10×M Buffer； 0.1%BSA; 0.5×TBE Buffer；1%琼脂糖
五、实验步骤
1、DNA含量的测定和纯度分析
空白测定(Blank)：吸取200 µ L TE缓冲液至比色杯， 进行空白测定。
DNA测定(Sample)：取质粒DNA 1 µ L至一干净的离心 管，加入199 µ L TE缓冲液稀释混匀，转入比色杯，测定 260 nm及280 nm的OD；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。
7. 上层水相吸入另一干净1.5mL离心管中，加入2/3体积 的异丙醇，轻轻混匀，静置5min，使核酸沉淀下来； 8. 室温下10000 rpm离心10min； 9. 弃去上清液，加入500µ L洗涤缓冲液，悬浮混匀；
10. 4℃条件下，14000 rpm离心10min；
11. 在室温下使DNA沉淀干燥至周围透明，中间有少许白 色为止； 12. 将DNA沉淀溶于20µ L TE中，-20℃保存备用； 13. 取5uL DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取 DNA的完整性； 14. 利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。 （方法同实验二）
分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去。
有效制备大分子DNA的两个原则：
1）防止和抑制内源DNase对DNA的降解。 2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；所有操作 均须温和，避免剧烈震荡。
三、实验材料：水稻叶片约0.2克 四、实验试剂
1M Tris-HCl (pH8.0)(提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏) CTAB分离缓冲液：2% CTAB，1.4mol/L NaCl， 20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巯基 乙醇 (EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供
高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从 而达到杀死微生物的效果。 微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基 本操作技能，分为斜面接种、液体接种、固体接种和穿 刺接种等。
三、实验材料
1. 大肠杆菌DH5α（班长与学委各做1个）
2. 含pUC19质粒的大肠杆菌DH5α 3. 含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α
四、主要试剂
酵母抽提物、蛋白胨、氯化钠、氨苄青霉素等。
五、实验步骤
1、配制LB液体培养基
称胰蛋白胨0.4 g，酵母提取物0.2 g，NaCl 0.4 g，
加入40 mL蒸馏水搅拌溶解， 分装于2个三角瓶中，
每瓶20 mL，用4层报纸包扎瓶口。 2、培养基的灭菌 将配制好的培养基放入高压灭菌锅中灭菌备用。
实验二 质粒DNA的制备与质量鉴定
一、实验目的
学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质 粒DNA的提取方法。
二、实验原理
在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结 构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小， 且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互 补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒 DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色 体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成 不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的 RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋 白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。
高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巯基乙醇是抗氧 化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易从基因组 DNA中除去)
洗涤缓冲液：76%乙醇，10mmol/L乙酸铵
氯仿-异戊醇(24:1 )、异丙醇、TE缓冲液 液氮
五、实验步骤
1. CTAB分离缓冲液置于60℃水浴中预热； 2. 2人一组，摘取0.5g叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽 快将叶片研碎； 3. 取约0.2g叶片粉末加入到2.0mL离心管中，加入1mL 预热的CTAB分离缓冲液，轻轻转动使之混匀； 4. 样品置于65℃保温30min； 5. 加等体积(1mL)的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀； 6. 室温下14000 rpm离心10min；
生物工程上游技术实验 （生工16级）
实验项目（64学时）
1、含质粒的大肠杆菌的接种、培养与保藏（4学时） 2、质粒DNA的制备与质量鉴定（6学时） 3、质粒DNA的片段化与分离（6学时） 4、大分子DNA的制备和质量鉴定（6学时） 5、RNA的制备和质量鉴定（6学时） 6、PCR反应（6学时） 7、利用RT-PCR技术分析基因表达（6学时） 8、PCR产品纯化及克隆（6学时） 9、感受态细胞制备及转化（6学时） 10、利用不同的方法筛选和鉴定转化子
（综合设计实验，12学时）

实验要求


两人一组，独立实验
每次实验完成均要求写实验报告及做思考题 不得旷课，特殊情况可补实验 每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶

考核


前9个实验共计50分（实验报告和思考题） （本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩） 综合实验（包括设计报告）共计50分
实验一
三、实验材料与主要试剂
实验一的材料：含质粒pEGFP或pUC19 的大肠杆菌DH5α
主要试剂：
溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、氯仿 TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含RNA酶（RNaseA）: 20 µ g/mL 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇
六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验五 RNA的制备和质量鉴定
一、实验目的
掌握利用试剂盒提取植物细胞总RNA的方法。
二、实验原理