聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件

3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有 较高的平衡浓度。
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)
是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸
银（银离子）还原成金属银，以使银 颗粒沉积在蛋白带上。
（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线 形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部 分冷却不好。
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而 改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充 分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合 物。
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离
子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基 的电泳迁移率主要取决于亚基分子量 的大小，而电荷因素可以被忽略。
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保
护SHDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，
一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需 要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白 并没有完全被去折叠。
（4） 电泳 （5） 固定
（6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含 有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑 一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶 束基本上是相同的。 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD—200KD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数 呈线性关系
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
蛋白带迁移距离
固定前的凝胶长度
Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度
溴酚蓝迁移距离
2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质
稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的。
电泳缓冲液的种类： 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。 4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品。 5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 平板电泳
垂直电泳 水平电泳
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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2019/5/6
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（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引
起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治”底部有气泡或靠近隔片的 凝胶聚合不完全。
（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。
（4）“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。
（5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而
1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal）
二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚或组成它们的多肽键 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异。
（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白
质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。
不同分子量范围的蛋白质应选用 不同的凝胶浓度.
（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚 蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
三、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
四、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同