【并购重组】第七章细菌和噬菌体的重组和连锁
7细菌和噬菌体的遗传和重组
F因子的整合特点
(1) 整合是通过IS序列处的同源重组发生的。
(2) F有多个IS 作为整合位点，主要在IS3
处； E.coli染色体上有20个以上的整合 位点； (3) 通过与染色体不同位置上的IS整合，形 成不同的Hfr菌株，对染色体上基因的 转移起点不同； (4) 由于IS序列有不同的方向，F可以不同 方向整合。
第二节 噬菌体的连锁和交换
一、噬菌体的结构和形态
表 8-6 病毒 T-偶数噬菌体 T7 λ P22 φ ×174 Qβ （呼肠病毒） SV40 鼠白血病病毒 烟草花叶病毒 几种病毒染色体的特点 核酸结构 双链 DNA 双链 DNA 双链 DNA 双链 DNA 单链 DNA 单链 RNA 双链 RNA 双链 DNA 单链 RNA 单链 RNA 染色体类型 线状；环状排列末端有 RS 线状；单一顺序 线状；单股粘性末端 线状；单一顺序 环状 线状 几个片段 超螺旋环 几个片段 线状 宿主 E.coli E.coli E.coli 沙门氏菌 E.coli E.coli 哺乳动物 人类 鼠 烟草
七. 重组作图－E.coli染色体连锁图
部分合子（merozygote）也称半合子， 内基因子 (endogenote) 外基因子（exogenote） 例：供体strspur+lac+pro+，受体strrpur-
lac-pro-,以pur+为选择标记 pur 和lac间重组值：
野生型E.coli K12 (λ) gal＋
基本 培养基
UV
诱导
细胞裂解，收集裂解液
感染多种非溶原缺陷型
选择
gal＋ 转导子
频率10－6
溶源化 溶源菌：反常切离频率10-6
第七章细菌和噬菌体的重组和
第七章细菌和噬菌体的重组和连锁7.一个基因型为a+b+c+d+e+并对链霉素敏感的E.coliHfr菌株与基因型为a-b-c-d-e-并对链霉素耐性的F-菌株接合，30分钟后，用链霉素处理，然后从成活的受体中选出e+型的原养型，发现它们的其它野生型（+）基因频率如下：a+70％，b+-，c+85％，d+10％。
问a，b，c，d四个基因与供体染色体起点（最先进入F-受体之点）相对位置如何？解：根据中断杂交原理，就一对接合个体而言，某基因自供体进入受体的时间，决定于该基因同原点的距离。
因此，就整个接合群体而论，在特定时间内，重组个体的频率反映着相应基因与原点的距离。
报据题目给定的数据，a、b、c、d与供体染色体的距离应该是：是：8.为了能在接合后检出重组子，必须要有一个可供选择用的供体标记基因，这样可以认出重组子。
另一方面，在选择重组子的时候，为了不选择供体细胞本身，必须防止供体菌株的继续存在，换句话说，供体菌株也应带有一个特殊的标记，能使它自己不被选择。
例如供体菌株是链霉素敏感的，这样当结合体（conjugants）在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。
现在要问：如果一个Hfr菌株是链霉素敏感的，你认为这个基因应位于染色体的那一端为好，是在起始端还是在末端？解：在起始端9.有一个环境条件能使T偶数噬菌体（T-even phages）吸附到寄主细胞上，这个环境条件就是色氨酸的存在。
这种噬菌体称为色氨酸需要型（C）。
然而某些噬菌体突变成色氨酸非依赖型（C+）。
有趣的是，当用C和C+噬菌体感染细菌时，将近一半的色氨酸非依赖型子代在进一步的实验中表现为基因型C。
你如何解释这个发现？解：首先，这不可能是回复突变，因为这里的频率是1／2。
应该注意的是，这里进行的是C和C+对寄主的混合感染。
当两种类型噬菌体同时感染同一寄主细胞时，两者在同一寄主细胞中增殖，同时，各自按照本身的遗传组成指导合成其外壳蛋白质，以便组装成成熟的噬菌体颗粒。
细菌和噬菌体的重组和连锁 Recombination and Linkage of Bacterium and Phage
(二) 中断杂交技术作图
他们发现不仅Hfr细菌的基因重组进入F-有一定的时间顺序，而且越早进入的基因， 它所达到的频率也越高。他们认识到，根据供体基因进入受体细胞的时间顺序可以绘 制连锁图，这就是中断杂交技术（interrupted mating technique)。根据中断杂交 绘制的基因连锁图，基因的距离的单位是分钟而不是厘摩。
五 低频重组与高频重组
（一）低频重组(low frequency recombination，Lfr)： F+与F-之间的杂交只有F因子的转移，因此尽管F因子的转 移频率很高，但是供受体细菌染色体的重组频率却很低， 约为10-6，因此F+品系称为低频重组品系(菌株)。 （二）高频重组(High frequency recombination，Hfr)： 如果F因子整合到细菌染色体上，这种染色体上带有一个 整合的F因子的品系，与F-细胞结合后可将供体染色体的 一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带 有不同的遗传标记时，可以观察到它们之间发生重组，重 组频率可达到10-2以上，称为高频重组品系（菌株）。但 是却很少使F-细菌转变成F+细菌。这个问题一度使遗传学 家迷惑不解。
3.重组子只有一种类型， 相反的重组子(reciprocal recombinant)不会 出现。所以细菌的交换不是一个交互过程，而是单向的。
八 重组作图
当基因距离较近时，转移时间间隔在两分钟之内，则用中断杂交作 图就不可靠，而必须用传统的重组作图(recombination mapping)与中 断杂交技术相互对照和补充，提高作图精度。如根据中断杂交，知道 lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，如果进行以下杂交：
拟核(Nucleoid) 核糖体(Ribosome)
(并购重组)第七章 遗传重组
第七章遗传重组教学基本要求：1．了解遗传重组的类型；2．掌握同源重组的Holliday模型，了解基因转变现象及其分子机制。
学时数：2学时基因重组是所有生物遗传的基本现象，无论是高等生物还是细菌，病毒中都存在基因重组；不只是在减数分裂中发生基因重组，在高等生物的体细胞中也发生重组；重组不只是在核基因之间发生，在叶绿体基因间、线粒体基因间也发生重组。
可以说，只要有DNA就会有重组发生。
第一节遗传重组的类型一、同源重组(homologous recombination)依赖大范围的DNA同源序列的联会。
重组过程中，两个染色体或DNA分子相互交换对等的部分。
在真核生物中，重组发生在减数分裂时期的同源染色体的非姊妹染色单体之间。
细菌及某些低等真核生物的转化、细菌的转导、接合以及某些病毒的重组等均属于这一类型。
同源重组中负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱基序列的特异性，只要两条DNA序列相同或接近，重组就可以在此序列中的任何一点发生。
大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白质，类似的蛋白质也存在于其他细菌中．因此，细茵中的同源重组又称为依赖RecA重组(dependent recombination RecA)。
重组热点：即某类序列发生重组的概率高于其他序列。
异染色质及其附近区域就很少发生重组；染色体端部重组频率高；重组率与臂长成反比。
二、位点专一性重组（site-specific recombination）依赖于小范围同源序列的联会，只涉及特定位置的短同源区或是特定的碱基序列之间。
重组时两个DNA分子发生精确的切割、连接反应，但并不交换对等的部分，而是是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，因此将这种形式的重组又称为整合式重组(integrative recombination)。
例如λ噬菌体DNA通过其attP位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间专一性重组而实现整合过程。
在重组部分有一段15bp的同源序列，这一同源序列是重组的必要条件，但不是充分条件，还须位点专一性的蛋白质因子参与催化。
Chap07 细菌和噬菌体的重组
结论是：这种重组是通过一种过滤性因子 (filterable agent, FA)实现的。之后证明该因 子是沙门氏菌的温和噬菌体P22。
转导(transduction): 以噬菌体为媒介, 将细 菌的小片段染色体或基因从一个细菌转移 到另一细菌的过程。
噬菌体烈温性 和噬噬菌菌体体，，裂溶解菌细周菌期和裂解周期 如P1、噬菌体
第七章 细菌和噬菌体的重组与连锁
§7.1 细菌的遗传分析 §7.2 噬菌体的遗传分析
§7.1 细菌的遗传分析 一、细菌（Bacteria）
细菌是单细胞原核生物，世代周期短, 容易获得 各种类型的突变型，易培养。
大肠杆菌 Escherichia coli
细菌的表现型： 菌落形态
颜色、大小、边缘状态等 营养需求 野生型(prototroph):基本培养基 营养缺陷型(auxotroph):完全培养基或补充 培养基 对药物、噬菌体和其他因素的反应 野生型细菌为药物敏感性
特异性转导(specialized transduction)或局限性转导 (restricted transduction)：噬菌体在转导时, 只携
带细菌染色体的特定部分。
1）.插入 比如λ噬菌体 经常插入宿主 E. coli染色体 gal与bio区段.
2）.溶菌
正常切离
异常切离 形成带有gal+的
原噬菌体(prophage):细菌细胞中无感染能力 的噬菌体叫原噬菌体。
溶源菌(lysogenic bacterium):含有原噬菌体的 细菌,称为溶源菌,具有产生和释放噬菌体的潜 力。
1、普遍性转导
普遍性转导（generalized transduction）: 通 过噬菌体能将供体的任何基因转移给受体, 如沙门氏菌的P22、大肠杆菌的P1。
生物竞赛 遗传 细菌和噬菌体的重组和连锁共38页
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
生物竞赛 遗传 细菌和噬菌体的重组 和连锁
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
1样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
细菌和噬菌体的重组和连锁(略)
病毒：蛋白质外壳和包裹其中的遗传物质。它比细胞更简单的生 物体，必须寄生于活细胞中，利用活细胞的代谢机能进行增殖。
植物病毒，动物病毒，细菌病毒（噬菌体，bacteriophage） 将不同特性的噬菌体添加到细菌培养中，后代中出现原有病毒的 新组合，因此它们间也有遗传物质的交换。
细菌和病毒作为遗传学研究材料的优越性
但是 F- 细菌很少变成 F+ 细菌。
中断杂交技术
根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的 技术，称为中断杂交技术 (interrupted mating technique )。 Wollman and Jacob
Hfr thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs F- thr- leu- azis tons lac- gal- strr
细菌的杂交
大肠杆菌是用得最广泛的遗传学实验材料，它对人类不是一 种严重的病原菌，而且可以在含有盐类和葡萄糖的简单培养 基上生长。细菌的杂交最初是在大肠杆菌中发现的。
大肠杆菌菌株 由于基因突变，大肠杆菌菌株十分丰富，是用于原核生物遗 传学研究的理想对象，大致可分：
▪ 对抗生素敏感性 ▪ 对特定营养的需要 ▪ 某种功能的有无
met- bio- thr+ leu+ thi+
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大剂量链霉素
A品系
无影响
大剂量链霉素
B品系
阻止了重组
F 因子（F 质粒）
F 质粒与细菌接合
F因子特点
• F＋细菌可以把F因子传给后代。 • F＋细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后
不再出现。 • F＋可以和F－杂交，而不能和F＋杂交。
• F＋和F－杂交后代皆为F＋，而且可以以10－7频 率获得重组体后代。
• Wollman和 Jacob对重组子 thr+leu+strr进行 菌落影印培养实 验。分析Hfr染 色体上其它非选 择性标记基因进 入F－细菌的顺序 和所需时间（分 钟），绘制连锁 图。
将上述菌液涂布在含有链霉素，但不含有苏氨酸和亮 氨酸的培养基上。这样，带thr+和leu+的Hfr菌株对链 霉素敏感；而带有strr的F－菌不能合成苏氨酸和亮氨 酸，都不能生长。只有带thr+和leu+的Hfr菌和带有 strr的F－菌的重组子可以生长。
如何检出某一基因的重组子?
• 把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、 受体菌都能生长。影响检测。我们只需要把发生重组的 重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基 因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择 thr+leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体 菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本 身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不 被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含 有链霉素的培养基上生长时Hale Waihona Puke 供体菌株就被杀死了。Hfr菌株
因为F因子和细菌的DNA分子都是环状的， 在环状的细菌染色体和环状的F因子间通过一个 交换，环状F因子就整合到环状的细菌染色体上。 F因子整合到细菌染色体上的菌株就是高频重组 菌株，称为Hfr菌株。高频重组菌株（Hfr菌株） 跟菌株B（F-）杂交时，细菌染色体上基因的重 组频率很高，即出现重组子的频率很高。
A
A+B
B
基本培 养基
met ＋ bio ＋ thi＋ leu＋ thr＋出现频率:1/107
细菌接合（示：杂交实验）
达尔夫Davis U型管实验
细菌接合
遗传物质的单方向转移
Hayes实验
A: met- thr+ leu+ thi+
B: met+ thr- leu- thiDonor： A Receptor：B
第七章 细菌和噬菌体的 重组和连锁
基本知识
细菌是单细胞，它的遗传物质是一个大型的环 状核酸分子，称之为基因带，也可称为染色体。
若细菌丧失产生某种营养物质（如氨基酸）的 能力就称为营养缺陷型，相对于缺陷型的野生 菌株叫原养型。
病毒的结构是由蛋白质外壳和包裹在中间的一 个单一的核酸分子（可称基因带或染色体）组 成。
• 不同
1、产生重组子频率不同，Hfr×F－为10－4， F＋×F－为10－7。
2、 F＋×F－后代F＋， Hfr×F－后代F－。 3、 F＋细菌经吖啶橙处理变成F－，Hfr经吖
啶橙处理仍为Hfr。
中断杂交技术：把Hfr细菌与F-细菌混 合培养，每隔一定时间取样，将试样搅 拌并稀释后在选择培养基上培养，使其 只有重组子类型可以生长，分析Hfr染色 体上基因进入受体细胞（F-细菌）的顺序 各所需时间（分钟），这种根据供体基 因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁 图的技术，称为中断杂交技术。
例如：细菌的基因组
One circular chromosome (4-5Mb)
原养型及营养缺陷型鉴别:
基因型的表 示：用它们 不能合成的 物质的前三 个字母
7.1 细菌的遗传分析
细菌的杂交
以大肠杆菌为例，大肠杆菌K12中两个菌株A 和B，菌株A是供体，含有F因子（F质粒），记 作F+，菌株B是受体，没有F因子，记作F-。F因 子又称性因子或致育因子，它是能独立增殖的环 状DNA分子。 F+细菌的表面有称作性伞毛的细 长纤毛。当F+细菌与F-细菌结合时，F因子通过性 伞毛从F+细菌转移到F-细菌，原来的细菌还仍为 F+。不过染色体很少通过结合而转移到F-细菌， 所以染色体上的基因的重组频率很低。
细菌接合
杂交实验 Lederberg 和 Tatum 1946
A＋B－×A－B＋
A＋B＋
回复突变or重组 ？？？
细菌接合
杂交实验 Lederberg 和 Tatum 1946
A＋B＋ C－D－ ×A－B－ C＋D＋
A＋B＋C＋D＋
A品系：met－ bio－ thi＋ leu＋ thr＋（thi：硫胺素B1） B品系：met＋ bio＋ thi－ leu－ thr－
High frequence recombination （图示 F因子整合到细菌染色体的过程）
Hfr与F-的接合（示：细菌的交换过程）
Hfr品系与F＋菌株的区别
• 相同
1、都能和F－杂交。 2、杂交都要通过接合管和受体菌相联接。 3、高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明
它们都是作为一种供体。
在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因
对每一时刻的重组 thr+leu+strr的菌落影印培 养接种到不同的培养基上（如乳糖lae++ 伊 红+美兰→红色，反之则是粉红色的。
记录重组子中每一非选择标记出现的时间、 出现的频率和持续时间，得图（Hfr的非选 择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非 选择标记在各个时间出现的频率作图）。
• 把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的 基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型 必定是thr+leu+strr。因为只有这种重组子才 能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体 并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基 因thr+和leu+为选择标记基因，而始终不被 选择的strs为反选择标记基因，而那些还没 有进行选择检定的基因为非选择标记。
中断杂交实验
巴斯德实验室，Elie Wolliman和Francois Jacob
（1）.Wollman和Jacob的实验 –要解决的问题是： • Hfr细菌在交配中，什么时候把基因转移给F－细菌。 • 方法：把两个菌株混在一起，进行杂交
将二菌株在培养液中通气培养，Hfr细菌与F－细菌开 始接触，形成接合管。每隔一定时间取样搅拌，断开 结合管，使配对的细菌分开。然后稀释菌液，防止再 度配对。