共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体 P1-2A 基因和蛋白酶

第49卷第6期 2004年3月论文共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性金宁一①张洪勇②尹革芬①郑敏①刘彤①江文正①李子健③(①解放军军需大学基因工程重点实验室, 长春 130062; ②复旦大学医学院, 上海 200032; ③白求恩医科大学, 长春 130001.E-mail: ningyij@)摘要将FMDV衣壳蛋白P1-2A和蛋白酶3C基因单一/共同插入到鸡痘病毒载体pUTA-2和pUTA- 16Lac Z中, 构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2P1和pUTAL3CP1, 分别与鸡痘病毒282E4株FPV 共转染鸡胚成纤维细胞, 经RT-PCR, IFA及Western杂交等方法筛选后成功获得携带有FMDV免疫原基因的两株重组鸡痘病毒株vUTA2P1和vUTAL3CP1. 应用2株重组鸡痘病毒株免疫小鼠, 经对免疫小鼠脾细胞中T细胞亚类计数、脾细胞CTL杀伤活性以及FMDV抗体的检测, 证明这2株重组鸡痘病毒可以诱导小鼠产生明显的细胞免疫和体液免疫反应. 以鸡痘病毒为载体进行FMD基因工程活载体疫苗的研究为FMD的最终防治探索一种新的候选疫苗.关键词FMDV重组鸡痘病毒免疫原性口蹄疫(FMD)是牛、猪、绵羊和野生偶蹄动物的一种急性、烈性传染病. 该病一旦爆发, 可给发病国家的进出口贸易及旅游业造成巨大经济损失. 其病原体为口蹄疫病毒(FMDV), 其基因组全长约为8500 bp, 编码产生衣壳蛋白前体P1-2A及其他非结构蛋白. P1-2A上含有FMDV主要抗原决定簇, 可以诱导机体免疫反应, 并在3C等蛋白酶的裂解下组装成成熟的病毒粒子[1]. 疫苗是控制本病的最有效措施, 但FMD 传染性极强, 在灭活疫苗的生产、使用过程中有诱发FMD的危险[2], 这促使其基因工程疫苗的研究得到迅速发展, 并逐渐成为FMD疫苗研究的热点[3~7]. 鸡痘病毒载体具有基因组容量大, 与其他病毒载体相比较, 不但安全, 且可诱导有效的细胞免疫和体液免疫. 鸡痘病毒用于外源基因的表达以及制备的重组鸡痘病毒已经显示出良好的应用前景[8]. 本研究选用鸡痘病毒作为载体, 利用FMDV衣壳蛋白前体P1-2A 基因和蛋白酶3C基因构建重组鸡痘病毒活载体疫苗, 并在小鼠体内进行了实验免疫研究, 为口蹄疫候选疫苗的制备、最终有效控制FMD奠定基础.1材料与方法(ⅰ) 材料. 碱性磷酸酶标记羊抗豚鼠IgG购自华美生物工程公司; 非放射性CTL杀伤活性检测试剂盒购自Promega公司; 液相阻断ELISA检测试剂盒购自兰州兽医研究所. CD3+, CD4+及CD8+标记单克隆抗体购自北京医科大学. 质粒pDisplay, pGEMT- P1-2A/pKS3C[9], 鸡痘病毒表达载体pUTA2-16Lac Z 及pUTA-2[10]均由本实验室构建. 毒株、实验动物及细胞FPV282E4株由中国兽药监察所提供; SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供; BALB/c小鼠(雌性, 体重16～18 g)购自北京医科大学; 猪用O型口蹄疫病毒灭活疫苗(FMDV/Vaccine, 内蒙古生物制品厂).(ⅱ) 重组鸡痘病毒载体的构建. 将质粒pKS3C 用Hin dⅢ和SalⅠ消化获得FMDV 3C基因片段, 再与质粒pUTA2-16Lac Z用同样双酶切的载体(切除Lac Z 片段)进行连接, 筛选阳性重组质粒pUTAL3C; 将质粒pGEMT-P1-2A用SpeⅠ酶切, 获得的P1-2A片段分别插入到鸡痘病毒重组表达载体pUTAL3CP1与pUTA2P1复合启动子下游和质粒pDisplay的CMV启动子下游的SmaⅠ位点, 构建FMDV的重组鸡痘病毒转移载体pUTAL3CP1, pUTA2P1和pDISPLAYP1.(ⅲ) 鸡痘病毒细胞内同源重组及筛选[11,12]. 将282E4株FPV与重组转移质粒共转染鸡胚成纤维细胞, 经过3次BrdU加压筛选后, 将收获的细胞再接种CEF, 在无BrdU的环境下培养, 挑选单个病毒蚀斑, 再进行3次蚀斑纯化、扩增, 进一步通过间接免疫荧光实验(IFA)、RT-PCR扩增及Western blotting 检测等方法筛选重组病毒.(ⅳ) IFA鉴定重组病毒. 取适量初步筛选并纯化的重组病毒, 接种于玻片上的融合单层CEF上, 待细胞出现明显病变后, 取出玻片用PBS洗涤, 再丙酮论文第49卷第6期 2004年3月固定细胞并将其与FMDV兔抗血清及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗反应. 反应后用PBS洗涤3次, 于荧光显微镜下观察.(ⅴ) 重组鸡痘病毒的RT-PCR鉴定. 提取经重组鸡痘病毒感染3d后的CEF细胞总RNA, 用特异性引物(上游引物: 5 -CATGAGTGGTGCCCCTCCG- ACCGACTG-3 ; 下游引物: 5 -CTTAGAGCCCAGG- GTTGGACTC-3 )进行目的基因的扩增, 电泳观察是否存在与预期基因片段大小一致的DNA条带.(ⅵ) Western blotting检测. 将纯化、扩增后的重组鸡痘病毒接种鸡胚成纤维细胞, 72 h后离心、收集并裂解细胞, 离心取上清进行SDS-PAGE电泳、转膜并以豚鼠抗FMDV多克隆抗体为第一抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗豚鼠IgG为第二抗体进行连续反应, 显色后观察是否存在与预期蛋白大小一致的蛋白反应条带.(ⅶ) 小鼠免疫指标检测. 将经增殖后的2株阳性重组病毒vUTA2P1和vUTAL3CP1接种的CEF细胞, 离心收集细胞并冻融3次后再测定毒价, 并以每只小鼠107 PFU重组毒病毒量免疫小鼠(每组12只). 连续3次肌肉注射免疫, 并以PBS液、282E4株FPV(107PFU)和FMDV灭活疫苗200 µL(O型FMDV 油乳剂灭活疫苗, 内蒙古生物制品厂)作为对照, 免疫方法同前. 最后取实验小鼠脾细胞与CD3+, CD4+及CD8+标记单抗反应, 用流式细胞检测仪检测. 评价T 细胞亚类数量; 将免疫小鼠脾细胞作为效应细胞, 质粒pDISPLAYP1转染并经G418加压筛选获得稳定表达P1-2A的P815(小鼠肥大细胞瘤细胞)细胞作为靶细胞, 通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测效应细胞的CTL杀伤活性. 采用液相阻断ELISA(LPBE)方法检测免疫小鼠血液中FMDV抗体的滴度, 具体操作参照试剂盒说明书稍加改进. 具体操作如下: ELISA板每孔用50 µL兔抗FMDV血清包被, 室温下湿盒内过夜; 另外取一块“U”型反应板, 将每1份50 µL被检血清进行两倍稀释, 取50 µL 加入到第1孔中后用稀释液进行被检血清的2倍连续稀释到第6孔, 最后滴度为1︰128, 向每孔内加入相应的50 µL的病毒抗原, 混合物于4℃过夜, 加入抗原液后使被检血清的起始稀释度上升到1︰8. 用PBS液将ELISA板洗涤5次, 再将“U”型反应板上血清/抗原混合液每孔各取50 µL 依次转移到兔抗病毒血清包被的ELISA板中, 置于旋转震荡器上孵育1 h后每孔滴加50 µL上述步骤中使用的相同病毒抗原的豚鼠抗血清, 置于旋转震荡器上37℃孵育. 1 h后每孔再加兔抗豚鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶结合物, 置于旋转震荡器上37℃孵育1 h, 洗板. 每孔再加50 µL含0.05% H2O2(30%, 质量体积比)的联苯二胺溶液进行显色. 用50 µL 1.25 mol/L硫酸溶液15 min终止反应. 然后在490 nm分光光度计下测定其光吸收值; 以不加血清只加50 µL PBS(含0. 05% Tween-20和酚红指示剂)稀释的抗原, 相应的牛标准抗血清、阴性牛血清作为对照. 抗体滴度以被检血清能达到与无被检血清的病毒对照孔光吸收平均值的50% 的最终稀释度来表示. 样品测定值滴度超过1︰40为阳性.(ⅷ) 统计学方法. 实验所得数据均采用学生氏t 检验进行处理, P < 0.05为差异显著, P < 0.01为极显著. 2结果2.1重组载体的构建经限制性内切酶消化及P1-2A特异性引物的PCR鉴定, 成功获得鸡痘病毒重组转移质粒pUTA2P1, pUTAL3CP1, 同时获得用于转染P815制备靶细胞的重组转移质粒pDisplayp1.2.2感染CEF的IFA检测从病毒噬斑中筛选出的2株重组鸡痘病毒感染细胞表现出明显强荧光, 阳性细胞主要为圆缩的病毒感染细胞, 其周围未病变的CEF细胞为阴性(图1).2.3 RT-PCR鉴定通过对两株病毒感染的细胞培养物的RT-PCR 扩增, 可以见到与目的蛋基因片段大小一致的目的DNA条带(2223 bp), 证明了目的基因已经整合进入重组病毒基因组, 并在CEF细胞中获得正确转录(图2).2.4 Western Blotting检测两重组病毒的细胞培养物在79 kD处均有一特异性的蛋白反应带, 与预期蛋白反应条带大小一致(图3).2.5实验免疫小鼠免疫指标的检测应用2个重组病毒株vUTA2P1和vUTAL3CP1分别免疫小鼠后, 其脾细胞中CD4+和CD8+细胞数量及脾细胞特异性CTL杀伤活性均明显高于对照组小鼠, 同时也高于FMDV灭活苗免疫组小鼠(图4和5), 表明携带有FMDV P1-2A基因、P1-2A基因和蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒可以刺激小鼠产生特异性细胞免疫反应.经LPBE方法检测免疫小鼠血中FMDV特异性抗体, 结果表明, 重组病毒免疫小鼠10 d后, 即出现第49卷第6期 2004年3月论文论文第49卷第6期 2004年3月苗研究的热点之一. 用于FMDV活载体疫苗研制的病毒载体主要有脊髓灰质炎病毒、痘苗病毒、牛鼻气管炎病毒、烟草花叶病毒、杆状病毒以及非复制性人5型腺病毒等, 构建的病毒重组体免疫小鼠、猪或牛后均可诱发机体产生一定的细胞免疫和体液免疫反应, 但免疫实验动物的保护率一直是难以解决的问题[3~7]. 近年来, 美国梅岛动物病研究所(Plum Island Animal Disease Center)研究人员将猪或牛的干扰素IFN-α及IFN-β基因重组进入腺病毒载体中, 使动物抗FMDV 抗体水平及相应的攻毒保护率得到大大的提高[13~15].本研究采用鸡痘病毒为载体, 克服了痘苗病毒具有的潜在的危险性. 已经证明, 携带有外源基因的重组鸡痘病毒可在多种动物体内正确、高效地表达外源基因, 并可诱导较强的细胞免疫和体液免疫水平, 是一种良好的制备基因工程疫苗用病毒载体. 本研究经筛选获得的2株FMDV重组活载体疫苗株vUTA2P1和vUTL3CP1, 免疫小鼠后均可刺激小鼠产生良好的细胞免疫水平, 于免疫后10 d即可诱导免疫小鼠产生特异的高水平抗FMDV抗体, 与常规疫苗无明显差异, 且在诱导细胞免疫的各项免疫指标方面也优于FMDV灭活疫苗免疫组. 值得注意的是, vUTAL3CP1同时携带有FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因. 蛋白酶3C具有裂解P1-2A的活性, 使其裂解产生VP0, VP3和VP1, 在病毒复制过程中进一步组装成病毒衣壳, 主要结构蛋白抗原暴露出来引起机体的免疫反应. 由于在真核细胞表达细胞蛋白数量较大且无特异性抗蛋白酶3C 的单抗, 因此通过SDS-PAGE很难观察到3C蛋白酶的表达. 免疫实验结果表明, 不管是否携带有蛋白酶3C基因, 其两种重组鸡痘病毒疫苗所诱导机体免疫反应无明显差别, 均能诱导产生特异性细胞免疫和体液免疫反应, 即重组鸡痘病毒表达的P1-2A是否被裂解, 它均具有同样的抗原特性, 这也与以前报道的结果相一致[7]. 但没有蛋白酶3C的裂解, 重组病毒表达出的P1-2A能否组装成FMDV完整空衣壳病毒粒子还有待于进一步探讨.本研究首次应用鸡痘病毒载体进行口蹄疫疫苗的重组活载体疫苗的研究, 小鼠实验免疫表明:应用FMDV衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因构建的重组鸡痘病毒可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应. 这为进一步探讨FMD重组鸡痘病毒活载体疫苗在猪等大动物体内的免疫实验提供了较好的理论材料, 也为最终防制FMD提供一种候选疫苗制备的新途径.致谢本工作为国家高技术研究发展计划资助项目(批准号: 2001AA213071).参考文献1 Jackson T, Stuart D I, Fry E. 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