高效液相色谱ppt参考课件
合集下载
7高效液相色谱法 ppt课件
1. 在食品分析中的应用
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
2021/2/20
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
2021/2/20
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
其结构如图所示：
2021/2/20
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2021/2/20
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
• 1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类 等；
• 2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等； • 3)食品污染物分析：霉菌毒素等。
2. 在环境分析中的应用
• 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
3. 在生命科学中的应用
• 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等 的分离和测定。
2021/2/20
(2) 梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例
调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
2021/2/20
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六 通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白 质、酶等
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以 凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂 糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
2021/2/20
五、高效液相色谱法的应用
其结构如图所示：
2021/2/20
(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱 柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2021/2/20
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1， 对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
✓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC • 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 • 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体
吸附的水→固定液
21
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
17
第三节 各类高效液相色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC）
18
一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）
➢ 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用
3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
7
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
8
续前
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
第一节 概述
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点
4
一、HPLC与经典LC区别
✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
A 2 dp
A dp
B 2 Dm 2 Dg
B tR ，B Dg
Dg
T
或Dg
T M
C Cm Cs Cg Cl Cl
Cl
df 2 Dl
T
DL
12
续前
2. HPLC：H A C u
B 2 Dm
Dm
T
柱温T 低，流动相 大 B相忽略
➢ 讨论：
1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
5
二、HPLC与GC差别
✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象
GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
u 1cm / s时，H u
u H ，n 柱效 ，但tR
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响 next
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
13
图示
back
14
续前
3）传质阻抗项及其影响
C Cm Csm Cs Cm Cs（m 忽略固定相传质阻抗 ） 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
8×108 理想
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
（2）高分子多孔小球：YSG
原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
20
续前
3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 ✓ 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -
4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
9
第二节 基本理论和条件选择
一、塔板理论——平衡理论 二、速率理论 ——Vander方程 三、HPLC法中分离条件的选择
10
一、塔板理论
H理 L / n理
H eff L / neff
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及
高聚物的样品不可检测
占有机物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，
不受样品挥发性和热稳定性的限制
分子量大、难气化、热稳定性差及高分子
和离子型样品均可检测
用途广泛，占有机物的80%
6
续前2．流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
n理
(tR
)2
5.54( tR W1 2
)2
16(tR W
)2
neff
16(
t
' R
)2
W
5.54(
t
' R
)2
W1 2
k
t
' R
t0
neff
n理
( 1
k
k
)
2
11
二、速率理论（与GC对比）
1. GC：H A B / u C u （填充柱）
或 H B / u C u （毛细管柱）
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异
tR
t0 (1
K
S Vm
)
S kK
Vm
➢ 分离前提：K不等或k不等
19
续前
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶
表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG
球形 YQG 堆积硅珠 YQG 3~4 μm
5~6μm 5×104 3~4μm 8×108
高效液相色谱法 HPLC
1
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
2
主要内容
一、概述 二、基本理论及条件选择 三、各类高效液相色谱法 四、影响分离的因素 五、高效液相色谱仪 六、超效液相色谱技术简介 七、HPLC定量分析方法学考察 八、HPLC应用
3
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
Cm
Csm
dp 2 Dm
C dp2 Dm
Dm
ห้องสมุดไป่ตู้
T
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
T Dm C ，但易产生气泡
T Dm ， ，柱阻
15
图示
16
三、HPLC法中分离条件的选 择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱
吸附的水→固定液
21
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min
3. 柱温的选择： 选室温250C左右
17
第三节 各类高效液相色谱法
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC）
18
一、液固吸附色谱法（LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）
➢ 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用
3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
7
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
8
续前
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
第一节 概述
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点
4
一、HPLC与经典LC区别
✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
A 2 dp
A dp
B 2 Dm 2 Dg
B tR ，B Dg
Dg
T
或Dg
T M
C Cm Cs Cg Cl Cl
Cl
df 2 Dl
T
DL
12
续前
2. HPLC：H A C u
B 2 Dm
Dm
T
柱温T 低，流动相 大 B相忽略
➢ 讨论：
1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
5
二、HPLC与GC差别
✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象
GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
u 1cm / s时，H u
u H ，n 柱效 ，但tR
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响 next
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
13
图示
back
14
续前
3）传质阻抗项及其影响
C Cm Csm Cs Cm Cs（m 忽略固定相传质阻抗 ） 注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
8×108 理想
原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物
（2）高分子多孔小球：YSG
原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
20
续前
3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 ✓ 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -
4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓
高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
9
第二节 基本理论和条件选择
一、塔板理论——平衡理论 二、速率理论 ——Vander方程 三、HPLC法中分离条件的选择
10
一、塔板理论
H理 L / n理
H eff L / neff
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及
高聚物的样品不可检测
占有机物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，
不受样品挥发性和热稳定性的限制
分子量大、难气化、热稳定性差及高分子
和离子型样品均可检测
用途广泛，占有机物的80%
6
续前2．流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
n理
(tR
)2
5.54( tR W1 2
)2
16(tR W
)2
neff
16(
t
' R
)2
W
5.54(
t
' R
)2
W1 2
k
t
' R
t0
neff
n理
( 1
k
k
)
2
11
二、速率理论（与GC对比）
1. GC：H A B / u C u （填充柱）
或 H B / u C u （毛细管柱）
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异
tR
t0 (1
K
S Vm
)
S kK
Vm
➢ 分离前提：K不等或k不等
19
续前
2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm）
（1）硅胶
表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG
球形 YQG 堆积硅珠 YQG 3~4 μm
5~6μm 5×104 3~4μm 8×108
高效液相色谱法 HPLC
1
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
2
主要内容
一、概述 二、基本理论及条件选择 三、各类高效液相色谱法 四、影响分离的因素 五、高效液相色谱仪 六、超效液相色谱技术简介 七、HPLC定量分析方法学考察 八、HPLC应用
3
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
Cm
Csm
dp 2 Dm
C dp2 Dm
Dm
ห้องสมุดไป่ตู้
T
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效
T Dm C ，但易产生气泡
T Dm ， ，柱阻
15
图示
16
三、HPLC法中分离条件的选 择
1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱