高效液相色谱课件
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高效液相色谱仪ppt课件
8
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
9
根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
11
图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
30
2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
9
根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
11
图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
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2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱分析ppt课件
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/7/7
2019/7/7
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/7/7
2019/7/7
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
2019/7/7
与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
2019/7/7
2019/7/7
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/7/7
2019/7/7
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
2019/7/7
与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散
——为填充的不规则因子
A2dp
dp——固定相颗粒粒径
ห้องสมุดไป่ตู้
基本原理
（2）B/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引 起的色谱谱带展宽
B = 2 r Dm
式中：r——弯曲因子，填充柱 r < 1 空心柱r = 1
Dm——组分在流动相中的扩散系数 由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此 在液相色谱中B可以忽略。
完成分离。 主要分离机理：分配、吸附
基本原理
S(mV)
➢色谱图(chromatogram)
tR
➢色谱峰
➢保留时间(tR)
tR′
➢死时间(t0)
➢相对保留时间(tR′)
h
➢峰面积(A) ➢峰高(h)
t0 A
➢峰宽(W)
T(min)
色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间 分布的图象。
色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号 产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到 柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既 从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为 止所经历的时间，称为此组分的保留时间， 用tR表示，常以分（min）为时间单位。 死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称 为死时间。
塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱
柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此 无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。 Van Deemter方程
1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高 柱效率的途径：
基本原理
H A BCu u
式中：u为流动相流动的线速度
R 1.5
两峰完全分开
基本原理
不对称度与拖尾因子
不对称度 ＝ B/A 拖尾因子 ＝ (B + A)/2A
基本原理
小结
色谱法研究的核心：
选择最适合的色谱体系和条件、在最 短的时间达到最佳的分离效果。
基本原理
1、塔板理论
色谱理论
目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。
基本原理
1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔 板数为n的色谱柱上分离的情况；
2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数 n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；
怎样提高色谱柱的理论塔板数n， 从而提高色谱柱的效率？
基本原理
2、速率理论
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
2.与气相色谱法比较
方法 项目
高效液相色谱法
进样方式 样品制成溶液
流动相
液体流动相可为离子型、极性、弱极性、非 极性溶液，可与被分析样品产生相互作用， 并能改善分离的选择性
基本原理
u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：
dH dA dBdCu0 u
dH B duu2 C0
基本原理
对速率方程的讨论
• 选用细颗粒填料可获高柱效 • 流动相流速低，有利于达到高柱效 • 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 • 温度的影响 • 液膜厚度的影响
HPLC的应用
1. 与经典液相色谱法的比较：
假设 （1）色谱柱存在多级塔板;
（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;
k p q
固定相重量 流动相重量
基本原理
理论塔板数N的计算
基本原理
相邻组分分离度的基本关系式：
分离度： R2(tR 2 tR)2tR '2 tR '1 W 1W 2 W 1W 2 或 R n2 2/11 k2' 4 2/1 1k2'
固定相
1. 分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离子 交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选 用的固定相种类繁多。
2. 色谱柱：固定相粒度小为5~10µm；填充柱
内径为3~6mm，柱长10~25cm，柱效103 ~104
起始 填充床
最后
A = 2ldp dp 粒径, l 填充因子
基本原理
色谱峰展宽 ——纵向扩散
B= 2rDm 扩散系数与温度成正比，与分子量平方根 成反比，与流动相粘度成反比。
基本原理
色谱峰展宽 ——传质阻力(吸附动力学)
基本原理
色谱峰展宽 ——柱外效应
柱外峰展宽
连接管内色谱峰展宽W lc 进样造成色谱峰展宽Ws 检测器产生的色谱峰展宽Wfs
项目
方 法 高效液相色谱法 经典液相色谱法
色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm
10 ~ 25 2 ~ 10
固定相粒度： 粒径/µm 筛孔/目
5 ~ 50 2500 ~ 300
色谱柱入口压力/MPa
2 ~ 20
色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 2103~ 5104
进样量/g
106 ~102
分析时间/h
0.05 ~ 1.0
高效液相色谱
（High Performance Liquid Chromatography）
基本原理
高效液相色谱法原理
当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组 份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。
基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力 存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而
W2 ＝ Wc2＋Ws2＋Wlc2＋Wfc2
基本原理
综上所述，速率方程为：
H 2d p 2 rD u m q ( 1 k k )2d D 2 fsu ( 1 k k )2D d m p 2u
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 2、空心柱是否能够用于色谱分离？ 3、如何获得色谱最佳流速？
基本原理
（3）Cu——传质阻力项 指组分在流动相和固定相之间传质的阻力
Cq(1kk)2 d D 2 fs (1kk)2
dp 2 Dm
固定相传质阻力 流动相传质阻力
q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度
基本原理
色谱峰展宽 ——涡流扩散（多通道效应）
基本原理
分
离
度
0
保留因子
色谱柱 塔板数
选择性
基本原理
保留因子 分离因子α
k = (tR – t0)/t0
= tR′/t0
流动相组成；
色谱柱；
温度
α= k2/k1
色谱柱长短； 流动相流量
基本原理
分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：
R < 1.0
两峰明显重叠
R = 1.0
两峰达97.7%分离
——为填充的不规则因子
A2dp
dp——固定相颗粒粒径
ห้องสมุดไป่ตู้
基本原理
（2）B/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引 起的色谱谱带展宽
B = 2 r Dm
式中：r——弯曲因子，填充柱 r < 1 空心柱r = 1
Dm——组分在流动相中的扩散系数 由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此 在液相色谱中B可以忽略。
完成分离。 主要分离机理：分配、吸附
基本原理
S(mV)
➢色谱图(chromatogram)
tR
➢色谱峰
➢保留时间(tR)
tR′
➢死时间(t0)
➢相对保留时间(tR′)
h
➢峰面积(A) ➢峰高(h)
t0 A
➢峰宽(W)
T(min)
色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间 分布的图象。
色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号 产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到 柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既 从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为 止所经历的时间，称为此组分的保留时间， 用tR表示，常以分（min）为时间单位。 死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称 为死时间。
塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱
柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此 无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。 Van Deemter方程
1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高 柱效率的途径：
基本原理
H A BCu u
式中：u为流动相流动的线速度
R 1.5
两峰完全分开
基本原理
不对称度与拖尾因子
不对称度 ＝ B/A 拖尾因子 ＝ (B + A)/2A
基本原理
小结
色谱法研究的核心：
选择最适合的色谱体系和条件、在最 短的时间达到最佳的分离效果。
基本原理
1、塔板理论
色谱理论
目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。
基本原理
1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔 板数为n的色谱柱上分离的情况；
2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数 n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；
怎样提高色谱柱的理论塔板数n， 从而提高色谱柱的效率？
基本原理
2、速率理论
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
2.与气相色谱法比较
方法 项目
高效液相色谱法
进样方式 样品制成溶液
流动相
液体流动相可为离子型、极性、弱极性、非 极性溶液，可与被分析样品产生相互作用， 并能改善分离的选择性
基本原理
u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：
dH dA dBdCu0 u
dH B duu2 C0
基本原理
对速率方程的讨论
• 选用细颗粒填料可获高柱效 • 流动相流速低，有利于达到高柱效 • 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 • 温度的影响 • 液膜厚度的影响
HPLC的应用
1. 与经典液相色谱法的比较：
假设 （1）色谱柱存在多级塔板;
（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;
k p q
固定相重量 流动相重量
基本原理
理论塔板数N的计算
基本原理
相邻组分分离度的基本关系式：
分离度： R2(tR 2 tR)2tR '2 tR '1 W 1W 2 W 1W 2 或 R n2 2/11 k2' 4 2/1 1k2'
固定相
1. 分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离子 交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选 用的固定相种类繁多。
2. 色谱柱：固定相粒度小为5~10µm；填充柱
内径为3~6mm，柱长10~25cm，柱效103 ~104
起始 填充床
最后
A = 2ldp dp 粒径, l 填充因子
基本原理
色谱峰展宽 ——纵向扩散
B= 2rDm 扩散系数与温度成正比，与分子量平方根 成反比，与流动相粘度成反比。
基本原理
色谱峰展宽 ——传质阻力(吸附动力学)
基本原理
色谱峰展宽 ——柱外效应
柱外峰展宽
连接管内色谱峰展宽W lc 进样造成色谱峰展宽Ws 检测器产生的色谱峰展宽Wfs
项目
方 法 高效液相色谱法 经典液相色谱法
色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm
10 ~ 25 2 ~ 10
固定相粒度： 粒径/µm 筛孔/目
5 ~ 50 2500 ~ 300
色谱柱入口压力/MPa
2 ~ 20
色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 2103~ 5104
进样量/g
106 ~102
分析时间/h
0.05 ~ 1.0
高效液相色谱
（High Performance Liquid Chromatography）
基本原理
高效液相色谱法原理
当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组 份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。
基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力 存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而
W2 ＝ Wc2＋Ws2＋Wlc2＋Wfc2
基本原理
综上所述，速率方程为：
H 2d p 2 rD u m q ( 1 k k )2d D 2 fsu ( 1 k k )2D d m p 2u
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 2、空心柱是否能够用于色谱分离？ 3、如何获得色谱最佳流速？
基本原理
（3）Cu——传质阻力项 指组分在流动相和固定相之间传质的阻力
Cq(1kk)2 d D 2 fs (1kk)2
dp 2 Dm
固定相传质阻力 流动相传质阻力
q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度
基本原理
色谱峰展宽 ——涡流扩散（多通道效应）
基本原理
分
离
度
0
保留因子
色谱柱 塔板数
选择性
基本原理
保留因子 分离因子α
k = (tR – t0)/t0
= tR′/t0
流动相组成；
色谱柱；
温度
α= k2/k1
色谱柱长短； 流动相流量
基本原理
分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：
R < 1.0
两峰明显重叠
R = 1.0
两峰达97.7%分离