高效液相色谱课件

项目
方 法 高效液相色谱法 经典液相色谱法
色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm
10 ~ 25 2 ~ 10
固定相粒度： 粒径/µm 筛孔/目
5 ~ 50 2500 ~ 300
色谱柱入口压力/MPa
2 ~ 20
色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 2103~ 5104
进样量/g
106 ~102
分析时间/h
0.05 ~ 1.0
W2 ＝ Wc2＋Ws2＋Wlc2＋Wfc2
基本原理
综上所述，速率方程为：
H 2d p 2 rD u m q ( 1 k k )2d D 2 fsu ( 1 k k )2D d m p 2u
涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质
问题： 1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 2、空心柱是否能够用于色谱分离？ 3、如何获得色谱最佳流速？
假设 （1）色谱柱存在多级塔板;
（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;
k p q
固定相重量 流动相重量
基本原理
理论塔板数N的计算
基本原理
相邻组分分离度的基本关系式：
分离度： R2(tR 2 tR)2tR '2 tR '1 W 1W 2 W 1W 2 或 R n2 2/11 k2' 4 2/1 1k2'
基本原理
分
离
度
0
保留因子
色谱柱 塔板数
选择性
基本原理
保留因子 分离因子α
k = (tR – t0)/t0
= tR′/t0
流动相组成；
色谱柱；
温度
α= k2/k1
色谱柱长短； 流动相流量
基本原理
分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：
R < 1.0
两峰明显重叠
R = 1.0
两峰达97.7%分离
（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散
——为填充的不规则因子
A2dp
dp——固定相颗粒粒径
基本原理
（2）B/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引 起的色谱谱带展宽
B = 2 r Dm
式中：r——弯曲因子，填充柱 r < 1 空心柱r = 1
Dm——组分在流动相中的扩散系数 由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此 在液相色谱中B可以忽略。
基本原理
（3）Cu——传质阻力项 指组分在流动相和固定相之间传质的阻力
Cq(1kk)2 d D 2 fs (1kk)2
dp 2 Dm
固定相传质阻力 流动相传质阻力
q 和 为与两相的构型和性质有关的常数 dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度
基本原理
色谱峰展宽 ——涡流扩散（多通道效应）
固定相
1. 分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离子 交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选 用的固定相种类繁多。
2. 色谱柱：固定相粒度小为5~10µm；填充柱
内径为3~6mm，柱长10~25cm，柱效103 ~104
高效液相色谱
（High Performance Liquid Chromatography）
基本原理
高效液相色谱法原理
当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组 份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。
基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力 存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而
基本原理
u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：
dH dA dBdCu0 u
dH B duu2 C0
基本原理
对速率方程的讨论
• 选用细颗粒填料可获高柱效 • 流动相流速低，有利于达到高柱效 • 选用黏度小的流动相有利于提高柱效 • 温度的影响 • 液膜厚度的影响
HPLC的应用
1. 与经典液相色谱法的比较：
R 1.5
两峰完全分开
基本原理
不对称度与拖尾因子
不对称度 ＝ B/A 拖尾因子 ＝ (B + A)/2A
基本原理
小结
色谱法研究的核心：
选择最适合的色谱体系和条件、在最 短的时间达到最佳的分离效果。
基本原理
1、塔板理论
色谱理论
目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。
完成分离。 主要分离机理：分配、吸附
基本原理
S(mV)Baidu Nhomakorabea
➢色谱图(chromatogram)
tR
➢色谱峰
➢保留时间(tR)
tR′
➢死时间(t0)
➢相对保留时间(tR′)
h
➢峰面积(A) ➢峰高(h)
t0 A
➢峰宽(W)
T(min)
色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间 分布的图象。
色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号 产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到 柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既 从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为 止所经历的时间，称为此组分的保留时间， 用tR表示，常以分（min）为时间单位。 死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称 为死时间。
塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱
柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此 无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。 Van Deemter方程
1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高 柱效率的途径：
基本原理
H A BCu u
式中：u为流动相流动的线速度
基本原理
1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔 板数为n的色谱柱上分离的情况；
2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数 n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；
怎样提高色谱柱的理论塔板数n， 从而提高色谱柱的效率？
基本原理
2、速率理论
起始 填充床
最后
A = 2ldp dp 粒径, l 填充因子
基本原理
色谱峰展宽 ——纵向扩散
B= 2rDm 扩散系数与温度成正比，与分子量平方根 成反比，与流动相粘度成反比。
基本原理
色谱峰展宽 ——传质阻力(吸附动力学)
基本原理
色谱峰展宽 ——柱外效应
柱外峰展宽
连接管内色谱峰展宽W lc 进样造成色谱峰展宽Ws 检测器产生的色谱峰展宽Wfs
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
2.与气相色谱法比较
方法 项目
高效液相色谱法
进样方式 样品制成溶液
流动相
液体流动相可为离子型、极性、弱极性、非 极性溶液，可与被分析样品产生相互作用， 并能改善分离的选择性