高效液相色谱法ppt课件
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《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维 修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。
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高压泵工作原理.swf
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2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。
当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流 动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送 出的信号记录下来，得到液相色谱图。
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液相色谱.swf
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.
1．高压输液系统
固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高 压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、 压力脉动阻力器等组成。
忽略固定相传质阻抗
H P L C ： H A C m u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻 .
第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进 样及数据处理等。
.
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，
来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最 佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的
程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变
化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的， 而不是借改变温度（温度程序）来达到。
.
梯度淋洗装置
或 H B/u Cu （毛细管柱）
A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
.
DL
T
2. H P L C ： H A C u
B2Dm
Dm
T
柱T温 低，流 大 动 B相忽略
.
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响
改善分离度增加了因素 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
.
操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
.
.
第一节 液相色谱柱效
.
速率理论（与GC对比）
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
u1cm /s时H ， u u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效
.
.
3）传质阻力项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
.
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50Mpa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高，40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重C与GC差别
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析20%的化 合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用 检测器（FID和TCD） 流动相为气体、无毒、易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
.
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光电二极管阵列检测器
.
（2）总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属 于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。
.
5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收 集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压 液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相 应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目 的。
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
第十五章 高效液相色谱法
(High performance liquid chromatography, HPLC)
以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱 法（Liquid Chromatography，LC）。液相色谱 主要包括柱色谱和平板色谱（纸色谱和薄层色谱） 等。
.
高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的 固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种 液相色谱法。
（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在 1~2%左右；
（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10 mL min-1之间，制备型仪器能达到100 mL min-1；
.
（3）输出压力高、密封性好，要求最高压 力300~500 kg/cm2；
（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水 和缓冲溶液；
柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引 起往前展宽的主要因素。
.
.
3、分离系统——色谱柱
色谱柱包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑 的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金 属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝 胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可 达25 mm 以上。
几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器
流动相有毒、费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
.
流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
.
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒 度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装 柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下， 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗 后，即可备用。
.
4．检测系统
（1）溶质性检测器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属 于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。
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高压泵工作原理.swf
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2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。
当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流 动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送 出的信号记录下来，得到液相色谱图。
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液相色谱.swf
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1．高压输液系统
固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高 压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、 压力脉动阻力器等组成。
忽略固定相传质阻抗
H P L C ： H A C m u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻 .
第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进 样及数据处理等。
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梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，
来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最 佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的
程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变
化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的， 而不是借改变温度（温度程序）来达到。
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梯度淋洗装置
或 H B/u Cu （毛细管柱）
A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
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DL
T
2. H P L C ： H A C u
B2Dm
Dm
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柱T温 低，流 大 动 B相忽略
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➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响
改善分离度增加了因素 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
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操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
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第一节 液相色谱柱效
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速率理论（与GC对比）
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
u1cm /s时H ， u u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效
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3）传质阻力项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
.
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50Mpa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高，40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重C与GC差别
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析20%的化 合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用 检测器（FID和TCD） 流动相为气体、无毒、易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
.
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光电二极管阵列检测器
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（2）总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属 于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。
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5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收 集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压 液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相 应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目 的。
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
第十五章 高效液相色谱法
(High performance liquid chromatography, HPLC)
以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱 法（Liquid Chromatography，LC）。液相色谱 主要包括柱色谱和平板色谱（纸色谱和薄层色谱） 等。
.
高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的 固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种 液相色谱法。
（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在 1~2%左右；
（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10 mL min-1之间，制备型仪器能达到100 mL min-1；
.
（3）输出压力高、密封性好，要求最高压 力300~500 kg/cm2；
（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水 和缓冲溶液；
柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引 起往前展宽的主要因素。
.
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3、分离系统——色谱柱
色谱柱包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑 的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金 属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝 胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可 达25 mm 以上。
几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器
流动相有毒、费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
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流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
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柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒 度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装 柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下， 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗 后，即可备用。
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4．检测系统
（1）溶质性检测器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属 于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。