蛋白质高效液相色谱技术精品课件

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Thank you
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9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定 。20.9.2220.9.22Tuesday, September 22, 2020
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10、低头要有勇气，抬头要有低气。09:48:5509:48:5509:489/22/2020 9:48:55 AM
调整PH
根据所分离蛋白质及 色谱柱决定
流动相脱气
目前实验室主要用的 是超声15min左右
滤膜过滤
溶剂使用前都必须经
0.45μm滤膜过滤，以除去
杂质微粒。分清有机相滤
膜和水相滤膜，对于混合
流动相，在混合前过滤
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蛋白样品 的性质
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HPLC与其他色谱光谱技术的联用
HPLC
MS MS
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泵柱 塞 往 复
液缸容积小，可至0.1ml，因此易于 清洗更换流动相，特别适合再循环和 梯度洗脱
流量不受柱阻影响
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服
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分离系统
三 分离系统
*色谱柱
连接管
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恒温器
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色谱柱
• 柱效高 • 选择性好 • 分析速度快
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进入色谱柱样品的处理
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柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就 会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
• ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
• ②应逐渐改变溶剂的组成 。
• ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
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柱的使用和维护注意事项
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常用的HPLC仪
• Waters公司 • Agilent公司 • 岛津公司等
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一 进进样样方系式 统
隔膜进样 停流进样 *阀进样 自动进样
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六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆 形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国 Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大
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17、一个人即使已登上顶峰，也仍要 自强不 息。上 午9时48分55秒 上午9时48分09:48:5520.9.22
谢谢大家
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25.5%
进样量 20μL 柱温 25 ℃
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现状与展望
高效液相色谱目 前多用于蛋白质 的定量分析，对 于大样品的分离 纯化成本较高且 费时，有待进一 步优化其条件或 找到适于分离纯 化蛋白质的方法。
相信随着新的色 谱柱和多种手段 的联用，高效液 相色谱能够在包 括蛋白质在内的 大分子物质的研 究领域里发挥更 大的作用
HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
上
分
样
析
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进样方式
部分装液法
完全装液法
进样量应不大于定量 环体积的50%（最多 75％），并要求每次 进样体积准确、相同 。 缺点是易产生由进样
引起的峰展宽
进样量应不小于定量 环体积的5~10倍（最 少3倍），这样才能
完全置换定量环内的
流动相，消除管壁效
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11、人总是珍惜为得到。20.9.2209:48: 5509:4 8Sep-2 022-Se p-20
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12、人乱于心，不宽余请。09:48:5509:48:5509:48Tuesday, September 22, 2020
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13、生气是拿别人做错的事来惩罚自 己。20.9.2220.9.2209:48:5509:48:55September 22, 2020
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来自百度文库
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数据处理和计算机控制系统
采集 处理 分析 数据
控制 仪器
色谱 系统 优化
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准 确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在 ±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
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流动相的要求
粘度小
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入
它是在经典液相层析法基础上，
引进了气相层析的理论具有气
相层析的全部优点。
应用
高灵
范围广
敏度
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根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
1 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 2 高效离子交换色谱（HPIEC） 3 高效亲和色谱（HPAFC）
4 反向高效液相色谱（RP-HPLC）
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高效液相色谱仪
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14、抱最大的希望，作最大的努力。2020年9月22日 星期二 上午9时48分55秒09:48:5520.9.22
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15、一个人炫耀什么，说明他内心缺 少什么 。。2020年9月 上午9时48分20.9.2209:48September 22, 2020
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16、业余生活要有意义，不要越轨。2020年9月22日 星期二 9时48分55秒09:48:5522 September 2020
一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用
沸点的低固是体甲醇和乙腈与。色一谱般系情况下甲溶醇-剂水的已经 残留能 但物够推少满荐足乙多腈种-水样统做品相初的适始分应实离验，，粘与度甲小醇纯，比度价，格乙低。
腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185205nm处检测的要求。
与检测器 相适应
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流动相的准备
高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
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1 高效液相色谱技术特点概述 2 HPLC系统各组分介绍； 3 流动相的要求及准备过程 4 HPLC色谱技术与其他技术联用
5 HPLC 应用举例
66 现5状与展望
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高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来
的一项新颖快速的分离技术。
CE CE
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UF
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高效液相色谱—质谱
• 蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重 要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的 自动分离检测。
高效液相色谱—毛细管电泳
当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各 自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术 特别适合细胞或组织中蛋白质的分离
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反相高效液相色谱法对 血清中胰岛素的测定
应，确保进样的准确 度及重复性
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高压输 液泵
二 输液系统
输液系统
在线脱 气装置
梯度仪
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高压输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作 用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结 果的可靠性 。
流量稳定 流量范围宽 输出压力高 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀
• ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避 免固定相被破坏。
• ⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱 柱之间连接一保护柱。
• ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内 的杂质。
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四 检测系统
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噪音低
灵敏度高
要求
重复 性好
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适用范 围广
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UV 检测器
色谱柱 流动相
梯度 洗脱
其他
C5 柱(100
mm*4.6mm 5μm，Ph-
enomenex 公司，美国
A 相: 10mmol/L Tris缓冲液 (pH 8.5) ;
B相:乙腈; 流速:
1mL/min
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B相体积分数 变化为:0～15 min, 15%～
25.5% ;
。 15～21 min,