高效液相色谱仪 PPT课件

在使用紫外检测器时，检测 波长与所用溶剂的截止波长 接近（或低于截止波长）时 ，容易产生噪音干扰，从而 影响检测结果。
所以在使用紫外检测器时， 检测波长应至少比所用溶剂 的截止波长大20nm以上。
b. 示差折光检测器 (RID)
原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来 测量试样浓度的检测器。
特点：通用性检测器； 对温度变化比较敏感，要保持在±0.001℃ （需配柱温箱使用） ； 灵敏度低(10-6g)； 不能用于梯度洗脱。
缺点：只适合于能产生荧光的物质的检测。
通过荧光衍生化可以使本来没有荧光的化合物转变 成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围。
d. 蒸发光散射检测器 (evaporative light-scatting detector, ELSD)
工作原理:通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。 色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气(氮气)喷成 雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶 质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检 测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大 小与数量。
按测量性质： 通用型检测器（如示差折光、蒸发光散射检测器） 专属型检测器（如紫外、荧光检测器）
按检测方式： 浓度型检测器 质量型检测器
着重介绍四种检测器：紫外检测器（光电二极管阵列检测器）、 示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器
a. 紫外检测器(UVD)： 应用最广泛的选择性检测器。
双波长紫外检测器 2487
气动放大泵（恒压泵） 往复泵（恒流泵）是目前液相色谱使用最普遍的一种 高 压泵。其中又分单头往复泵和双头往复泵。 往复泵的优点是泵头内腔体积小，容易洗净，故更换 溶剂十分方便，尤其适合做色谱条件试验时使用。
气动放大泵
往复柱塞泵
(2) 进样装置
手动进样阀通常使用耐高压的六通阀 (美国Rheodyne 公司专利技术)， 其结构如图所示：
特点：高压、高效、高速
分离对象：适用高沸点、热不稳定有机及生化试
样分离分析 （与GC区分）
三、流程及主要部件
1. 流程
2. 主要部件
(1) 高压输液泵
单元泵
双元泵
高压泵作用：输送流动相。 也即是贮液瓶中的有机溶剂或缓冲溶液靠高压泵送入色 谱柱。由于色谱柱的阻力很大，高压泵必须克服阻力以 恒定流速输送流动相，这是保证色谱仪精确度的前提。
检
塞色谱柱筛板引起柱压升高。保护柱除了可以过滤颗粒物外， 测
因为带1厘米长的填料，强保留物质就先留在保护柱的柱芯填
器
料里面，这样可以避免色谱柱被强保留物质污染。
(4) 液相色谱检测器
分类
按检测原理： 光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射） 热学检测器(如吸附热） 电化学学检测器（如库伦、安培） 电学检测器（电导、介电常数）
常用的压力范围：150～350×105 Pa 欧美等国家习惯使用psi作单位 PSI英文全称为Pounds per square inch。 定义为英镑/平方英寸， 它们之间的换算关系为： 1bar≈14.5psi =105Pa ， 145psi = 1Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar
2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、
甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂， 使保留时间缩短。
常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯> 四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
工作原理：基于朗伯-比尔定律。 即用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变 化来测定样品浓度的检测器。 它具有波长固定，波长可变和光电二极管阵列三种类型。
特点：选择性检测器， 灵敏度较高（10-9g）， 噪音低。 线性范围宽， 对流速和温度波动不灵敏， 适用于梯度洗脱。
光电二极管检测器（PDA）
样品环(Loop)
规格：有10µL、20µL、50µL等不同容积， 可以根据需要 选配。 作用：用来贮液，也用来测量样品溶液的体积。 将样品环装满后进样，进样量即为样品环的容积，此种进 样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。 用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操 作方式。
自动进样器
高效液相色谱
2010/8/21
一、高效液相色谱仪
Agilent 1100
Waters 2487
二、高效液相色谱法的特点
借助气相色谱 的理论演变
经典的柱色谱
高效液相色谱的模块
20世纪70年代后发展迅速，它在技术上采用高压泵，高 效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析 速度快，分离效率高和操作自动化。
1. 流动相特性
• 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组 成改变，极性改变，可显著改变各组分分离状况。
• 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小 于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
• 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色 谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
主要是由于修饰到硅胶上的硅烷化 试剂不同。 C8是修饰的带8个碳原子的硅烷， C18是修饰的带18个碳原子的硅烷。
C18较C8极性小，C18更适合分析中等到小极性的化合物， C8更适合中等偏大极性 化合物。
C18柱（C8柱）性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
适用范围：适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于 检测糖类，高级脂肪酸，磷脂， 维生素，氨基酸，甘油 三酯及甾体等。
特点：通用型检测器，对各物质有几乎相同的响应。 消除溶剂的干扰，不受温度变化影响， 灵敏度比较低（尤其对有紫外吸收的组分） 流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。
四、液相色谱的流动相
• 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
• 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法 正常进行。
• 在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相 中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量 氧与样品发生作用。
• 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏 色谱柱和使检测器噪声增加。
5. 流动相过滤
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、 仪器起到作用，消除由于污染对分析结果的影响。
• 对色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小， 溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
规格：常规分析柱(常量柱) 内径2～5mm(常用4.6mm， 3.9mm)，柱长10～30cm (15cm，25cm居多）
制备柱 （21.2mm、30mm、50mm） 半制备柱（〉5mm，7.8mm、9.8mm、10mm）
C18柱（C8柱）
H 3 C
H 3 C H 3 C H 3 C
预柱和保护柱
从泵来的流动相
预柱
进样口Байду номын сангаас
保护柱
预柱是针对流动相来保护色谱柱
保护柱是针对样品来保护色谱柱
分 析
柱
precolumn——预柱，guard column——保护柱 安装位置不同：预柱是泵后进样口前，途经流动相；保护柱
是进样口后分析柱前，途经样品和流动相。
作用不同：预柱则只能起到过滤颗粒物作用，防止颗粒物堵
c. 荧光检测器 (FLD)
原理: 利用某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光) 的性质进行检测。
许多药物和生命活性物质(多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等)具有天 然荧光，能直接检测。
特点:
选择性检测器， 灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级， 可达到 10-12g； 选择性好，对流量和温度敏感性低。
4. 选择流动相时应注意的几个问题
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间交换而达到分离 的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
流动相对样品具有一定的溶解能力， 保证样品组分不会沉淀在柱中 ( 或长时间保留在柱中 ) 。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 ( 特殊情况除外，如配位色谱等 ) 流动相的黏度要尽量小，以便降低柱压，延长色谱柱 使用的寿命 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。 如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。
缺点：只能检测有紫外吸收的物质。 而且对流动相也有一定的限制， 即流动相的截止波长应小于检测波长。
截止波长
溶剂 乙腈
水 环己烷 己烷 甲醇 乙醇 乙醚 二氯甲烷 氯仿 四氯化碳 四氢呋喃 甲苯