高效液相色谱法PPT
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外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一 定的比例抽入高压泵 中混合。
36
第三节 分配色谱 （Partition Chromatography）
根据分离机理的不同，高效液相色谱法主要可 分为分配色谱、液固吸附色谱、离子交换和离子 色谱、空间排阻色谱等。其中，最常用的是分配 色谱法。一般将其分为液液色谱和键合相色谱.
34
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，
来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最 佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的
程序升温，所不同的是，在梯度洗wenku.baidu.com中溶质k值的变
化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的， 而不是借改变温度（温度程序）来达到。
35
梯度淋洗装置
第十五章 高效液相色谱法
(High performance liquid chromatography, HPLC)
以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱 法（Liquid Chromatography，LC）。液相色谱 主要包括柱色谱和平板色谱（纸色谱和薄层色谱） 等。
1
高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的 固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种 液相色谱法。
（3）离子交换基团：如作为阴离子交换 基团的胺基、季铵盐；作为阳离子交换基 团的磺酸等。
42
43
2、硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定 相
+ Si OH CliS R3
(RO3)SiR
Si O Si3R+ HCl
具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。
能在70℃以下，pH=2～8范围内正常工作，应用较
48
49
反相色谱中，溶质的分离以溶质的疏水结构的差 异为基础，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留 值越大。引入取代基增强溶质的疏水特性，能提 高保留值，并与取代基的数目有关。
如果分子中增加极性基团，会使保留减小。根据 溶质分子中非极性骨架的差别，或官能团的性质、 数目、位置的不同，能够预测溶质得洗脱顺序。
（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维 修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。
22
高压泵工作原理.swf
23
2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。
2
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50Mpa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高，40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
3
HPLC与GC差别
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析20%的 化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用 检测器（FID和TCD） 流动相为气体、无毒、易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。
40
1、键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体几乎都用硅胶。利用 硅胶表面的硅醇基(Si—OH)与有机分子之间成键, 即可得到各种性能的固定相。 （1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18） 和苯基等；
41
（2）极性基团：如氨丙基、氰乙基、醚 和醇等；
当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流 动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送 出的信号记录下来，得到液相色谱图。
14
15
液相色谱.swf
16
17
18
19
20
1．高压输液系统
固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高 压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、 压力脉动阻力器等组成。
（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在 1~2%左右；
（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10 mL min-1之间，制备型仪器能达到100 mL min-1；
21
（3）输出压力高、密封性好，要求最高压 力300~500 kg/cm2；
（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水 和缓冲溶液；
通常根据所起的作用，所采用的溶剂可分成洗脱 剂及调节剂两种。洗脱剂决定基本的色谱分离情况， 而调节剂则起调节保留时间长短，并改善样品中某 些分离不理想组分的分离状况。
54
在反相色谱柱上，增加洗脱液强
度对8种化合物分离的影响。在 （a）中流动相包含90%的乙腈和 10%的缓冲溶液，因为乙腈具有 很高的洗脱强度，所有的化合物都
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
T
9
2. H P L C ： H A C u
B2D m
Dm
T
柱T温 低，流 大 动 B相忽略
50
例如，在苯酚分子上引入不同的官能团，引入甲 基则保留值增加，引入一个乙基相当于引入两个甲 基的影响，引入一个丙基相当于引入三个甲基的影 响；
在苯酚分子中引入羟基时则保留值降低，并且对 苯二酚要比邻苯二酚或间苯二酚较早洗脱出来；引 入一个硝基时保留值增大，然而引入两个或三个硝 基时，由于苦味酸和2，4—二硝基酚易溶于水，保 留值明显减小。
10
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响
u1cm /s时H ， u u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效
11
12
3）传质阻力项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器
流动相有毒、费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
4
流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
色谱分离过程中，溶质在流动相和固定相之间的 分配系数决定于溶质与流动相和固定相的相互作用。 这种作用不仅决定于参与作用分子的极性，而且决 定于不同类型分子间的作用力，即范德华力和氢键 力。
53
在选用溶剂时，为了获得合适极性的溶剂，常采 用二元或多元混合溶剂系统作为流动相，改善色谱 系统的选择性，获得所需要的溶剂强度和溶解度。
很快从色谱柱中洗脱出来，由于色
谱峰相互重叠，只观察到三个色谱
峰；当降低洗脱强度，使乙腈的浓 度降为80%，分离效果好一些， 可以观察到五个色谱峰；当乙腈的 浓度降为60%，可以观察到六个 色谱峰；当乙腈的浓度降为40% 时，可以很清楚地观察到八个色谱 峰，除了2和3两种物质，其它的 化合物都被很好地分离了；继续降 低乙腈的浓度（30%， 35%）， 所有的化合物都得到很好地分离， 但分析时间被大大延长，检测灵敏55
柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引 起往前展宽的主要因素。
24
25
3、分离系统——色谱柱
色谱柱包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑 的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金 属管用得较多。 一 般 色 谱 柱 长 5 ～ 30cm ， 内 径 为 4 ～ 5mm ， 凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大， 可达25 mm 以上。
46
在反相色谱中，通常以水为流动相的主体， 再加入不同配比的有机溶剂作调节剂。
常用的流动相是甲醇/水、乙腈/水、四氢 呋喃/水，粘度小，没有紫外吸收，而且能与 水或缓冲溶液混合。
47
关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶 剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合 相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子 毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极 性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合 物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面 上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中； 而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。 显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保 留行为。
51
烷基键合相的作用在于提供非极性的表面，键 合到表面上的碳的数量决定样品的保留值。烷基 配合基的疏水特性随着碳链的长度而增加，溶质 的保留值也将随着烷基配合基碳链长度的增加而 增加。
52
溶剂强度是描述溶剂色谱性能的主要指标，是溶 剂对样品的洗脱能力，它决定于溶剂与溶质之间的 分子作用力。溶剂与样品作用力强，则洗脱能力强， 组分k值小；反之组分k值高，保留时间长。
28
29
30
31
光电二极管阵列检测器
32
（2）总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属 于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。
33
5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收 集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压 液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相 应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目 的。
37
在液液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一 个液相则涂在惰性担体上作为固定相。两者之间互 不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相后， 在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中， 由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度 存在差异，因而溶质在两相间进行分配，很快达到 分配平衡。这种分配平衡的总结果导致各组分的差 速迁移，从而实现分离。
38
由于固定液在流动相中有微量溶解，固定液 会不断流失而导致保留行为发生变化，柱效和 分离选择性变坏。因此，化学键合固定相逐渐 代替涂渍固定相。
39
一、化学键合相色谱法（CBPC）
采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合 相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非 常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，
广泛。
44
3 、 正 相 色 谱 （ Normal Phase Liquid Chromatography）
流动相的极性小于固定相的极性。常用于分离极 性较强的化合物，组分与极性固定相的作用力主要 是静电力，溶剂极性越强，洗脱能力也越强；溶剂 极性越弱，洗脱能力也越弱。
分离顺序是极性较低的组分保留值小，先流出色 谱柱。
26
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒 度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装 柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下， 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗 后，即可备用。
27
4．检测系统
（1）溶质性检测器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属 于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。
忽略固定相传质阻抗
H P L C ： H A C m u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
13
第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进 样及数据处理等。
常用饱和烃作流动相，加入适量极性溶剂以调节 溶剂的强度，如甲醇、异丙醇等。
45
4、反相键合相色谱法
（Reverse Phase Liquid Chromatography）
流动相的极性大于固定相的极性。常用于分离极 性较弱的化合物，由于固定相是非极性的，溶剂的 强度随溶剂极性的降低而增加。
分离顺序是极性较强的组分保留值小，先流出色 谱柱。在洗脱序列中，水的极性最大，故水是洗脱 强度最弱的溶剂。若增加水中的有机成分，则溶剂 的洗脱强度增加；相反，若在水中加入无机盐，则 增加了溶质的保留值。
性、改善分离度增加了因素 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
5
操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
6
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第一节 液相色谱柱效
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速率理论（与GC对比）
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一 定的比例抽入高压泵 中混合。
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第三节 分配色谱 （Partition Chromatography）
根据分离机理的不同，高效液相色谱法主要可 分为分配色谱、液固吸附色谱、离子交换和离子 色谱、空间排阻色谱等。其中，最常用的是分配 色谱法。一般将其分为液液色谱和键合相色谱.
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梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，
来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最 佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的
程序升温，所不同的是，在梯度洗wenku.baidu.com中溶质k值的变
化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的， 而不是借改变温度（温度程序）来达到。
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梯度淋洗装置
第十五章 高效液相色谱法
(High performance liquid chromatography, HPLC)
以液体为流动相的色谱分析方法称为液相色谱 法（Liquid Chromatography，LC）。液相色谱 主要包括柱色谱和平板色谱（纸色谱和薄层色谱） 等。
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高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的 固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种 液相色谱法。
（3）离子交换基团：如作为阴离子交换 基团的胺基、季铵盐；作为阳离子交换基 团的磺酸等。
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2、硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定 相
+ Si OH CliS R3
(RO3)SiR
Si O Si3R+ HCl
具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。
能在70℃以下，pH=2～8范围内正常工作，应用较
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反相色谱中，溶质的分离以溶质的疏水结构的差 异为基础，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留 值越大。引入取代基增强溶质的疏水特性，能提 高保留值，并与取代基的数目有关。
如果分子中增加极性基团，会使保留减小。根据 溶质分子中非极性骨架的差别，或官能团的性质、 数目、位置的不同，能够预测溶质得洗脱顺序。
（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维 修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。
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高压泵工作原理.swf
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2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。
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HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50Mpa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高，40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
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HPLC与GC差别
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析20%的 化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用 检测器（FID和TCD） 流动相为气体、无毒、易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。
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1、键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体几乎都用硅胶。利用 硅胶表面的硅醇基(Si—OH)与有机分子之间成键, 即可得到各种性能的固定相。 （1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18） 和苯基等；
41
（2）极性基团：如氨丙基、氰乙基、醚 和醇等；
当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流 动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送 出的信号记录下来，得到液相色谱图。
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液相色谱.swf
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1．高压输液系统
固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高 压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、 压力脉动阻力器等组成。
（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在 1~2%左右；
（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10 mL min-1之间，制备型仪器能达到100 mL min-1；
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（3）输出压力高、密封性好，要求最高压 力300~500 kg/cm2；
（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水 和缓冲溶液；
通常根据所起的作用，所采用的溶剂可分成洗脱 剂及调节剂两种。洗脱剂决定基本的色谱分离情况， 而调节剂则起调节保留时间长短，并改善样品中某 些分离不理想组分的分离状况。
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在反相色谱柱上，增加洗脱液强
度对8种化合物分离的影响。在 （a）中流动相包含90%的乙腈和 10%的缓冲溶液，因为乙腈具有 很高的洗脱强度，所有的化合物都
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
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2. H P L C ： H A C u
B2D m
Dm
T
柱T温 低，流 大 动 B相忽略
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例如，在苯酚分子上引入不同的官能团，引入甲 基则保留值增加，引入一个乙基相当于引入两个甲 基的影响，引入一个丙基相当于引入三个甲基的影 响；
在苯酚分子中引入羟基时则保留值降低，并且对 苯二酚要比邻苯二酚或间苯二酚较早洗脱出来；引 入一个硝基时保留值增大，然而引入两个或三个硝 基时，由于苦味酸和2，4—二硝基酚易溶于水，保 留值明显减小。
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➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响
u1cm /s时H ， u u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效
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3）传质阻力项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器
流动相有毒、费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
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流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
色谱分离过程中，溶质在流动相和固定相之间的 分配系数决定于溶质与流动相和固定相的相互作用。 这种作用不仅决定于参与作用分子的极性，而且决 定于不同类型分子间的作用力，即范德华力和氢键 力。
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在选用溶剂时，为了获得合适极性的溶剂，常采 用二元或多元混合溶剂系统作为流动相，改善色谱 系统的选择性，获得所需要的溶剂强度和溶解度。
很快从色谱柱中洗脱出来，由于色
谱峰相互重叠，只观察到三个色谱
峰；当降低洗脱强度，使乙腈的浓 度降为80%，分离效果好一些， 可以观察到五个色谱峰；当乙腈的 浓度降为60%，可以观察到六个 色谱峰；当乙腈的浓度降为40% 时，可以很清楚地观察到八个色谱 峰，除了2和3两种物质，其它的 化合物都被很好地分离了；继续降 低乙腈的浓度（30%， 35%）， 所有的化合物都得到很好地分离， 但分析时间被大大延长，检测灵敏55
柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引 起往前展宽的主要因素。
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3、分离系统——色谱柱
色谱柱包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑 的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金 属管用得较多。 一 般 色 谱 柱 长 5 ～ 30cm ， 内 径 为 4 ～ 5mm ， 凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大， 可达25 mm 以上。
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在反相色谱中，通常以水为流动相的主体， 再加入不同配比的有机溶剂作调节剂。
常用的流动相是甲醇/水、乙腈/水、四氢 呋喃/水，粘度小，没有紫外吸收，而且能与 水或缓冲溶液混合。
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关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶 剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合 相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子 毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极 性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合 物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面 上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中； 而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。 显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保 留行为。
51
烷基键合相的作用在于提供非极性的表面，键 合到表面上的碳的数量决定样品的保留值。烷基 配合基的疏水特性随着碳链的长度而增加，溶质 的保留值也将随着烷基配合基碳链长度的增加而 增加。
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溶剂强度是描述溶剂色谱性能的主要指标，是溶 剂对样品的洗脱能力，它决定于溶剂与溶质之间的 分子作用力。溶剂与样品作用力强，则洗脱能力强， 组分k值小；反之组分k值高，保留时间长。
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光电二极管阵列检测器
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（2）总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属 于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。
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5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收 集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压 液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相 应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目 的。
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在液液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一 个液相则涂在惰性担体上作为固定相。两者之间互 不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相后， 在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中， 由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度 存在差异，因而溶质在两相间进行分配，很快达到 分配平衡。这种分配平衡的总结果导致各组分的差 速迁移，从而实现分离。
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由于固定液在流动相中有微量溶解，固定液 会不断流失而导致保留行为发生变化，柱效和 分离选择性变坏。因此，化学键合固定相逐渐 代替涂渍固定相。
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一、化学键合相色谱法（CBPC）
采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合 相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非 常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，
广泛。
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3 、 正 相 色 谱 （ Normal Phase Liquid Chromatography）
流动相的极性小于固定相的极性。常用于分离极 性较强的化合物，组分与极性固定相的作用力主要 是静电力，溶剂极性越强，洗脱能力也越强；溶剂 极性越弱，洗脱能力也越弱。
分离顺序是极性较低的组分保留值小，先流出色 谱柱。
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柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒 度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装 柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下， 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗 后，即可备用。
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4．检测系统
（1）溶质性检测器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属 于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。
忽略固定相传质阻抗
H P L C ： H A C m u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
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Dm
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d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进 样及数据处理等。
常用饱和烃作流动相，加入适量极性溶剂以调节 溶剂的强度，如甲醇、异丙醇等。
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4、反相键合相色谱法
（Reverse Phase Liquid Chromatography）
流动相的极性大于固定相的极性。常用于分离极 性较弱的化合物，由于固定相是非极性的，溶剂的 强度随溶剂极性的降低而增加。
分离顺序是极性较强的组分保留值小，先流出色 谱柱。在洗脱序列中，水的极性最大，故水是洗脱 强度最弱的溶剂。若增加水中的有机成分，则溶剂 的洗脱强度增加；相反，若在水中加入无机盐，则 增加了溶质的保留值。
性、改善分离度增加了因素 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
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操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
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第一节 液相色谱柱效
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速率理论（与GC对比）