高效液相色谱法PPT

柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引 起往前展宽的主要因素。
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3、分离系统——色谱柱
色谱柱包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑 的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金 属管用得较多。 一 般 色 谱 柱 长 5 ～ 30cm ， 内 径 为 4 ～ 5mm ， 凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大， 可达25 mm 以上。
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HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50Mpa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高，40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
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HPLC与GC差别
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析20%的 化合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用 检测器（FID和TCD） 流动相为气体、无毒、易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维 修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。
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高压泵工作原理.swf
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2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。
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在反相色谱中，通常以水为流动相的主体， 再加入不同配比的有机溶剂作调节剂。
常用的流动相是甲醇/水、乙腈/水、四氢 呋喃/水，粘度小，没有紫外吸收，而且能与 水或缓冲溶液混合。
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关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶 剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合 相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子 毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极 性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合 物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面 上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中； 而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相 的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。 显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保 留行为。
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光电二极管阵列检测器
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（2）总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属 于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。
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5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收 集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压 液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相 应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目 的。
（3）离子交换基团：如作为阴离子交换 基团的胺基、季铵盐；作为阳离子交换基 团的磺酸等。
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2、硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定 相
+ Si OH CliS R3
(RO3)SiR
Si O Si3R+ HCl
具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。
能在70℃以下，pH=2～8范围内正常工作，应用较
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
T
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2. H P L C ： H A C u
B2D m
Dm
T
柱T温 低，流 大 动 B相忽略
色谱分离过程中，溶质在流动相和固定相之间的 分配系数决定于溶质与流动相和固定相的相互作用。 这种作用不仅决定于参与作用分子的极性，而且决 定于不同类型分子间的作用力，即范德华力和氢键 力。
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在选用溶剂时，为了获得合适极性的溶剂，常采 用二元或多元混合溶剂系统作为流动相，改善色谱 系统的选择性，获得所需要的溶剂强度和溶解度。
广泛。
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3 、 正 相 色 谱 （ Normal Phase Liquid Chromatography）
流动相的极性小于固定相的极性。常用于分离极 性较强的化合物，组分与极性固定相的作用力主要 是静电力，溶剂极性越强，洗脱能力也越强；溶剂 极性越弱，洗脱能力也越弱。
分离顺序是极性较低的组分保留值小，先流出色 谱柱。
常用饱和烃作流动相，加入适量极性溶剂以调节 溶剂的强度，如甲醇、异丙醇等。
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4、反相键合相色谱法
（Reverse Phase Liquid Chromatography）
流动相的极性大于固定相的极性。常用于分离极 性较弱的化合物，由于固定相是非极性的，溶剂的 强度随溶剂极性的降低而增加。
分离顺序是极性较强的组分保留值小，先流出色 谱柱。在洗脱序列中，水的极性最大，故水是洗脱 强度最弱的溶剂。若增加水中的有机成分，则溶剂 的洗脱强度增加；相反，若在水中加入无机盐，则 增加了溶质的保留值。
忽略固定相传质阻抗
H P L C ： H A C m u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进 样及数据处理等。
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反相色谱中，溶质的分离以溶质的疏水结构的差 异为基础，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留 值越大。引入取代基增强溶质的疏水特性，能提 高保留值，并与取代基的数目有关。
如果分子中增加极性基团，会使保留减小。根据 溶质分子中非极性骨架的差别，或官能团的性质、 数目、位置的不同，能够预测溶质得洗脱顺序。
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例如，在苯酚分子上引入不同的官能团，引入甲 基则保留值增加，引入一个乙基相当于引入两个甲 基的影响，引入一个丙基相当于引入三个甲基的影 响；
在苯酚分子中引入羟基时则保留值降低，并且对 苯二酚要比邻苯二酚或间苯二酚较早洗脱出来；引 入一个硝基时保留值增大，然而引入两个或三个硝 基时，由于苦味酸和2，4—二硝基酚易溶于水，保 留值明显减小。
几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器
流动相有毒、费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
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流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
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由于固定液在流动相中有微量溶解，固定液 会不断流失而导致保留行为发生变化，柱效和 分离选择性变坏。因此，化学键合固定相逐渐 代替涂渍固定相。
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一、化学键合相色谱法（CBPC）
采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合 相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非 常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，
特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。
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1、键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体几乎都用硅胶。利用 硅胶表面的硅醇基(Si—OH)与有机分子之间成键, 即可得到各种性能的固定相。 （1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18） 和苯基等；
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（2）极性基团：如氨丙基、氰乙基、醚 和醇等；
性、改善分离度增加了因素 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
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操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
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第一节 液相色谱柱效
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速率理论（与GC对比）
当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流 动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送 出的信号记录下来，得到液相色谱图。
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液相色谱.swf
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1．高压输液系统
固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高 压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、 压力脉动阻力器等组成。
很快从色谱柱中洗脱出来，由于色
谱峰相互重叠，只观察到三个色谱
峰；当降低洗脱强度，使乙腈的浓 度降为80%，分离效果好一些， 可以观察到五个色谱峰；当乙腈的 浓度降为60%，可以观察到六个 色谱峰；当乙腈的浓度降为40% 时，可以很清楚地观察到八个色谱 峰，除了2和3两种物质，其它的 化合物都被很好地分离了；继续降 低乙腈的浓度（30%， 35%）， 所有的化合物都得到很好地分离， 但分析时间被大大延长，检测灵敏55
（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在 1~2%左右；
（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10 mL min-1之间，制备型仪器能达到100 mL min-1；
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（3）输出压力高、密封性好，要求最高压 力300~500 kg/cm2；
（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水 和缓冲溶液；
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在液液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一 个液相则涂在惰性担体上作为固定相。两者之间互 不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相后， 在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中， 由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度 存在差异，因而溶质在两相间进行分配，很快达到 分配平衡。这种分配平衡的总结果导致各组分的差 速迁移，从而实现分离。