苏云金芽孢杆菌毒性研究
苏云金杆菌的研究
2、样本和数据采集
考虑到苏云金杆菌的应用范围广泛，我们从农业领域相关的研究论文、专利 和书籍中搜集了关于苏云金杆菌的样本和数据。数据采集包括苏云金杆菌的菌种、 施用方法、防治对象、防治效果等方面的信息。
3、数据分析
对搜集到的样本和数据进行筛选、整理和分析。采用定量和定性相结合的方 法，对苏云金杆菌的耐药性、应用效果等方面进行深入研究。并运用表格、图表 等形式展示相关数据和结果。
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苏云金杆菌的研究
01 引言
03 研究方法
目录
02 研究现状 04 研究成果
引言
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌， 广泛应用于农业中作为生物防治手段，对多种害虫具有高效的防治效果。本次演 示将探讨苏云金杆菌的研究现状和应用，首先概述苏云金杆菌的分类和特征，然 后介绍苏云金杆菌在农业中的应用及研究现状，并探讨相关研究方法。最后，将 总结苏云金杆菌的研究成果和发现，指出研究的不足之处，并展望未来的研究方 向。
研究成果
1、苏云金杆菌对农业的影响
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中具有广泛的应用。其对农业的 主要影响表现在以下几个方面：
（1）高效防治害虫：苏云金杆菌对多种农业害虫具有高效的防治效果，特 别是对鳞翅目、膜翅目和鞘翅目等害虫有很好的防治效果。
（2）减少化学农药的使用：施用苏云金杆菌可有效减少化学农药的使用量， 降低环境污染。
3、苏云金杆菌在农业中的应用 及研究现状
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中广泛应用于防治各种鳞翅目、 膜翅目和鞘翅目等害虫。目前，针对苏云金杆菌在农业中的应用研究主要集中于 以下几个方面：
（1）优化施用方法：研究苏云金杆菌的最佳施用时间和方法，以提高其对 害虫的防治效果和减少对非靶标生物的影响。
蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究
蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)能产生具有强烈杀虫作用的晶体蛋白(insecticidal crystal protein,ICP),对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等节肢动物,以及动植物线虫、蜱螨等都具有特异性的毒杀活性,而对非目标生物安全。
目前,通过现代生物技术和基因工程的方法对苏云金芽孢杆菌进行改造,扩大其杀虫谱,提高杀虫毒力,使多种因素和成分发挥作用,害虫不易产生抗药性,避免了化学农药所带来的环境污染和抗性问题。
标签：苏云金芽孢杆菌;高毒力;生物防治1 苏云金芽孢杆菌的研究历史1901年日本学者S.Ishiwata报道了从猝倒死亡的家蠶体内分离出一种杆状细菌,即Bt猝倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp. scotto),从而揭开了人类对苏云金芽孢杆菌的研究史。
1911年Berliner报道了从德国苏云金省染病的地中海粉螟中分离出一种杆菌并定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
1927年,Matts再次从地中海粉螟中分离出类似的杆菌并沿用了苏云金芽孢杆菌的名称,这就是现在的模式种苏云金亚种Matts和Berliner(Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis Matts or Berliner)。
1938年,第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂问世,用于防治地中海粉螟。
到1953年Hannay第一次发现苏云金芽孢杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关,并与Fitz-James一起证实了伴孢晶体是一种蛋白质。
Dulmage(1970)筛选出对夜蛾科毒力较高的菌株HD-1,并以此建立了标准品的生物测定程序,实现了苏云金芽孢杆菌制剂的标准化。
1962年,Barjac等首先根据生理生化反应和鞭毛抗原(H)血清反应的不同,把苏云金芽孢杆菌划分为6个亚群。
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用
＊通 讯 联 系
Ｃ ｔ ｌ等 ＾通过 ｘ一射线 晶 体 衍 射 已经 确 定 了 ｃ ａｏ ｒｌ 珂 ⅢＤ蛋 白分子 的三维结 构 ， 图 １ 示 ， 总体 结 如 所 其
致幼 虫 的死 Ｉ 研 究 表 明 典 型 的 毒 性 多 肽 是 由三 个
后． 降解 为 有 活性 的 毒性 多 肽 。例 如 ， ｒ Ｉ杀虫 蛋 Ｃｙ ． ＂ 白约 １０ Ｉ， 毒 性 多肽 为 ７ Ｋ ３ Ｋ）其 ０ Ｄ左 右 据 研 究 ， 其
ｃ端 的 约 ６ Ｋ 片 段 是 经 过 蛋 白 酶 的 ７次 永 解 消 化 ，Ｄ ３ 作 用 而 被 除 去 的 。 通 过 ｘ一射 线 衍 射 分 析 ， 经 阐 已 明 了 ＣｖＡ ｒｌ ａ与 Ｃ ３ 的 三 维 结 构 ｙ ｒＡ 。 激 活 后 的
溶 解 并 被 蛋 白酶 激 活 成 毒 性 多 肽 ． 化 的 毒 性 多 肽 活 与昆虫 中肠 道 的 纹缘 膜 上 的受 体 （Ｂ Ｂ ＭＶ，ｒｓ ｂｒ ｂ ｈ ｏ— ａ
基酸序 列 的 同源 性 不 同种 类 的 Ｈ 所 编 码 的 毒 蛋 １
白不 仅 杀 虫 范 围 不 同 ， 且 大 小 也 不 一 样 ． 致 有 三 而 大 个 区 域 范 围 ： ２ — １８ Ｄ、 ５ — ６ Ｋ 和 ２ — １９ ３Ｋ ６ ７Ｄ ５
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生 物 工 程进 展｝ ０２ Ｖ ｌ２ ， ｏ２ ２０ ．ｏ ２ Ｎ ．
苏 云金 芽 孢 杆 菌杀 虫 晶体 蛋 白毒 性： 片段 的 结构 域 在毒 杀 昆虫 中 的作 用
孙运军 邹先琼 夏立板
湖 南师 范 大学 牛命 科 学 学 院微 生 物 学 系 ． 沙 长 ４ ０８ １０ １
东北地区高毒力苏云金芽孢杆菌HB-3 菌株生物学特性研究
形和方形两种晶体蛋白。纯化晶体及孢晶混合物的毒力测定结果表明， 该菌株对玉米螟具有较高毒力，Ｃ。 Ｌｓ 分别为
５ ８ ｇ ｍＬ和 ５ ９ ｇ ｍＬ， ． ２ｔ ／ ￣ ． ４ｔ ／ ￣ 对尖音库蚊也有一定毒力 ， Ｃｏ Ｌ ｓ分别为 １ ． ９ｔ ／ ６５ ｇ ｍＬ和 １． Ｏ￣ ／ ￣ ７ ５ ， ｍＬ。生理生化特性 ｇ 研 究结果表 明， － 已知 的蜡螟亚 种（ ａｉ ｕ ｕｉｇ ｅｓ ｕ ｓ． ａｌ ｉｅ基 本 一致 ， 清型为 Ｈ５ｂ 晶体 ＨＢ ３与 Ｂ ｃ ｌｓ ｈ ｒｎ ｉ ｉ ｓｂｐ ｇ ｌ ｒａ ） ｌ ｔ ｎｓ ｅ 血 ａ。
蛋白的 Ｓ） Ａ Ｅ分析表明， Ｂ３ 【 ｓＰ Ｇ Ｈ － 菌株晶体蛋白至少由分子量为 １３ Ｄ 、５ Ｄ 、５ Ｄ 和 ２ Ｄ 的 ４ ３ ａ６ ａ４ ａ ３ｋ ａ ｋ ｋ ｋ 种多肽
组成 。
关键词
苏云金芽孢杆菌 ； 晶体蛋 白； 毒力测定 ； 生物学 Ｓ４ ６ １ ７ ． １
（． １ 沈阳农业大学植物保护学 院农药科学 实验室 ， 阳 沈 １０６ ； ２ １１１ ．沈阳化工研究院 ， 阳 沈 １６０） ０１ １ １０２ ； １０ １ ３ 辽 宁出入境检验检疫局 ，大连 ．
摘要
从 自然死亡的玉米螟幼虫体 内分离获得一株对玉米螟高毒 的苏云金芽孢杆菌 ， 号为 ＨＢ ３ 编 －。该菌株产 生菱
（．Ｌ ｂｒｔｒ ｆＰｅ ｉｉｅＳ ｉ ｃｓ Ｃ ｌ ｇ ｆＰｌｎ ｒｔ ｔ ｎ， ｈ ｙ ｎ ｒ ｕｔｒ ｌ ｎｖｒｉ ，Ｓ ｅｙ ｎ １ ａｏａｏｙｏ ｓ ｃｄ ｃｅ ｅ， ｏｌ ｅ ａ ｔ ｏｅ ｉ Ｓ ｅ ａ ｇＡｇ ｉ ｌ ａ ｉｅｓ ｙ ｈ ａ ｇ ｔ ｎ ｅ ｏ Ｐ ｃｏ ｎ ｃ ｕ Ｕ ｔ ｎ
１０ ６ ，Ｃ ｉａ ２ ｈ ｙ ｎ ｅｅｒｈＩｓ ｔｔ ｏ ｈｍｉ ｌｉｄ ｓ ｙ ｈ ｎ ａ ｇ １０ ２ ， ｈｎ １ １ １ ｈｎ ； ．Ｓ ｅ ａ ｇＲ ｓ ｃ ｎｔ ｕｅ ｆＣ ｅ ｃ ｎ ｕｔ ，Ｓ ｅｙ ｎ １０ １ Ｃ ｉ ｎ ａ ｉ ａ ｒ ａ；
苏云金芽孢杆菌工程菌BMB20-4的杀虫晶体蛋白检测及毒力测定
株提高 ４ ， ４ 毒力效价显著提高 。 对小菜蛾提高了 ０７ 倍 ， ．２ 对棉铃 虫提 高了 ０７ 倍． ．５
关键词 ； 苏云菌芽孢杆 菌 Ｉ 杀虫晶体蛋 白 Ｓ Ｓ Ｐ ＧＥ电泳 ， Ｄ－ Ａ 生物测定 中囝分类号 ： １ Ｑ８ ２ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０４４ ２ （０ ６０ —０ ００ １０ —３ ９ ２０ ）４０２ —３
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６ ６
阜阳师范学院学报 （ 自然科学版 ）
第２ ３卷
至对数生长期， 然后按 １１０ 种量接 种至装有发 １７ ３ 待测样品毒力效价的测定方法跚 ／０ 接 ．． 酵培养基的三角瓶 中， 其中工程菌 Ｂ 。 ＭＢ 的发酵培 用Ｓ Ｓ软件对实验数据进行 回归分析， Ａ 得到 回 养 基 分 两 组 ， 组 加 入 红 霉 素 ， 为 Ｂ 。 （ｎ 归方程和半致死浓度Ｌ ５ 值 ， 一 记 ＭＢ州 ａ ｃ０ 计算毒力效价．
摘
要： 苏云金 芽孢 杆菌的杀 虫晶体蛋 白由单基 因编 码 ， 经过遗 传操 作 ， 建成 Ｂ Ｂ ０４ 构 Ｍ ２－ 工程菌． 本研 究对工 程菌
Ｂ ２ ＭＢ ０４进行 了杀虫 晶体蛋 白检测和 发酵液毒力测 定． 结果表 明ｔ 工程菌 Ｂ ２ — ＭＢ ０４杀虫晶体蛋 白质含量 比天 然菌
Ｖｏ． ３， ． １ ２ Ｎｏ ４
Ｄｅ ． ２ ０ ｃ ０６
苏云金芽孢杆菌工程菌 Ｂ ２ ＭＢ 的 杀 虫晶体蛋 白检测及毒 力测定
王 明跃 ｈ ，张小 平 。
（． １ 安徽师范大学 生命科学学院 ， 芜湖 ２ １０ ￣． ４ ００ ２ 阜阳职业技术学院 ， 阳 ２ ６ ３ 阜 ３０ １）
表 达 水 平 受 到 自身 调 节 系 统 及 毒 素 基 因 拷 贝数 限
苏云金芽孢杆菌的研究——综述
苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。
目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。
本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。
关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。
苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。
自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。
苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1Bt的发展历史1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。
1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展
B.t.杀虫毒素主要有三种
• 1、伴孢晶体（ICPs）即σ-内毒素。 伴孢晶体（ 内毒素。 伴孢晶体 ） 内毒素 • 2、苏云金素即 外毒素。 苏云金素即β-外毒素 苏云金素即 外毒素。 • 3、芽孢。 芽孢。 芽孢
Ⅰ、伴孢晶体 伴孢晶体
在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒 性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体。
营养期杀虫蛋白 （Vegetative Insecticidal Proteins,VIPs） • Bt在营养期分泌的的一种很有应用前景的杀 虫蛋白。 VIPs 主要分为VIP1、VIP2 和VIP3 三种。
Bt的应用及应用中所遇的问题 的应用及应用中所遇的问题
• 1.苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀 虫活性，因此被广泛地应用于生物农药的 开发。
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新的命名规则和分类原则 分类 第一级 第二级 第三级 第四级 同源性 小于45% 45% 至75% 之间 75% 至95% 之间 95% 以上 命名规则
使用阿拉伯数字，如Cry1 和Cry2, 它们之间的同源性小于45%。 使用大写英文字母，如Cry1A Cry1B 之间的同源性在45% 至75% 之间。 使用小写英文字母，如Cry1A a 和 Cry1A b, 其同源性在75% 到95% 之 间。 使用阿拉伯数字, 如Cry1A a1 和 Cry1A a2的同源性大于95%。
※
由于芽孢衣蛋白质与伴孢晶体蛋白质的 同源性致死。芽孢致死害虫的剂量、死 亡斜率、致死症状与伴孢晶体相近。
※
几丁质酶（Chitinase，Chi ）： 是微生物、高等植物和昆虫体内普遍合成的一 种具有生物催化活性的水解酶类。
蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究
年 ， 一 个 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 商 品 制 剂 问 世 ， 于 防 治 地 中 海 第 用
果 ， 植 株 矮 小 变 黄 ， 低 产 量 ， 响 品质 。 使 降 影
蛴 螬 是 花 生 产 区 的 主 要 害 虫 。２ ０ — ２ ０ ０ ３ ０ ４年 笔 者 在 河
． 粉 螟 。到 １ ５ ９ ３年 Ｈａ ｎ ｙ 一 次 发 现 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 的 杀 ２ ２ 花 生 蛴 螬 的 危 害 ｎａ 第
虫一 起 证 实 了 伴 孢
暗 Ｈｏｏｒ ｈａ ａａ ｅ 危 ｉ ｌａ 晶体 是 一 种 蛋 白质 。 Ｄｕｍａ ｅ １７ ） 选 出 对 夜 蛾 科 毒 力 北 定 州 市 调 查 ， 黑 鳃 金 龟 （ ｌｔ ｃ ｉ ｐ ｒｌ ｌ） 害 严 ｌ ｇ （９０ 筛 较 高 的 菌 株 ＨＤ一 １并 以 此 建 立 了 标 准 品 的 生 物 测 定 程 序 ， ， 实现 了苏云 金 芽 孢杆 菌 制 剂 的标 准 化 。１６ ９ ２年 ， ａｊｃ Ｂ ｒ 等 ａ 首 先 根 据 生 理 生 化 反 应 和 鞭 毛抗 原 （ 血 清 反 应 的 不 同 ， Ｈ） 把 苏 云金 芽 孢 杆 菌 划 分 为 ６个 亚 群 。 １ ６ ９ ７年 、 ９ ８年 Ｈｅ １６ ｉ ｍ— ｐｌ 形态特征 、 化反应 、 型 和酯 酶型 结合 在一 起 ， 出 ｅ把 生 Ｈ 提 了产 伴 孢 晶 体 的 细 菌 分 类 表 。 １ ７ ９ ６年 Ｚ ｋ ａｙ ｎ最 先 提 ａ ｈ ｒｏ 出 ： 粒 可 能 对 伴 孢 晶 体 的 编 码 起 作 用 。 Ｄ ｂ ｂ ｖ 等 质 ｅａｉ ｏ 重 ， 成花 生 严 重 减 产 ， 重 地 块 花 生 产 量 不 足 ５ 造 严 ０公 斤 ／ 亩 ；０ ５ ２ ０ ２ ０ — ０ ８年 调 查 ， 绿 丽 金 龟 （ ｏ ｌ ｏ ｐ ｌｎａ 铜 Ａｎ ｍａａｃｒ ｕｅ ｔ）
苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展
苏云金芽胞杆菌杀虫方面的研究及运用进展摘要：人类对苏云金芽胞杆菌（Bt）的研究至今已有100多年的历史，因其具有特殊的生理特性，在微生物防治害虫方面具有重要的作用。
利用微生物能直接杀死害虫却又不伤害控制害虫的天敌，最重要的是它不污染环境，害虫也更难以产生抗药性，还能通过遗传操纵改造某些性状，以便对其更好的利用。
同时，随着转基因技术的兴起和发展，Bt成为转基因过程中的重要材料，在应用实践中起着巨大的作用，如今成功的转Bt产物已有：转Bt抗虫棉花、转Bt玉米以及备受争议的转基因水稻等等。
本文主要叙述Bt的某些重要特征和当前的研究进展，旨在达到一种科普宣传让人们更加了解有关转Bt产物方面的知识。
关键词：苏云金芽孢杆菌、微生物防治、转基因、农业生产应用苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，简称Bt )是一种杆状、革兰氏染色阳性反应、能形成内生芽胞的细菌，广泛存在于各种生态环境中。
其营养体具有周生鞭毛或无鞭毛。
在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体，此特点成为苏云金芽胞杆菌区别于分泌肠毒素的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的主要特征(喻子牛等，1990)。
由于其独特的杀虫特性，自从1901年日本学者Ishiwata首次分离到苏云金芽胞杆菌以来，苏云金芽胞杆菌得到了广泛的关注和研究，在世界范围内已分离得到超过40000个菌株，对其生物活性谱的了解得到了极大的扩展，由最初对鳞翅目的毒性，逐渐发现对双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf等，1998)。
1.苏云金芽孢杆菌的毒素毒素是苏云金杆菌杀虫的核心，主要有三种：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白，Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）即σ-内毒素，苏云金素即β-外毒素，芽孢。
苏云金芽孢杆菌研究回顾与展望
三、使用苏云金芽孢杆菌的注意 事项
三、使用苏云金芽孢杆菌的注意事项
虽然Bt及其产品具有高效、安全、环保等优点，但在使用时仍需注意以下几 点：
1、选择适当的Bt产品：针对不同的害虫种类和作物种类，应选择相应的Bt产 品。
三、使用苏云金芽孢杆菌的注意事项
2、正确使用方法：严格按照产品说明书的要求使用Bt，包括使用时间、剂量 和方式等。
三、未来展趋势
3、系统生物学研究：随着系统生物学研究的深入，对苏云金芽孢杆菌的全基 因组表达调控、代谢途径等方面的研究将更加深入。这将有助于从整体角度理解 其生物学特性，为优化其应用提供理论支持。
三、未来发展趋势
4、多学科交叉研究：未来的研究将更加注重多学科交叉，如物理学、化学、 材料科学等。通过不同学科的融合，可以开发出更具有创新性的应用领域和产品。 例如，将苏云金芽孢杆菌与纳米技术相结合，可以开发出新型的纳米生物农药或 纳米生物材料等。
二、苏云金芽孢杆菌的应用领域
二、苏云金芽孢杆菌的应用领域
苏云金芽孢杆菌作为一种重要的微生物资源，在多个领域具有广泛的应用： 1、生物农药：苏云金芽孢杆菌作为一种环保型的杀虫剂，被广泛应用于农业、 林业等领域。其产生的毒素蛋白对多种害虫具有特异性杀灭作用，且对人类和其 他动物无害，因此备受青睐。
二、苏云金芽孢杆菌的应用领域
一、苏云金芽孢杆菌的研究回顾
一、苏云金芽孢杆菌的研究回顾
苏云金芽孢杆菌是一种具有重要应用价值的微生物，自1911年被发现以来， 一直受到广泛。其研究历程可分为以下几个阶段：
一、苏云金芽孢杆菌的研究回顾
1、基础生物学阶段：早期的研究主要集中在苏云金芽孢杆菌的生物学特性、 生长条件、芽孢形成等方面。这些研究为后续的应用提供了重要的理论基础。
苏云金杆菌(BT)毒素及其应用
苏云金杆菌（BT）毒素及其应用苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, BT）是一种属于芽孢杆菌科的厌氧革兰氏阳性细菌，被广泛应用于生物农药领域。
其特殊之处在于它所产生的杀虫毒素对昆虫具有高度选择性和毒杀力，而对其他生物如人类和哺乳动物等无害。
苏云金杆菌通过杀虫毒素中的晶体蛋白（crystal protein, Cry）来对昆虫进行毒杀作用。
Cry毒素是一种孢晶蛋白，具有独特的作用机制。
其在昆虫肠道内会被消化酶切割，产生一种活性物质，结合并破坏肠道上皮细胞的细胞膜，导致肠道溶解和细胞死亡。
这一过程会导致昆虫水分和营养丧失，最终导致昆虫死亡。
苏云金杆菌毒素的应用主要集中在农业方面。
作为一种生物农药，它对昆虫的毒杀力非常高效，尤其适用于各类害虫的防治。
由于BT毒素对昆虫具有高度选择性，对其他生物无害，因此其在生态环境中的施用相对安全可靠。
同时，BT产品对环境的污染也很小，对人体的副作用也非常低。
因此，BT毒素被认为是一种环保、安全、有效的农药。
在实际应用中，BT毒素主要以两种形态存在：一种是悬浮液，可以直接喷洒在作物上，通过作物表面的附着和昆虫食用来实现毒杀作用；另一种是基因工程改造后的杂质，通常用于生产转基因植物。
这些转基因植物通过在其基因中导入BT毒素的编码序列，实现对害虫的防治。
这种转基因技术的应用使得BT毒素能够更加方便地被作物吸收，并在昆虫发生侵害时迅速发挥作用。
除了农业领域，BT毒素还被应用于其他一些领域。
在医学上，BT毒素被用作治疗和预防各种寄生虫病的药物。
在环境保护方面，BT毒素还可以被用来控制蚊蝇等各类害虫的繁殖。
此外，BT毒素还可以用于基因工程技术的研究和发展。
总之，苏云金杆菌（BT）毒素是一种对昆虫具有高度选择性和毒杀力的生物农药。
其应用广泛，可用于农业、医学、环境保护等多个领域。
随着技术的不断发展，BT毒素的应用将进一步扩展，为人类的生活和生产带来更多的益处。
苏云金芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌前言化学杀虫剂的长期使用对生态环境产生了严重的破坏，而害虫种群的抗药性也日益提高，因此生物杀虫剂因为其“绿色环保”的特点日益引起人们的广泛关注。
其中以自1901年日本学者从家蚕体内分离到以来的被广泛应用到植物病虫害的生物防治的苏云金芽孢杆菌最为有名。
苏云金芽孢杆菌是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。
其形成的蛋白晶毒素能够对鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、食毛目、直翅目等9个目500多种害虫具有毒杀作用，同时还对线虫、瞒虫、原生动物等害虫有特异的杀虫活性。
并且科学家关于苏云金芽孢杆菌的科学研究已经有很长的历史，自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年。
1、苏云金芽孢杆菌杀虫剂历史研究以及其应用苏云金芽孢杆菌最初是日本人石渡繁胤于1901年首次从有病的家蚕虫体内分离，并且证明其对一些鳞翅目的昆虫具有杀虫活性。
1911年，德国人恩斯特·贝尔林纳从德国苏云金省的地中海粉螟虫体内又重新分离出一种高效杀虫的细菌，并正式定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthutingiensis n.sp.)。
[5]至今为止，苏云金芽孢杆菌杀虫剂是世界上应用最成功的生物杀虫剂。
并且，科学家对于苏云金芽孢杆菌的研究已经有100a的历史。
自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年。
而且以苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白为活性的生物杀虫剂年销售额占全球生物杀虫剂的95%以上。
但是因为其推广力度以及人们的农药使用意识的传统观念，目前生物农药仅占全部农药市场5%～8%，从此可看出，苏云金芽孢杆菌杀虫剂任然有具有较大的发展潜力。
同时，苏云金芽孢杆菌被认为是对环境安全友好的生物杀虫剂，生产过程符合环境安全保护的要求，喷撒杀虫剂后在野--外残留少。
苏云金芽孢杆菌农药生产成本较低，主要原料为淀粉、蛋白胨和豆粕粉等。
生产和使用苏云金芽孢杆菌杀虫剂具有如下优点：(1)大罐液体发酵生产，生产工艺简单，设备投资少，生产成本低；(2)原材料来源广泛，均为农、副产品，价格比较便宜；(3)建厂周期短；(4)产品杀虫谱广，对鳞翅目的200多种害虫均有毒杀作用；(5)使用Bt杀虫剂对环境和水源无污染，对人畜无害。
苏云金芽孢杆菌的概况及其研究进展
关 键 词 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 ：杀 虫 剂 ：晶体 蛋 白 ；杀 虫 活 性 ；特 征 ；作 用 机 理
分类号 ￥ ７ ． ４６ 】
Ａ Ｐｒ ｆｌ ｆ Ｂａｃｌｕ ｈｕ ｉ ｇｉｎｓｓ ｎｄ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｏ Ｉ ｏｅｏ ｉ ｉｌ ｓ ｔ ｒｎ ｅ ｉ ａ ｓ ａ ｃ ｏ ｒ ｓ ｎ ｔ
ｕ ｅ ｎ ｈ ｏ ｔｉ ｈ ｐ ｌ ａｉｎ ｉ ａ ｔｒ ｌｉｓ ｃｉｉｅｗｉ ｘ ｅ ｌ ｉｈ ａ ｔ ｉ ｓｕ ｅ ｎ ｔｅ ｓ ｄ ａ ｄ ｔｅ ｃ ｓ ｎ ｔｅａ ｐｉ ｔ ｆａ ｂ ｃｅ ａ ｎ ｅ ｔ ｄ ｔ ｅ ｔ ｍｅｙ ｈｇ ｃｉ ｔ ｉ ｓｄ ｉ ｈ ｃ ｏ ｉ ｃ ｈ ｒ ｖｙ
（ 国热 带农 业科 学 院环境 与植 物保 护研 究所 海 南儋 州 ５ １ ３ ） 中 ７ ７ ７
摘 要 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 （ａｉｕ ｈ ｒ ｇ ｎｉ．Ｂ ） 虫 剂 是 对 人 和 环 境 友 好 的安 全 型 细 菌 杀 虫 剂 。 目前 Ｂ 杀 Ｂ ｃ ｌｓｔｕｉ ｉ ｓ ｌ ｎ ｅ ｓ ｔ杀 ｔ 虫 剂 已 被 广 泛 应 用 ．但 因 使 用 剂 量 较 大 ，导 致 防 治 害 虫 时 费 用 过 高 。若 在 生 物 防 治 中使 用 超 高 效 的 细 菌 杀 虫 剂 ， 就 可 降 低 其 使 用 剂 量 Ｂ ０ ５ — ｔＯ— ０ ５菌 株 是 从 美 国 引进 的 高 效 杀 虫 菌 株 ，其 晶体 蛋 白的 特 征 分 析 尚未 完 成 ，其 毒 素 的 作 用 机 理 研 究 也 未 进 行 本 项 目 即将 开 展 如 下 研 究 ： （） 用具 有 特 异性 杀 虫 功 能 的Ｂ ０ ５ 一 １先 ｔ０— Ｏ ５菌 株 进 行 发 酵 ．继 续 完 成 对 防 治 中 国害 虫 防 治效 果 的 评 价 ：再 分 析 细 菌 的 编 码 杀 虫 毒 素 基 因 和 毒 素 的 生 化 特 征 ；然 后 混 合
食用菌迟眼蕈蚊生防菌苏云金芽孢杆菌的筛选及毒力测定
食用 菌
迟 眼蕈 蚊
苏 云金芽孢 杆菌
筛选
毒 力
文章编号 １ ０ ０ ０ — ８ ３ ５ ７ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ６ — ０ ０ ５ ３ — ０ ３
双翅 目眼蕈蚊科 （ Ｄ ｉ ｐ ｔ ｅ ｒ ａ ： Ｓ ｃ ｉ ａ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ） 害虫是 我 国食用 菌
菌株转接 ， ４ ￣ห้องสมุดไป่ตู้Ｃ 保存备用 。
害虫 的隐蔽性 较强 ， 且栽 培期较 短 ， 化学农 药的使用 易导致 食用菌农药残 留污染 。因此 开展 高效 、 安全 的生物防治 防控 技术研究对我 国食用菌安全生产具有重要意义 。
苏 云金 芽孢 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｔ ｈ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ， Ｂ ｔ ） 是革 兰 氏 阳
Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｔ ｈ ｕ ｎ ｎ ｇ ￣
。Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增鉴定菌 株毒蛋 白基因型 的结果
表 明， ５ 株分离菌株包含有 ｃ ｒ ｙ ４ ￣ １ ０ 、 ｃ ｒ ｙ ｌ ｌ 、 ｃ ｙ ｔ 门铂ｃ ｙ ｔ ２等４种基因
型， ２ 个菌 株未鉴定 出基因型 ， 可能含有 未知基 因 ， 需要进 一步 鉴定 ， 为研发新 型的高效广谱 Ｂ ｔ 制剂提供优质的菌种资源 。 关 键词
发 现这 ７ 株Ｂ ｔ 菌与苏 云金芽孢杆 菌模式菌株 Ａ Ｃ Ｃ Ｔ １ ０ ７ ９ ２ 同源 性 均达到 ９ ９ ％， 可初步认 为在分类学上 均属于苏云金 芽孢 杆菌
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 供试材料 土壤样 品 ： 采 自江苏省南京市紫金 山和江苏 省农 业科 学 院试验 田。先将 表层 土铲 去约 Ｉ － ２ ｃ Ｉ Ｔ Ｉ ， 再取 约 １ ０ ｇ 土， 所采土样装入无菌袋 内备用 。
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性
苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. israelensis，以下简称Bti）是一种广泛应用于生物防治的杀虫剂，主要用于控制蚊子和其他蚊科昆虫的幼虫。
本文将介绍关于苏云金芽孢杆菌的筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性。
一、苏云金芽孢杆菌的筛选苏云金芽孢杆菌是一种土壤中常见的细菌，它产生的晶体蛋白对蚊科昆虫具有高度的毒力。
在苏云金芽孢杆菌中，主要的毒素是一种名为Cry4Aa的晶体蛋白，它对蚊科幼虫具有高度的选择性毒力。
苏云金芽孢杆菌的筛选通常是从天然环境中进行的。
研究人员采集不同产地的土壤样品，并通过稀释涂布法或筛选培养基对苏云金芽孢杆菌进行筛选。
经过筛选和鉴定，得到的苏云金芽孢杆菌菌株通常具有较高的杀虫活性和较好的稳定性，适合用于生产高效的杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性主要是通过其产生的Cry4Aa晶体蛋白发挥作用。
这种晶体蛋白具有特异的毒性作用，主要靶向蚊科幼虫的肠道细胞。
当蚊科幼虫摄入含有苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的培养基或溶液时，晶体蛋白会在其肠道中溶解，释放出活性毒素，并与肠道细胞表面的特定受体结合，导致细胞膜的破坏和细胞内环境的改变，最终引起蚊科幼虫的死亡。
苏云金芽孢杆菌对蚊科幼虫的杀虫活性具有很高的选择性，对其他昆虫和野生动物几乎没有毒性。
这主要是因为苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白靶向性强，只对蚊科幼虫的肠道细胞产生毒性作用，而对其他昆虫和野生动物的肠道细胞没有影响。
苏云金芽孢杆菌被广泛应用于蚊科幼虫的生物防治中，成为一种安全有效的杀虫剂。
在实际应用中，苏云金芽孢杆菌常用于蚊虫孳生的水体中进行喷施或喷洒。
因为苏云金芽孢杆菌可以在水中形成悬浮的颗粒，并且对水质和水体环境的变化不敏感，所以在水体中使用苏云金芽孢杆菌可以有效控制蚊虫的孳生，减少蚊虫的传播。
生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展----朱玮
2004 年 6 月 The Chinese Journal of Process Engineering June 2004生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展 朱 玮， 赵 兵， 王晓东， 王玉春 (中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080)摘要：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)制剂是目前应用广泛而有效的一种微生物杀虫剂.本文介绍了苏云金芽孢杆菌的菌种优选、发酵过程及剂型研究进展，具体阐述了发酵过程中培养基和发酵条件的优化、各种发酵方式和发酵设备等. 指出了目前发酵生产苏云金芽孢杆菌中存在的问题，提出了解决问题的建议并展望了其发展前景.关键词：苏云金芽孢杆菌；杀虫晶体蛋白；微生物杀虫剂中图分类号：S476+.11 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)03−0282−07 １ 前 言 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)于1901年在日本被发现，1911年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名. 苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein)，对敏感昆虫有特异性的防治作用. 1956年前苏联发表了用液体培养基摇瓶培养苏云金杆菌并用于防治菜青虫的报道，从而揭开了苏云金杆菌大规模培养的序幕. 中国从上世纪60年代也开始了规模化生产. 同苏云金杆菌有关的研究，特别是有关分子生物学方面的研究正在持续展开，但在发酵工艺方面还需进一步加强.随着人们的环保意识不断增强，生物农药正在引起越来越多的关注. 苏云金杆菌制剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在生物杀虫剂市场中所占份额也日益增加[1−3].２ 苏云金杆菌的优选 近30年来已从世界各地的土壤、昆虫及其接触物中分离出大量苏云金杆菌的菌种. 现在大约已知有69个血清型，82个血清亚种[4]. 大多数生产厂家主要使用血清III型、V型、VII型菌株,包括HD−1, Bt−K, 8010等. 在连续的人工转接和生产中，苏云金杆菌会出现芽孢和晶体变小和数量减少、生长速度缓慢等退化性状，一般采用虫体复壮的方法重新得到高毒力的菌株.针对苏云金杆菌菌种发酵效价低、杀虫谱窄、见效慢、菌种退化等问题，可以采用诱变的方法筛选高毒力的菌株. 选择合适的诱变剂量，将化学诱变和物理诱变结合能显著提高突变率. 丁学知等[5]将菌株7012C经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变，菌株的毒力与原始菌株相比提高了7.5倍.目前许多科学家致力于采用遗传工程的办法，对原有的ICP基因重组改造，构建成杂种基因或工程菌，以提高杀虫效率，扩大杀虫谱，延长有效期或改进制剂效能. 商品化的苏云金杆菌杀虫剂主要源自库斯塔克亚种，如HD−1及类似菌株. 将cry1C基因导入这类菌株后，可扩充其对甜菜收稿日期：2003−07−28，修回日期：2003−10−23作者简介：朱玮(1979−)，女，安徽省芜湖市人，硕士研究生，生化工程专业，Tel: 010−82627059, E-mail: sesamin@.夜蛾等灰翅夜蛾属昆虫的活性，开发出的产品或制剂有美国的Cutlass和我国的WG系列和BtTnY. 国内一些实验也证明，表达后对夜蛾科昆虫有毒效的cry1E、对双翅目昆虫有效的cry11A及对蚊子有毒效的cryt1A等基因，均可在构建菌株中有效表达，为进一步建立广谱的工程菌打下了基础. 除了广谱杀虫工程菌，提高杀虫活性的工程菌、延缓抗性的工程菌、延长持效期的工程菌等也已研制成功[6−8]. 此外，还可以在体外操作ICP基因后插入新载体，其中包括将cry基因转入假单孢菌以增加持效期、转入植物内生菌防治玉米螟、转入蓝细菌以增强水体中防蚊功能、转入杆状病毒杀虫剂以利用病毒的垂直传播的特性等. 与传统育种方法相比，构建的工程菌不仅能提高本身性状，而且可以有目的、定向地增加新的性状. 这些工程菌有的已开发出制剂并投入田间应用，有的还处于研究阶段，它们的应用效果和开发前景还有待实践检验. 虽然大量的苏云金芽孢杆菌基因已进行过序列分析，但毒性受体、作用机制及抗性机制综合研究还很有必要. 苏云金杆菌工程菌建立后，还需考察其基因表达量、遗传稳定性以及生产工艺[9]. ３ 苏云金杆菌的发酵工艺 苏云金芽孢杆菌发酵生产包括液态发酵和固态发酵两种方式.３．１ 液态发酵 液体发酵是目前苏云金杆菌杀虫剂大规模生产中的主要发酵方式，其产品杀虫毒力与其发酵水平有着密切的关系. 发酵过程的研究主要集中在培养基组份和浓度、培养过程的通气量、温度、溶解氧量等因素对芽孢数、伴孢晶体及毒力效价影响的相关性研究上.3.1.1 培养基的优化Yousten等[10], Rogoff等[11], Nickerson等[12]对苏云金杆菌的基本营养需要、代谢途径、伴孢晶体形成和抑制伴孢晶体形成的因素等作了研究，为苏云金杆菌制剂的生产提供了生理学依据[13,14]. 苏云金杆菌对培养基的要求不严，多种因地制宜的农副产品都可被其吸收利用，但对多种不同来源的复合培养基，不同的菌种要实现可行的工业生产需要有针对性地进行培养基优化. Dulmage[15]在研究两种培养基对12个亚种的影响后发现，不同亚种在同一培养基中或同一亚种在不同培养基中，产生的活芽孢数和杀虫活性会相差几倍到几百倍不等. 因此，菌种和培养基组份均对发酵产品的毒力效价有重要影响. 为了获得高效价水平的发酵培养基配方，研究人员相继采用正交设计、快速登高法、优选法或二次正交旋转组织设计等方法进行优化筛选，验证后用于工业生产.在深层液态发酵中，培养基的浓度和碳氮比很重要. 早期研究发现[16]，随培养基营养成份浓度增加，芽孢数和毒蛋白随之增加. Arcas等[17]将培养基中的葡萄糖浓度从8 g/L增加到56 g/L后，毒力水平和芽孢数也分别提高了6和7倍. 但是浓度过高会抑制其生长，不能形成正常的芽孢和毒蛋白. 培养基浓度在一定范围内增加，必需营养元素浓度加大，有利于细胞的生长和芽孢的生成；而当培养基浓度过大，粘度增加，物质交换速度下降，局部代谢产物不能及时排出，氧传递速度降低，苏云金杆菌的生长受到抑制，芽孢数也随之下降.保持合适的碳氮比对高效价产品生产也很关键，不合适的碳氮比会导致pH不能回升而影响最终产量. 在半合成培养基中，苏云金杆菌在对数生长期由于利用葡萄糖产生丙酮酸、醋酸，pH 下降到4.8∼5.0，几小时后这些物质再次被利用，pH回升，芽孢和晶体开始形成. 如果对数生长期后pH不能回升而一直在6.0以下，芽孢和晶体都不能形成. 苏云金杆菌在芽孢形成的初始阶段，菌体合成一种胞外蛋白酶，参与伴孢晶体的蛋白质转化合成过程，而这种酶的合成和酶活性最适pH均为中性，pH在6.5以下或9.1以上该酶活性急剧下降，丧失形成这种酶的能力的变异株既不能形成芽孢也不能形成晶体[14].在培养基优化时要综合考虑碳氮比和营养物浓度这两个因素. 不同的菌种有不同的生理特性和相应的营养需求[18−20]. Farrera等[21]在培养基碳氮比为3∼11和培养基浓度60∼150 g/L条件下分别对苏云金杆菌HD−73实验，发现当碳氮比为7时，不同浓度条件下毒蛋白产量都是最高，而培养基浓度每增加2.5倍，毒蛋白量增加6倍，芽孢数则在碳氮比为4、培养基浓度为150 g/L时最多.一些微量元素对苏云金杆菌的发酵也有明显的作用. 苏云金杆菌生长繁殖过程中，糖的初级异化是通过E−M途径进入TCA循环的，因此KH2PO4是E−M−P途径中磷酸化过程不可缺少的物质；KH2PO4的缓冲作用有利于芽孢和晶体的形成[14]. 矿物质钙元素也是苏云金芽孢杆菌必需的元素. Ca2+在芽孢皮层形成时与DPA结合形成DPA−Ca复合物，促使形成不可逆热稳定芽孢，而且明显影响伴孢晶体的外蛋白酶的合成.苏云金杆菌培养基还可利用碳氮源丰富的工业废水进行生产[22−25]. 例如，味精厂高浓度有机废水本身含有丰富的氮源，酒糟废液中富含未被利用的碳水化合物、脂肪、灰份、氨基酸和多种维生素. 逐渐提高废水浓度和浓缩倍数的方法可使苏云金杆菌适应恶劣的废水培养环境，获得在废水中正常生长且具有高毒力单位的驯化菌株. 在使用废水前进行预处理也很重要，Maria等[26]以7种不同来源的废水交替作为生产苏云金杆菌的培养基，用作培养基的废水包括未经预处理、酸水解处理和水解污泥离心后的上清液，结果发现酸水解处理的培养基毒蛋白产量提高. 这样的发酵过程不仅节约能源，降低了生产成本，而且在治理环境的同时变废为宝.3.1.2 发酵条件目前苏云金杆菌的培养温度多采用(30±1)o C，温度低于28o C发酵的周期会延长，但温度超过37o C时伴孢晶体数量几乎为零. 苏云金杆菌在对数生长期要消耗大量的氧气，并相应释放出大量的热量[27]. 如果中断供氧，细胞停止生长，不能形成芽孢和晶体，最终导致细胞自溶. 通气量与供氧直接相关，增加通气量和搅拌速度可以加速氧传递、代谢物质的交换及热量的释放，具体的数值需根据发酵设备、容量、培养基成份和菌体不同的生长阶段确定.3.1.3 发酵方式液态发酵有分批发酵、补料分批发酵、连续发酵等方式. 分批发酵一次性投料和放罐，产品质量比较稳定，设备和操作技术水平要求不高，目前很多厂家都采用这种方式. 但要达到较高的发酵水平，需要使用高浓度培养基. 在一次性投料时，高浓度培养液容易产生基质和代谢产物的抑制，同时培养基的粘度增加后，由于影响混合和流动而不利于氧的传递. 苏云金杆菌是快速好氧菌，若氧气供应不足生长繁殖就会受到很大影响，因此单纯的分批发酵难以实现细胞的高密度培养. 连续发酵可以解决发酵中存在的这种问题. 由于一级连续发酵芽孢形成率低，研究者尝试使用第一级连续第二级间歇的二级发酵方法以及变温二级发酵. Acras等[17]用梯度连续流加的方法也使芽孢晶体增加1倍多. 但经过较长时间的连续培养后很容易染菌，菌种易发生退化，因此要实现大规模的连续发酵生产仍然存在很多问题，不仅有一定的设备要求，还需要较高的操作技术.补料高密度培养介于分批培养和连续培养之间，兼有两者的优点，而又克服了两者的缺点. 多组实验表明[28]，在其它条件相同的情况下，补料发酵的细胞密度、晶体含量和毒力效价综合平均值高于分批发酵. 寻求最佳的补料时间和流加速率十分重要，对不同的物料和菌种及生产目的，可有多种方案. 在发酵过程中，淀粉首先被液化酶分解为低分子糖，再被利用. 发酵4∼8 h细胞吸收养份，个体增大并且分裂增殖合成蛋白质核酸，碳源等能源物质消耗较快. 针对葡萄糖的消耗情况，在发酵中可以适时适量地添加葡萄糖，在工业生产中也可以使用淀粉液化液达到同样效果. 补料发酵的需氧高峰相对平缓，在生长旺盛期较易避免溶氧低谷，对生产过程改善溶氧从而确保高密度培养具有实际意义[29,30].3.1.4 发酵设备苏云金杆菌的液态发酵设备主要参照传统的抗生素发酵生产模式建立. 发酵过程中的不同阶段耗氧速率各不相同，发酵过程往往会出现低于临界溶氧值的缺氧期，因此加快溶氧速率是工业生产中需要解决的问题. 使用传统的机械搅拌罐可以变速搅拌，在细胞增殖前期和后期采用低转速搅拌，中期采用高速搅拌，不同时期的最佳转速应根据溶氧曲线的变化进行调整[31]. 但机械搅拌罐受结构限制，罐体高径比小，不能较多地利用无菌空气中的氧气. 最近几年新出现的气升式发酵罐无机械搅拌装置，它利用空气作为搅拌动力，使罐内的不同区域形成密度差和宏观循环流得以混合. 它具有结构简单、无运动部件、无菌操作可靠性高、耗电少、造价低等优点，适合苏云金杆菌的发酵. 李稳宏等[32]将冷模实验中优化选择出的外环流气升式反应器与机械搅拌罐作平行实验，结果表明该工艺不仅操作方便、控温精度高，与普通的机械搅拌发酵罐相比，在规模和培养基等条件相同的情况下，发酵周期由42 h缩短到33 h，细胞密度增加了35%. 杨建州[33]的发酵实验表明，折流元件可改善环流反应器的发酵性能，并将研究结果放大到20 m3的气升式环流反应器中，与工厂同等规模的搅拌式发酵罐相比，在完全省去搅拌功耗又不增加空气用量的条件下，菌体密度在1010 ml−1以上，发酵液的毒力效价高于在机械搅拌式发酵罐内的发酵结果约10%，并且节电30%以上.３．２ 固态发酵 固态发酵起源于我国传统的“制曲”技术，是利用颗粒载体表面所吸附的营养物质来培养微生物. 在相对小的空间内，这种颗粒载体可提供相当大的液气界面，从而满足好气微生物增殖所需要的水份、氧气和营养. Mechalas[34]取得了苏云金杆菌的固体发酵专利权. 简单的固态发酵通常是将含有活芽孢的菌粉或种子液加入培养基，根据自然气候状态在网盘、大池或地坪进行半封闭的发酵，虽然成本低，但是设备简陋，条件粗糙，生产质量低. 随着人们对固态发酵苏云金杆菌特有优势的认识和研究的深入，这项技术逐渐成熟. 研究发现液体种子培养基初始pH值、种龄、发酵温度、固体培养基含水量、微量元素等都是影响芽孢形成和毒力效价的重要因素. 控制含水量可协调发酵过程菌体周围的气液环境，发酵基质中若含水量过大则芽孢、晶体游离晚，发酵周期延长；含水量少则扩散阻力使局部代谢产物积累过多，吸收不到营养物质，物料的高粘度还会影响通风和菌体对氧气的利用，减少了固态发酵液气界面的优势，导致发酵受到抑制. 其它条件如pH值、种龄、发酵温度等可借鉴液态发酵. 杨淑兰等[35]通过苏云金杆菌从实验室实验到百公斤级固体发酵实验，研究了适合苏云金杆菌HD−1固体发酵规模生产的各种条件.能用于苏云金杆菌固态发酵的原材料很广泛，但选择时既要考虑到材料的营养性，也要考虑到它的通气性. 通常可分为有机载体和无机载体. 有机载体如麦麸、米糠、黄豆饼粉、花生饼粉等，这些载体本身就是很好的碳氮源；无机载体如多孔珍珠岩、细沙等，这些则需要另外添加营养成份. 在使用时往往是根据需要结合起来，可以因地制宜地选择一些材料. 张怡等[36]尝试使用废次烟草为主要材料，与麸皮相比，可降低粘度，增加孔隙率. 但考虑到植物叶的挥发性物质对菌种生理生化的影响，还需对烟叶进行浸泡预处理. 啤酒糟作为主要原料也可用于苏云金杆菌发酵[37]. 研究发现不同原料对应的最佳含水量差异也很大.传统浅盘静止发酵存在诸多缺陷，固体物料的非均一性会带来温度、湿度、氧传递等问题. 苏云金杆菌在对数生长期会产生大量的热量，如何使发酵过程中所产热量及时排出，避免料层温度升高而影响菌体的生长和杀虫蛋白晶体等合成，需要设计科学合理的应用于苏云金杆菌的固态发酵设备. 压力脉动发酵[38]、全自动固体发酵系统、转鼓发酵、传送带移动式等发酵设备也在不断的研究和应用中，但目前适于大规模固态发酵的先进设备仍然缺乏，成为限制大规模固态发酵生产苏云金杆菌制剂发展的瓶颈.４ 产品的剂型 苏云金杆菌制剂常用的剂型包括以水为介质的水悬剂、以有机溶剂为介质的油悬剂和以固体填充剂为介质的可湿性粉剂. 近10年来还开发出了水分散性粒剂和胶囊剂等新剂型，已投入使用. 应该根据防治对象和所处生态环境选择方便储存和使用的剂型. 与化学农药相比，苏云金杆菌制剂安全性增强，但产品的稳定性差，残效期短，杀虫速度慢，而且受施用环境影响大. 解决这些问题除了使用合适的剂型外，还可以添加一些辅助剂. 为了增加田间残效，目前使用的辅助剂包括由液态发酵产品制成粉剂所需的吸附剂、使菌剂在表面展着的湿润剂、防止芽孢萌发和其它微生物生长的防腐剂、促进昆虫食欲的引诱剂、防紫外的保护剂，还有粘着剂、乳化剂和增效剂等[2].５ 存在问题及展望 苏云金杆菌制剂作为微生物农药，要取代化学农药，除了依靠人们生态意识的提高，更要从技术上达到高效价、低成本、规模化，从选育菌种、降低培养基成本、提高发酵控制水平、减少后处理过程中毒效损失等各环节优化.在发酵及后处理过程中，液态发酵和固态发酵存在各自的优势和缺点. 液态发酵的流动性好，有利于传质、传热和控制，但液态深层发酵在溶氧技术和设备方面还有改善的潜力，气升式反应器有望用于苏云金杆菌大规模液态深层发酵. 除培养基成本外，发酵液的后处理是制约苏云金杆菌液态发酵生产的重要因素之一. 常用的工艺是吸附−压滤法，加入大量碳酸钙作为吸附助滤的载体，占产品质量的80%∼90%，造成产品效价低、体积大. 还可采用离心、沉淀的方法，但离心工艺需投资高转速的离心设备，且上清液流失了很多有效成份，要求回收. 沉淀法简单，但回收效果差，污染环境. 加强发酵液后处理研究，提高有效成份回收率对液态深层发酵具有重要意义.同液态深层发酵相比，苏云金杆菌固态发酵以麸皮等为载体，发酵后可直接进行干燥、粉碎，步骤简单. 固态发酵在后处理过程中节省了能源，但产品存在湿润性能较差的问题. 国内大部分厂家使用麸皮为主原料，麸皮既是碳源，也是发酵载体，但麸皮粘度大，不利于通风散热，且亲水性差，导致有的产品湿润时间高达十几分钟，达不到三分钟以下的部颁标准. 需要寻找新的、廉价的、营养源丰富、通气好、湿润性能强的原料和载体，或选择合适的表面活性剂处理产品，以使在不影响发酵水平和毒力效价的情况下缩短湿润时间. 苏云金杆菌固态发酵的发酵工艺和设备目前普遍的状况是生产规模小、设备简陋、劳动强度大，由于人工操作造成产品质量不稳定，发酵过程产生的热量不能及时排出而影响了菌体生长和伴孢晶体的形成. 固态发酵正在逐步从浅盘发酵向深层发酵发展，从浅盘式半开放式发酵逐步发展成为全封闭、全自动固态发酵，生产过程逐渐实现计算机在线控制，有效地解决了固态发酵过程中的供氧、散热、湿度调节、防止污染等问题. 在物料准备、蒸料、接种、发酵及干燥等方面，采用连续蒸料、接种，使用洁净封闭式固态发酵设备，发酵、烘干过程在同一设备中顺序完成，形成完整的自动化生产流水线，可以大大改善生产环境，消除人为因素对产品质量的影响，提高产品毒力效价.苏云金芽孢杆菌液态发酵与固态发酵各有优点，应因地制宜地选择生产方式. 预计在今后一定时期内，苏云金杆菌的液态发酵与固态发酵将共存.参考文献：[1] Schnepf E, Crickmore N, V an Rie J, et al. 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苏云金芽孢杆菌LY30菌株对棉铃虫毒性的研究
苏云金芽孢杆菌LY30菌株对棉铃虫毒性的研究
许禔森
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2008(036)013
【摘要】[目的]研究苏云金芽孢杆菌LY30菌株时棉铃虫的毒性作用.[方法]初步比较LY30和HD-1菌株的形态特征、生理生化特性,并采用生物测定的方法,比较它
们对棉铃虫初孵、二龄、三龄幼虫的毒效差异.[结果]LY30属于H3a3b3c血清型、kurstaki亚种,主要由135、66kD2种蛋白成分组成,在菌株生长形态、发酵培养特征、生理生化特性方面与生产菌株HD-1差别不大.LY30菌抹发酵液对棉铃虫初孵、二龄、三龄幼虫的LC50分别为0.32、0.62、2.58μl/ml.[结论]LY30菌株对棉铃
虫三龄以下的幼虫具有高毒力.
【总页数】2页(P5505-5506)
【作者】许禔森
【作者单位】德州学院生物系,山东德州,253023
【正文语种】中文
【中图分类】S481+.9
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苏云金杆菌对哺乳动物的毒性
苏云金杆菌对哺乳动物的毒性奄主春1包,香7jL.口南弛劝.徽.;麴{《农药译丛第十八卷第二期(1996年)一苏云金杆菌对哺乳动物的毒性韭鱼编译'5IZ昆虫的细菌性致死痫原中,苏云垒抒荫(.日..:3"rF蚀下简称B.{)被认为是毒虫群体治理最富潜力的种类.B.t.为革兰氏阳性,杆状并形成内生孢子的细菌,产生具确杀虫性的内质粒毒素.各种 B.t,亚种的基虫括性和其类孢体的蛋白晶体有关,这些蛋白晶体在细菌孢子化时形成的.从本质上讲,这些鼎体是原生毒素,被昆虫吞食后洛解并致活昆虫消化系统的.i肠内是硷性条件,毒索进入后与中肠上皮细胞膜作用,致使细胞溶毡,最终幼虫死亡.以前的毒性研究别不同接触逾径l{0.的安全r1:评估表旧B.t.是昆虫致病原,实际上刈哺乳动物元.:,但未经商剂量毒肚测试.在B.商晶制荆的施用中,Siegel证实Bt. 制刹(禽B.t.i∽on,is亚种)划大鼠的安全性,大鼠口服4×10微生物/每鼠或肺接触2.05×10微生物/每鼠.肺接触后测试微生物的清除,从处理动物肺组织回收活的细荫表明具有独特的清除模型,时间长这7天.任相同的研究中,用苏云金杆苗]szselens~s 亚种高剂量(34×10微生物/'01毫升j驻脱注射无胸腺小鼠,结果死亡率明显,自腹瞍注射后从存活小鼠脾脏中回收细菌的时间长达7用.然而当采用不同的商品制剂(2.5×10微生物/每鼠)进一步试验,无论是无胸脒或胸腺正常的小鼠都未见死亡,表四上述死亡是由于除{{'』外的删荆成分或者是由于特种毒素的存在而不是内毒素或一外毒素所引起曲.最近用纯的 B..制备物进行研究,结果表明并无特异毒性导致测试鼠的死亡,无论是舁腔,静脉或腹腔接触.采用B.t.的几个品系和种类测试,如晶体蛋白,细菌生活期营养期戏孢于,鞭毛,觏牲大小雨『数量或者甜菌毒崇或组份,有呵能说明这些毒性的差异.B.t.-dza~vai皿种商品制剂Oha1]enge在最小感染量(912×1O>菌形成单位(以下简称aF0)/每小鼠)和高剂量营养细胞制备物(9.12×i0(FU/每小鼠)测试的任何剂量都不引起死亡,而含B.'.KⅡrs七aki亚种6O届孢于和50莳养细胞商刹量制备物(1.02×10.cFu/ 缸小鼠尉引起死亡.这些研究的结果表明所见到的死亡可能与生长柏营养期有关也许前孢予化蛋白质,但不是杀虫活性晶体蛋白质,也不是鞭毛或孢子.一定程度上,肺接触后的毒性和致死性似乎与菌株有关,因所用剂量的因素而把物理性阻断排除在外.虽然以前的巨研究证实B.t刘喻乳动物的安全陛而在人体上襄有一定的作用例如Bt.设疑为限癀嗄,另有报道认为B.t.对实验室意外伤害有关的副体州m责汪.泼病原件在后一般逍中意为"侵染过程,可能是一种细菌而不是B..B,t.mc]c妇亚种的完整体对经口暇或肠胃处处理的小鼠相对无毒,然而用一些硷溶l体制备物汪实妊有毒的.进一步研究表明当腹膜注射处理时,可溶28KDa晶体多且5=仅对小鼠显示毒性和致死作用.从B.t.isr,%e]envois砸种中分离不出对喻乳动物有特异毒性的成S?份.早期用B.t.fharingien~is亚种生产的B..制剂,不仅含有一内毒素,还有热稳定非蛋自索一外毒素,对家掘显示特异毒性,对非靶标生物包括j『}『乳霸物d三有广泛的毒性.建议的作用机制是卢一外毒素通过抑制RNA聚合酶而制约RNA旧台成在哺乳动物中.卢一外毒素表现出阻断核蛋白体的RNA的合成.近期的研究'正实卢一外毒素急性接触的毒性.用大鼠试验急陛口服IDo约为170毫克/千克.虽然皮肤接触,口一外毒煮对大鼠和豚鼠的毒tf较小.但对免皮肤却是设高(0.4毫克/千克.总而言之,按测试动物和接触途径不同,卜外毒素毒洼级别为中到高毒.固此应该重视在美国食品上农药使用条件的注册,B.t有效成份应该测试表明不存在一外毒索.表1i989前提交的卫t对哺乳动物毒性数据总结Bt.亚种所宄/动物=一D53/Lc60未见任何咋用*最量B.tseleusis互J砷急性Ⅱ温太士泉急性皮肤士鼠腮剌鼓急牲啦A大鼠管内3々月喂饲太氨Btiurstaki亚种急性口强太鼠急性皮肤大鼠暇划徽急唑^太鼠13周跟l强喂)90玉:】眶'2拦慢性饲★鼠^娄口服研究5男,5女>2.00×1(]0跫予/每动物>2.67克/=克1.20×1u1J孢子/千克23×l0孢子/千克>2000毫克/千克(4.6x2(,lo孢子/千克) >628克/王克最有提供8.0×107孢子/每动蜘无侵染生无侵絷性/致病性无侵染性/致病性无浸染性/毒性来见任作用无侵染性4克/克/天,3十月无毒眭>4.×l孢子/干克无侵染性/毒性>3.xl0"子/干克侵枭性/毒性O.】毫升(直接施用品)无角艇不透明性>5.4毫克/升26×10孢子/升)无侵染/毒性13×1拖子/千克/天无侵荣性/毒性8.4壳/千克/天84克/千克天雌鼠臼10~104胃内体重增量降低.无侵'/致病性.1克(1x10"确生裔力的孢子)/Se,连续3天.全血培养孟但口服30天后,一半^显毒有有生命力的B.9尼近对B.t.内存在的了解较少的热不稳定外毒素,及与其有关的蜡状芽孢杆荫的腹泻毒素的资料进行了综生.综述的目的是对美国环保局(EPA)所拥有的人类和实验动物毒性数据进行总结,支持以 B.t.为基础的微生物农药的注册.该总结追溯早至1958年,与第一个B..亚种册作农药使用的时间一致.本综述进一步的目的是证实从近期要求曲哺乳动物毒理学的研究结果与B..以及其他芽孢杆菌对人类健康卫生的潜在作】_¨自结论有什么样的关系.避面.讨论从至少是一些 B.t.亚种的毒性测试进一步支持现有资料基础的可靠性,目的是为了弄清楚分类菌株相似性和腹膜注射筛选所证实的没有副作用这样的事实.系统毒性按"联邦杀虫刹,杀菌剂和杀鼠剂法规(F~FRA),EPA的"官方农药计划"(oPP)有权确保商品农药使用结果不应该产生对人类和环境不合理灼创作用.由于B..杀虫剂是属于被开发的第一个微生物杀虫剂,而芽孢杆菌属包含有啸乳动物致病的炭疽芽孢杆菌(如.mrcs)干B食物传染致病原有关的蜡状芽孢杆菌,因此在注册和商业化前必需剥其进行广泛的毒理评价.然而当初大部分毒性测试是建立在当时针对常规化学农药注册的广泛要求之上的.美国 B.t.第一个商业品种在1958年进入市场,并供田间试验.1961年,B.t.t】1B?'一IrLgiensiS亚种用作防治敏感肟鳞翅目害虫的杀虫剂.自那时起,其他B.t亚种也被注册用于害虫防治.具前为止已注册的B..亚种包括aiza,wi,israe]onsis和len~brionis(相于San山ego亚种),不同f阿亚种分别显示对鳞翅日,双翅目和鞘翅日害虫的主要杀虫活性.1982年,确定了不多的哺乳动物毒理学研究的要求.并公布了"农药测试准则,M分册:生物农药测试准则":,辱性资料的要求以阶梯式层次测试系统构成,因此重点放在认为对健康有相毒害的评价所必须的研究项耳上.这些研究采用固定的剂话和各种接触造径l服,肺,眼,皮肤和腹膜处理),目的是在实验动物身上产生可观察到的生物效应.如果在阶梯I水平上观察到有意义的尉作用,那么就需要进行阶梯II研究,以提供对毒害的估测.如果在使帮模型中存在预期的人类接魅频率和水平有关的阶梯I进行的亚急性研究结果表明副作用的可能,则需要延长和重复慢性接触研究阶梯ⅡI)以测定其潜在毒害.提供给EPA评估人类健康潜在毒害干¨支持各种Bt.亚种第一次和以后}1:册所需的毒理学资料t1989年前)(表1).最新的毒性/致病性研究要求1989年.EPA出版修订的微生物农药测试研究准则.新的研究反映最近的要求,研究的设计是为更适应评价徽生物农药对人类健康的潜在作用.通常要求三琐急性毒性研究,代表条接触途径:L『19E,肺接触和静脉注射(腹膜注射用于较大的微生物).注册必需进行这些研究,然后出EPA评价.在支持微生物农药注册的毒理学资料的基础上,EPA 确定是否存在任何有意义的与人类健康有关的问题,否则就需要增加列其他嘘乳动物的毒性或传染性资料.0-新的研究测试中,接触测试以"菌落形成单位(OFU)计算表示.一个菌落形成单位定义为一个单独在适当盼半固体生长培养基上能产生一个菌落(肉跟可见的苗群)有生命力的繁殖体1989年前研究中采用的剂量水平,有时候以处理物质n0熏量列动物或人体重量定量的,同对以或不以计量的物质中含有生命力的孢子数定量的.在有一些试验中,剂盈以孢子数j_J算.?.达10孢子/每动物,并无可见作用报道.遗的址C.FU/每动物和克/ 千克体重之'!关系}没=f]由注册提供.然mJ对于大多数翩备物来说,它们的有生缶力的繁'体近常在10N10aFu,/克范固之内.目前需要进行的急性毒性/致病跫研究中,有效的微生物成份一次高剂量(≥l0～≤1cFu/每动物)接触小鼠或犬鼠.投药处理后,无死亡牢,测定动物体重变化,临床毒理症状t笼边观察),肉暇进行尸体检验来评价测试动物以及弹估测试动物对该微生物的肯豫模式.最后定期从动物的一些器官,组织琅1傩液中计数泼微生物.可以幂用几种方法证宴清除摸式髓器官和组织的移除和间质化,然后稀释,标准平板计数能显示聚佳结.如此一个清除摸式的确立可以证实涮试动物在微生物处后的全部免疫系统的能.此外,比较在最初投入(零时问)j}!f量中微生物数量时,从适当的器官和组:取回盼生命力的OFU肟数量,可以证实繁殖体侵染的存在或不存在.为了允整介绍全部资料要求干¨微生物农药研究的愿始报告,请参阕"微生物祁生物化学害物控制刹测试托『苦一M分册急性口服毒性致病性研究直至1989年前所提交旧急性口服毒性资科没有证实B.t.亚种在特殊剂量剥哺乳动物的副作用或侵染病症(表2).大鼠口服4.7×10孢予/千克体重(B..Kurs~ukit种)没有产生任何有毒副作用或侵染病症.对动物详尽的观察,包括死亡率,临求癌症,侵染性,取食盈,体重变化,肉服验尸,有些还进行组织痴理检查,血液和其他器官及组织进行堵养,是否有具生命力Bt.:在.表2各种B.t.亚种急性口服毒性比较Et.:izawKllr{】Ⅲr【JnteJ1b一1'(JAI1go!lebri,z,nisWP:JI1cFU,{'物J00[:～6～×10…C每犬氲>5克/二二电:太虱)>2×10UFU,'fl丈鼠>5立/千克鼠)TGAI,工强有效份,包括细l曼醅体物f!-.¨"Wp,;Jill性粉,制弃包含工业级嬗成偿以及r口A的惰性成}.以前测试微生物清除,而在最近急性口照研究中,在投药和测试存在试验微生物的材料后.要求多次收篼试验动物的粪便,测试微生物的清除率.微生物清除资料袁凹 B.t 迅速运过消化连祓完全清除.虽然在脾脏,盲肠和小肠偶而检测出少量∞J{_t.,在研究过程中数量逐渐降至检测水平之下.除此之外,在研究中十分明显I]服微生物制刹,t存在的范埘限制在胃和肠消化道内,并不系统地分布在动物体内.急性肺毒性致病性研究1989年前提交的急性吸入资料是支持各种Bt,哑种注册的,通常都能表明吸入接触耐无副作用.倒如当用B.{.Kurs~ki骱途径处理大鼠(在接触室内喷射释放孢予)浓度5.4毫克(2610孢子)/升时,观察无副作用.近期在气置史或鼻腔内投药的测试报告表明,在肺接触后对各种 B.t.亚种从肺清除的～般模式中是有关系曲和有用处的.例如,在投药后l小时,从孙,血液,淋巴和肾分别能回收到有生命力的Bt.:'Azawai亚种的CFU,但增量下降.投药后l天,在肺,血液和淋巴巾OF0的数量明显下,虽然通常表明一个明显的清除模式,但处理动物在21天试验结采时,没有从肺部完垒啦珐泼细菌.雀更后囊自取样中有可能弄清除2l灭测试的关系.当小鼠接触 B.t.Kurstaki亚种,枯芽孢抒菌和球形芽孢杆菌时,可既察到相似的清除澳式.在1天内可从淋岂,髀脏中回收到球形芽孢杆菌,7天时在这些器官上的微生物被完全清除掉.在本研究中,其池所有的器官上都呈阴性.静脉毒性/致病性研究现在的要求需进行急静弥毒性/致瞒性研究,以支持B.t.产晶的注册.静脉毒性研究∞目的矩当不考虑皮肤耐,提供潜在健康作用的最大有毒资科.一次高剂量(IOrCFU/每动物)处理后,记录观察进一步的作用和死亡率,然后是微生物的清赊速率.全部处理动物(包括投药后存活和死亡的)都一起验尸,全用肉眼观察病理变化并进行记录.在静脉注刺后,各种以 B..为基础的农药种类的有效微生物成份,都表四鼠器官和组织的通常涪陆投式.例如,大鼠用B.Is~'aelensis-!lz种处理,l天后从血菠其他全部器官中都能回收有生命力0Fu.4天后,在肺,肾,淋已,血液和脑中可见细菌下降趋势一般,15天后OFU可见总数大幅度降低.虽然在天时,从脾脏f1回收的有生命力的OFU数赶有所增加,在57天时(最后的取样测试日期),试验动物能处和清除来自脾脏和肝脏的设大部分按种物.用B.t.Kur,s%ak~亚种处理大鼠时,也储观察到类似的清除模式.静脉注射处理时,有生命力的CFU心收数量的峰值在第8天,然而在6O天时明显下降,在100~128天内数量继续下降.用枯草芽孢杆菌或球形芽孢秆蔺处理大鼠,也显示相似的清除醭式,在36天和49天时处理动物能分别处理和清除大多数器官上的极大部分秆菌.腹膜毒性,致瘸性筛选美国]fiPA要求新近注册的Bt.有效威份进行啦膜注射筛选.在测试中,小显(6雄5 雌j用含1O,10和10aFU的B.t有效活性成份的材料(孢予,晶体蛋白和发酵固体物j往射.在投药这一天内多次观察全部小鼠,然后每天观察共7天,记录死亡率和致病或中毒的矗床症状.Bt.aizawai,israelensis,Ku:':j或fenebrionis亚种∞工业品制剂腹膜注射小鼠,剂量1,10OFt/每小鼠,未见毒性或致病性.8izawai亚钟的2个菌株,剂量10CFu/每小鼠,一次髅礁注射,未见死亡率.1OOFu/每小鼠高剂量处理动物只有中毒症状,包括5个处理雄小鼠中有3个脾脏轻微肿大.is.,s.e~ensis亚种5个菌种只有1个菌株在10saFU剂量时,引起]00死亡.而其他4个菌椿无死亡.用B.Kur8Ii亚种腹膜注射小鼠时,见到不同的死亡率变化,目前注册灼6个菌株中有3个菌株jL见到有意义的7O～100的亡率,大多数死亡发生在投药后开始到2小时之内.临床观察包扦驼背姿势,活动增加,毛盟糙,水肿,腹部过敏和眼皮闭台等.验尸奏明处理的小鼠腹部脓肿,脾犬,肾变色,肺出血.其他3个Kurs*aki亚种的菌株未见毒性症状.0?表3用卫.t.腹膜注射小鼠的结果砷;离茁摊代号l死亡敬/总数1死亡盥t%)亚种分离菌株代号.死亡敏/总数l死章?%一IIlo/zo10KnrstakiII7.0IIIl叭o{oIIo/lo位bl0LlII【01i00ii1IV1』100VV o/lo0VIV.]./l.l¨0tei,ebr!oni9I!I每小茳觅0Fll.¨toubH.n日亚砷的'~ij.11u毒后,再注射.,,来见死亡.B.t.*onebzionis亚种注射小鼠,死亡率也有差异.2个现注册的菌株,仪:1个荫株产生明显的死亡率<7o)且大都分死亡出现在投药后4小时内.中毒症状包括疆部过敏,腹艘炎,小脑扩张,充血和碑脏痈灶.然而同样的B.t.tonobrionis亚种的制剂高压消毒后,再注射动物,未见死亡.其他急性毒性在提交EPA的许多研究结果中,B..亚种处理完整和受伤的大鼠皮肤,束见死亡或体重增量,肉跟瘸理学正常虽然B.t.(~000毫克/千克j一次接触兔皮肤,从未报道有毒-也未见有任何轻微到中等程度的皮肤刺激.例如,兔背蒯光毛,用B.t.aizawM亚种(2020毫克/千克)和B.t.tenebrionjs亚种(4.8×10孢子/升)处理,仅引起轻微到中等程度的皮肤刺激(如轻微红斑和水肿),处理后13天消失.然而在一次研究中,B.t. .tTfleb'donis亚种25O0毫克/千克处理去毛兔背皮肤.未见任何作用.用【{_t.1rs~ki 亚种弛子或Thl1Ticide32B:古B.t.Ktlr~a.id亚种孢子——晶体复台体为有效成份的产品j处理兔皮肤,浓度分别为2000毫克/千克或34×10"孢子/千克,未见任何皮肤刺激理象.综合考虑这些数据,可见各种B.t.亚种急性皮肤接触列哺乳动物无侵染性致病性或毒性,在大多数情况下,仅见温和的刺激反应,而这可能是由于粘附于皮肤的测试物质j 去除或由于添加于制荆中的惰性废份所日l起的.如皮肤接触,兔鼹接触各种B.t.亚种也可见轻微到温和的刺激反应.大多数情况下, 仅现察到轻微的刺激反应(眼发红,7天内消失,角膜丝毫没有异常.除了处理动物的结膜产生水肿和轻微的溢液外,未见其他的眼刺激反应,而且大部分可能观察到的效应与测试材料中的微生物成份无关.测试的物质常常是干粉,观察到的效应可能是由于材辩的物理性能所【起屿,尤其是由于未要求洗眼,或接触时『H]达24小时.这些研究结果不支持早期认为B.t.是导致躁病的报道.在现有的全部硪究结果的基础上,EPA现在对含有以微生物为有效嵌药成份和发酵物质的工业级产品,不要求急性皮肤毒性或急性皮肤和眼刺激研究资料.过敏事件的报道对微生物的农药产品并不要求过敏l曼应(如皮肤敏感反应)曰}究,由于用外来蛋白质成份注射进入实驼动物(如豚鼠)体内的注射诱发乖j异常症状,可以预期毒产生阳性反应.另外,用有效微生物成份局部诱发和异常症状可能极大多数会导致阳性反应.而且这类反立t'与发酵产品的系筑试聆有关连,从导致这样一个结论,那就是必需报道微生物霞药在生产和使用r}观察烈的过敏性反应,对潜在的苊害有足够的防范.尽管j{.t为主的产品得到广泛的应用,但向EPA报告的只有2敬l口J能的过敏反i}例.剥第一次过敝刨,EPA曲结论是,接触者个人极大可能是因前诊斯.～:f0痰(如K8wasaH综台痖比)所致,面与 B.t.无关.第二次事例,具体个人以前有食物过敏的史.岳接赫{.t为主产-后.1人立即开始呼吸困难.啊阎,t端和咽喉发牟及外充血.个人袋虫『B.t捌刷都涉2食物过敏的一些物质,如特殊的碳东化台物和一些腐剁对l{..制刹的证述.EPA农药计划部健廉卫生作用局认定&巷产品不发生污染垃剧生B..就不是痈驭体.关于近期测试方案的资料的意义在19S8年,B.t.1i册标准由RPA出版,用作所谓B.t.的资料系统,此评述B.t.为主能产品及其注册标准.并为"联邦杀虫荆,杀菌剂杀鼠刹法规"所同意."农药计翘鄙要求泣曹沤们的蛙近f:册的B..遵守新的分类资料要求,瞰为在以前野多年注册的B.. 效峻借,:部分￡有旧分类资料基础的支持.另外,小鼠腹膜毒性/致{性筛选,以倚作为急i毒往哺乳动物研究的桥梁,井支持B.t.有效成份的注册.如果腹聪测试不能显示任何不寻常的毒件或致痫性的话,在以前,接受这些测试并不要求;(他的哺乳动物毒性测试,支持了Bt产品的注册.这些结果叉台情合理地进一步支持I均或类似糟B.t菌株旧注册,不要求其他的毒性测试,只要证实这些产品f刚寺性资料新菌株那些以前注册旧亚种的菌株是棚似的.如未能提供资料,或腹膜筛选的结果与无致病性的结论不一致.那虢必需开发进一步的哺乳动物毒理学数据.E册的B亚种通过各种接触造径(口服,肺,皮肤,静6隶)测试的毒理学和生物学效馥的资料相当多,并可提供.大部分提供的哺乳动物毒睦数据可以允许下这样的结论,所捌试的B.亚种对晡乳动物无毒盛无致病性,包括对人类.还有尽管B_.广泛地用作农药被广泛接触?,但至夸束发生对人类致病或中毒的事例.因此,值得考虑对毒性/致病性资料的要求璺可以有所变化,保证新的有效的B..分离菌株的注册.例如,如果新的菌株被正确地鉴定为现有的注册亚种,那么也许腹膜注射筛选将是以完成其毒理学资料的要求.这种电电可能扩大适用于柏草芽孢杆菌和球形芽孢杆菌.B.已知璃繇或致绢的芽孢杆菌种类(如蜡状芽孢杆悄或炭疽芽孢杆菌)密切的分樊学∞关系表明,至少应该具有最低限度的实验动物毒性资料.为确认腹膜注射筛选评价Bt毒性积致I计的可能的关系,以EPA为主的研究工作现正在进行之中.一篇彳『是文献的论述显然限制了腹膜注射测试和非特异毒性的关系,如赢剂量(如1Oe做生物/每动物)处理时观察到的死亡率.通过肺接触和静脉注射,该商剂量的死亡率以前乜注意到,研究总结见本文.这些死亡率代表了对实验室鼠类非特异毒性的上限或限度.另一篇值得研究的文章是腹膜注射前温度对B,{.制剂的作用,评述了对热不稳定毒素可能的关系.从特异性毒性/致病件研究的总结资料巾可以得出一些结论.从清路数据的分析,显然在可能得出关于每种细菌通过寄主的过程前,静脉或肺接触后完全清除是没有必要的,确立.4.清除臻式只需足够长时间的研究就可以了.此外清除的简图也特别相似,无论是细菌以鼻腔,～管进入实验动物,这进一步支持荚国EBA的研究结论,EBA确认这些接触途径可以替代空:接触.关芽孢杆菌的一些研究结果表明,大鼠口服处理后,有效的微生物戊份能透过胃和肠遭的障碍后侵发病,系统地出现在测试动物的组织,器官和血液中.超对lB.t.分离菌株而言,当然是不希望出现的.从组织或器官(10.一10FU/克组织)分离出的细菌的数量变化,经常不是简单地由于试验动物从空气中的孢子的进一步再染菌,或由于在试验操f1中的样品污染.类似的再染菌有可能扰乱了肺和静脉注射研究中测试微生物清除的解释,因此重要的是在这些研究中尽可能降低动物饲养室受芽孢杆菌的污染程度.总结研究结果肯定了近期美国EPA在鼠类体内微生物致病性评价报告代表一个有用的模型,在该模型中,一扶高剂量微生物处理,完整的免疫系统的反应可对侵染性下一个结论.死亡率,体重增量,临床症状和验尸等观察结果足以支持关于毒性的结论.对B.t.各种亚种,枯草芽孢轩诸和球形芽孢杆菌全部研究结果都清楚地表明,所测试的苗株对鼠类都是无侵染性或无致病性的不过高剂量(≥10CFU/每动物)处理中能发现中毒而死亡的现象,然而是否是由试验材料的特异效应目前还不能下结论.来自实验室的信息,结合人类广泛使用c而染病的报道缺乏,关于这些有效微生物农药成份对人类的安全性显然有争论."生物农药测试准则显然提供了相当的估测资料,关于用作农药或接触对人体健康的作用或后果.此外,EPA农药计划部确信近期认可的毒性/致病性研究将会继续提供}l|芽孢杆菌类有效微生物成份的安全性的有关资料.。
苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种选育和制剂研究的开题报告
苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种选育和制剂研究的开题报告题目：苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种选育和制剂研究一、研究背景和意义苏云金芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，其在工业生产、农业、医疗等领域均有广泛应用。
近年来，研究发现苏云金芽孢杆菌的毒力较强，可用作生物农药、生物防治等方面的原料。
因此，针对苏云金芽孢杆菌高毒菌株的选育和制剂研究具有重要的理论和应用意义。
二、研究内容和目标本研究旨在通过苏云金芽孢杆菌的高毒菌株菌种选育和制剂研究，深入探究其毒力增强的机理以及其应用于生物农药和生物防治中的潜在价值。
具体研究内容如下：1. 筛选苏云金芽孢杆菌中毒力高的菌株；2. 建立苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种增殖、分离和纯化技术；3. 研究苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种代谢产物的结构与功能；4. 研究苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种的生长环境影响及适应机理；5. 研制苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种的生物农药和生物防治制剂。
三、研究方法和技术路线本研究采用实验室筛选法和分子生物学技术结合的方法，通过菌株筛选、培养增殖、分离纯化等方法研究苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种的生理特性、代谢功能及生态适应等问题。
具体技术路线如下：1.苏云金芽孢杆菌菌株筛选：通过对不同来源、不同环境条件下的菌株进行筛选，达到获得毒力高的菌株的目的。
2.菌株的增殖、分离和纯化技术：采用传统培养和高密度发酵技术等方式进行大规模菌种增殖，采用菌落计数法和电子显微镜观察等手段进行纯化和分离。
3.代谢产物结构与功能研究：采用NMR、MS等技术手段对不同培养条件下的代谢产物进行结构鉴定，并进一步研究其生物活性及应用潜力等问题。
4.生长环境影响及适应机理研究：采用高通量测序技术对不同生长环境下的苏云金芽孢杆菌高毒菌株进行全基因组分析，研究其生态适应机理。
5.生物农药和生物防治制剂的研发：通过将苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种提取并制成不同类型的生物农药和生物防治制剂，探究其在生物防治领域的应用潜力。
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苏云金芽孢杆菌毒性研究作者：李依韦尹萌萌袁琴来源：《安徽农业科学》2019年第20期摘要以菜青虫为试验材料，用苏云金芽孢杆菌浸泡过的小白菜饲喂菜青虫，提取菜青虫体内的伴孢晶体，通过生物测定法对苏云金芽孢杆菌的毒性进行研究，并对出发菌株进行紫外诱变筛选高毒性菌株。
结果表明，苏云金芽孢杆菌毒性與伴孢晶体含量有关，伴孢晶体含量越多，毒力越高;紫外诱变16min时得到菌株B16，伴孢晶体含量比出发菌株提高8.2%，杀虫效率比出发菌株提高77%。
该研究为苏云金芽孢杆菌生产高效率生物农药提供菌种。
关键词苏云金芽孢杆菌;伴孢晶体;毒力测定;紫外诱变中图分类号Q939.96文献标识码A文章编号0517-6611（2019）20-0159-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.042开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Toxicity Study of Bacillus thuringiensisLI Yiwei，YIN Mengmeng，YUAN Qin（College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）AbstractCabbage caterpillar were used as research materials in the experiment，which was fed cabbage caterpillars with cabbage soaked in Bacillus thuringiensis.Parasporal crystals from Pierisrapae was extracted，study on the toxicity of Bacillus thuringiensis by bioassay and screening of highly virulent strains by UV mutagenesis of the starting strains were done.The results showed that the toxicity of Bacillus thuringiensis was related to the content of spore crystals，the more the content of the accompanying spore crystal，the higher the virulence.The strain B16 obtained by UV mutagenesis at 16min raised the content of parasporal crystals by 8.2% compared with the original strain，insecticidal efficiency raised by 77% compared to the original strain.The study provides strains for the production of highefficiency biological pesticides by Bacillus thuringiensis.Key wordsBacillus thuringiensis;Parasporal crystal;Virulence determination;UV mutagenesis在农业生产中害虫防治是一项重要任务，随着人们环保意识的不断增强，生物农药正引起广泛关注[1]。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）制剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，是目前用途最广、产量最大的微生物杀虫剂[2]。
利用苏云金芽孢杆菌生产的生物农药在农业生产上应用最广、产量最大[3]。
对100多种害虫有致病和毒杀作用。
针对目前苏云金芽孢杆菌残效期短、杀虫谱窄、见效慢的问题，筛选高毒力菌株以提高苏云金芽孢杆菌生物制剂的杀虫效果成为研究热点[4]。
笔者对苏云金芽孢杆菌进行紫外诱变，筛选得到高毒力菌株，为以后生产高毒性生物农药提供菌种。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种。
苏云金芽孢杆菌（内蒙古民族大学生命科学学院微生物生物技术实验室保存）。
1.1.2菜青虫。
在室外人工种植小白菜，使其自然生长，定期进行观察，会有虫卵出现[5]，均采用菜青虫幼虫，其体征表现为青绿色，体圆筒形，中段较肥大，背部有一条不明显的断续黄色纵线，气门线黄色，每节的线上有2个黄斑。
密布细小黑色毛瘤，各体节有4～5条横皱纹。
1.2试验方法1.2.1苏云金芽孢杆菌生长曲线绘制。
将纯化的苏云金芽孢杆菌单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养1 h，此时测得细胞浓度为93.9%。
取此培养物接种于LB液体培养基中振荡培养。
分光光度计在600 nm波长处每隔2 h测定吸光度，绘制生长曲线。
每次测完吸光度的菌液番红染色，显微镜下观察伴孢晶体[6-7]。
在伴孢晶体出现期间，每隔2 h从菌液中取8 mL菌液于离心管中，离心管命名为E11、E12、E1 用于后续测定伴孢晶体。
1.2.2伴孢晶体制备。
配制溶菌酶溶液500、250、200、100 μg/mL，各取200 μL分别加入含有1 mL菌液的离心管中， 20 min后染色镜检观察细胞的完整性。
选择500 μg/mL的溶菌酶制备孢晶混合液。
在“1.2.1”中每隔2 h取培养物加入配好的500 μg/mL溶菌酶溶液1 mL，溶解20 min后 -20 ℃冷冻30 min，取出立即放入40 ℃水浴中温浴15 min，反复冻融3次，即为孢晶混合液。
将孢晶混合液高速低温离心20 min，棄上清，蒸馏水悬浮沉淀物，振荡使悬浮液产生大量泡沫，弃去泡沫，重复几次，直到产生很少的泡沫为止，重复此操作2次后收集沉淀， 40 ℃烘干得到淡黄色晶体蛋白粗提物，即为伴孢晶体[8]。
1.2.3苏云金芽孢杆菌毒力测定。
1.2.3.1不同培养时间出发菌株毒力测定。
通过叶片浸泡饲喂法，在菌液培养到22～30 h时，每2 h取菌液进行毒力测定，将菌液依次命名为A22、A24、A26、A28、A30。
将新鲜的白菜嫩叶切割成3～4 cm见方的小块，并用刀背在叶片上划成纵横交错的刻痕，然后浸入菌悬液中，使叶片各部分比较均匀地接触菌液然后取出，阴干，最后放入养虫瓶。
不同时间菌液各放入菜青虫（2～3龄健康幼虫）9头，室温下培养，每天观察死亡情况，根据下列公式计算死亡率并进行分析，筛选苏云金芽孢杆菌产生毒蛋白的最佳时间[9]。
死亡率=死亡菜青虫数供试菜青虫数×100%校正死亡率=处理组死亡率-对照组死亡率1-对照组死亡率×100%1.2.3.2菜青虫肠道内菌群及其毒力检测。
为了验证苏云金芽孢杆菌导致菜青虫死亡，把杀死的菜青虫肠液取出接入液体培养基，30 ℃、220 r/min培养20 h，显微镜下观察。
继续培养至26 h，以“1.2.3.1”中方法和条件测定毒力，其结果与出发菌株毒力相比较[10]。
1.2.3.3紫外诱变。
将培养26 h的苏云金芽孢杆菌按照“1.2.2”方法制备孢晶混合液进行紫外诱变，诱变时间为12、14、16、18、20 min，编号B12、B14、B16、B18、B20，诱变菌液用于菌种筛选。
1.2.3.4诱变菌液毒力测定。
不同诱变时间的菌液按“1.2.3.1”中方法进行毒力测定，分别在12、24、36、48 h计算菜青虫死亡率。
同时对诱变菌液进行培养并按照“1.2.2”中方法提取伴孢晶体，每种诱变菌液设置3个重复F21、F22、F2 提取结果与出发菌株比较筛选高毒力菌株。
2结果与分析2.1苏云金芽孢杆菌的生长曲线由图1可知，0～8 h为迟缓期，显微镜下观察到此期间菌体形态细小且数量较少，8～20 h为对数生长期，此时菌体增大，数量急剧增长。
20～26 h为稳定期，此时菌体生长迟缓。
26 h后进入衰退期，菌体数量下降。
每2 h观察菌体形态，在培养20 h后芽孢开始出现，后逐渐增多，22 h有伴孢晶体形成。
2.2不同培养时间伴孢晶体含量由表1可知，在培养22～26 h，随培养时间延长，伴孢晶体增多，26 h时最多，为0.010 5 g/mL。
培养26～30 h伴孢晶体数量呈下降趋势。
2.3不同培养时间出发菌株毒力测定由表2可知，将各菌株浸泡过的小白菜给菜青虫饲喂后，杀虫效率经SPSS 22.0软件分析，杀虫率有显著差异（P<0.05）。
由图2可知，培养不同时间苏云金芽孢杆菌杀虫率不同，A26菌株杀虫率最高，即培养26 h的菌液杀虫效果最好，毒性最强。
2.4肠液菌株检测及毒力测定由图3可知，在同一培养时间下，菜青虫肠液内苏云金芽孢杆菌毒力比出发菌株低，与肠液内的蛋白对菌株毒性有减弱作用有关，这与邵宗泽等[11]的研究结果一致。
2.5诱变菌株毒力测定由表3可知，用诱变后菌株浸泡过的小白菜饲喂菜青虫，杀虫效率经SPSS 22.0软件分析，与出发菌株比较B16在不同诱变时间杀虫效果均显著高于其他菌株（P<0.05）。
由图4可知，B14、B16、B20菌株的杀虫率均比出发菌株高，但B16菌株杀虫效果最好，与出发菌株相比，杀虫率提高77%。
2.6诱变菌株伴孢晶体含量分别提取B12、B14、B16、B18、B20在培养26 h时的伴孢晶体，并提取出发菌株伴孢晶体作对照。
由表4可知，B16菌株伴孢晶体含量最高，为0.011 36 g/mL，与出发菌株相比提高8.2%。
3结论该研究利用苏云金芽孢杆菌毒杀菜青虫，并测定不同时间菌株的杀虫能力以及伴孢晶体含量，通过紫外诱变技术获得高毒力诱变菌株。
结果表明菌株毒力的强弱与伴孢晶体含量有关，伴孢晶体量越多，菌株毒力越强;筛选到一株高毒力菌株B16，其伴孢晶体含量比出发菌株提高8.2%，毒力比出发菌株提高77%，为以后苏云金芽孢杆菌高毒力菌株的选育提供理论依据。
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