苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白提取方法比较研究
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
通过对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化得到伴孢晶体。
经过稀释分成不同的浓度分别去检测杀虫活性。
关键词：伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌，纯化1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器设备和试剂超净工作台，高压灭菌锅，离心机，冷冻干燥机，-80℃低温冰箱，透析袋，移液管，玻璃棒，电子秤，养虫缸。
超纯水，0.5M/L的Nacl，生理盐水，5%的丙酮溶液。
1.1.2 研究菌株本实验室分离自病蚕体内的苏云金芽孢杆菌。
1.1.3 供试昆虫菜青虫。
1.1.3 培养基种子培养基[1]:酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaC1 1.0％，pH值7.0。
121℃灭菌30 min。
蒸馏水1000 ml，pH值7.0（用NaOH调pH值）。
发酵培养基[2]：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaC1 0.2％，MgS04·7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnSO40.005％，蒸馏水1000 ml。
调pH 7.5，121℃灭菌30 min，灭菌后pH 7.3。
1.2 方法1.2.1 种子液的培养在无菌的条件下，从保藏管中分别挑一环接种有种子夜培养基，30℃培养14 h。
1.2.2 菌株发酵按照3％的接种量转接500ml的发酵培养基，30℃，120 r／min培养60 h，镜检观测80％以上的菌体裂解时停止培养，离心收集提取晶体蛋白。
1.2.3 伴孢晶体的分离纯化[4]氨基酸可以3种形式存在，即带正电荷、带负电荷和两性离子，如在酸性溶液中带正电荷、在碱性溶液中则带负电荷。
若在某一pH 值下氨基酸净电荷为零，且在电场中不移动时，此pH 值为它的PI值(等电点)。
因为净电荷为零，净电斥力不存在，大部分蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度是最小的。
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展收稿日期：2007-05-16作者简介：吴洪福（1978-），男，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为蛋白质分离纯化。
E-mail:chenyang69@吴洪福1,3，郭淑元2，李海涛1，高继国1（1.东北农业大学生命科学院，哈尔滨150030;2.北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081;3.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094）摘要：对目前解析的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的三维结构进行了比较分析。
它们都有类似的结构，有三个结构域，结构域Ⅰ是由7个α螺旋以α5螺旋为中心形成的α螺旋束；结构域Ⅱ是由三个反平行β折叠形成的β棱柱；结构域Ⅲ是一个β“三明治”结构。
对这三个结构域的Loop 及氨基酸残基与杀虫活性的关系、与通道形成相关的杀虫作用机制的研究进展进行了综述。
关键词：杀虫晶体蛋白；结构域；Loop 中图分类号：S482.2+92文献标识码：A苏云金芽孢杆菌（Bacillus thringiensis ，Bt ）是一种革兰氏阳性（G +）细菌，它在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins ，ICPs ），对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生虫线虫等有特异性毒杀作用，而对人和家畜无害，不污染环境，在农林卫生害虫防治中应用广泛[1]。
杀虫晶体蛋白包括Cry 和Cyt 蛋白两大类。
Cry 晶体蛋白被敏感幼虫吞食后，在幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下释放出活性毒素，可与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合并形成孔道，破坏细胞渗透压平衡，最终导致昆虫死亡[1]。
本文对Cry 蛋白的结构与功能关系的相关研究进行综述。
1B t 杀虫晶体蛋白的结构解析和结构比较解析杀虫晶体蛋白三维结构的方法主要有两种：单对或多对同晶置换法（SIR/MIR ）和分子置换法（MR）[2]。
苏云金芽胞杆菌晶体蛋白2Ab32(Cry2Ab32)基因的克隆、表达与杀虫活性分析
包 涵 体 蛋 白采 用饲 喂 法 进 行 生 物 活 性 测 定 ， 结果表 明， Ｃ ｒ ｙ ２ Ａ ｂ ３ ２对 小 菜 蛾 （ Ｐ ｌ ｕ ｔ ｅ ｌ ｌ ａ ｘ ｙ ｌ ｏ ｓ ｔ ｅ ｌ ｌ ａ ） 、 玉 米 螟 （ Ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｎ ｉ ａ ｆ ｕ ｍａ ｃ ａ ｌ ｉ ｓ ） ￥ ｒ ｌ 棉铃虫 （ Ｈ ｅ ｌ ｉ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｐ ａ ａ ｒ ｍｉ ｇ ｅ ｒ ａ ） 均 有杀 虫 活性 ， 半 致 死浓 度（ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｎ ｌ ｅ ｔ ｈ ａ ｌ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｃ 。 ） 分别为 ８ ． ９ ９ 、 １ ９ ． ３ ４ 和２ １ ． ２ ４ ｉ ｘ ｇ ／ ｍＬ ， 对 甜菜 夜 蛾 （ Ｌ ａ ｐ ｈ ｙ ｇ ｍａ ｅ ｘ ｉ ｇ ｕ ａ ） 的致 死 率 不 高 ， 但 能 明显 抑制 甜 菜 夜蛾 的生 长 。ｃ ｒ ｙ ２ Ａ ｂ ３ ２ 新 基 因 的发 现 将为 重 要 农业 害 虫 的防 治提 供 更 多选 择 ， 为 进 一步 研 究 Ｃ ｙ２ ｒ Ａｂ 类
ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍｓ ， Ｐ Ｃ Ｒ ． Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ ） 方 法 对 苏 云 金芽 胞 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｔ ｈ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ） 菌株 Ｂ Ｎ２ ３ ． ５中
苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的制备方法
图 2 10 % SDS2聚丙烯凝胶电泳图 1～6 依次为 :等沉 HD273 、等沉 HD22 、等沉 HD21 、离心 HD273 、
沉淀 ,但它不仅简化了实验操作程序 、耗时短 ,而且其 纯度较高 。该方法的结论对于获取不同要求的 Bt 蛋 白做进一步研究具有一定的参考价值 。
苏云金芽孢杆菌产生的伴胞晶体是一种碱溶性 蛋白 ,由 cry 基因和 cyt 基因所编码 。在 p H 值高于 915 时大多数的 cry 毒素和 cyt 毒素溶解 ,少数需要 在 p H 12 时才能完全溶解 。因此选用了 p H 916 的 Na2CO3 缓冲液保证大多数的蛋白从菌体中溶出 。 21212 提取方法的影响
丙烯酰胺凝胶电泳 。10 %的分离胶 ,319 %的堆积胶 , 21112 摇床转速对 Bt 菌生长的影响
10 mA 保持 20 min 后加大电流至 30 mA ,当染料的
苏云金芽孢杆菌是好氧菌 ,培养该菌要有足够的
前沿迁移至凝胶的底部时结束 。考马斯亮蓝染色 10 氧气来满足它们的需要 ,所以培养基中的溶氧量越多
1 材料和方法
111 材 料 菌种 : 苏云金芽孢杆菌 ( B acill us t hu ri ngiensis)
HD21 ,HD22 和 HD273 菌株 ,南开大学保藏菌种 。 112 培养基
第一作者 :硕士研究生 。 3 2005 年中国工业微生物研讨会获奖论文 收稿日期 :2005 - 04 - 23
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
苏 云 金 芽 孢 杆 菌 伴 孢 晶 体 纯 化 方 法 研 究
蒋 辰 李 红 梅 。 弓 爱 君 邱 丽 娜 ， ， ，
一
分离 。重复 几 次 以尽 量 去 除 孢 子 。然 后 用 超 声 波 处
理 ， 芽孢 、 体 在 水 中均 匀 分 散 ［ ， １ ０ 离 心 使 晶 ５ 于 ００ ０ｇ ］ １ ￣２ ｎ 弃去 上清 液 ， 了消除 晶体 中内生 蛋 白酶 ０ ０ｍｉ ， 为 对 晶体 的非 特 异 降解 ， １ｍｏ ・ Ｎａ １ 用 ｌ Ｌ Ｃ 生理 盐水 洗 涤沉 淀 。Ａｕ ｕ ｇ ｓ用 １ｍｏ ・Ｌ Ｎａ １ ３ ℃ 洗 涤 ｌ Ｃ 于 ７
取新 鲜 固体斜 面培养 基 （ 肉膏 ３ｇ 蛋 白胨 １ ， 牛 ， ０ｇ
心纯 化
ｄ ｅ
喜
其 中蔗糖 密度梯度 离心 方法 简单 ， 本较低 ， 成 但蔗糖 溶
氯化钠 ５ｇ 琼脂 １ ～２ ， １０ ， ５ ０ｇ 水 ０ ０ｍＬ， Ｈ 值 ７ ４ ｐ ． ～ ７ ６ ， 别做好标 记 ， 无菌操 作方 法将待 接菌 种接 入 ． ）分 用
高速离 心法 和生物物 理法 等 。作 者在此 对这些 方法 进 行 了综 述 。
比较严格 。其 常用 的密 度试 剂 有 蔗糖 、 工 聚合 蔗 人
糖 （ ｉ ｌ 、 金 属 盐 （ ｓ １Ｎａ ｒ 、 化 密 度梯 度 介 Ｆｃ １ 碱 ｏ） ＣＣ、 Ｂ）碘
ｚ ａ ｉｍ ｉ
１ 伴 孢 晶体 粗 品 的 制 备
苏云金芽孢杆菌生物农药的制备、伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性
JIUJIANG UNIVERSITY实验论文题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性院系生命科学学院专业生物技术姓名樊晓乐、严学芬、王伟、周明宣、邹红虹班级B0933指导教师张炳火二零一一年十一月摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性前言苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。
它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。
Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。
因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。
本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。
镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。
1 材料与方法1.1 菌种苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。
1.2 培养基种子培养基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 1.0%,调pH 7.2 左右,121℃灭菌30 min。
发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白质 1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl 0.2%, MgSO4·7H2O 0.03%, K2HPO4 0.03%, MnSO4 0.005%,调pH 7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH 7.3。
苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展
广东化工2021年第10期·86·第48卷总第444期苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展黄慧敏1，曾远婷1,2，王磊1*(1．华南农业大学材料与能源学院制药工程系，广东广州510642；2．深圳唯新生物科技有限公司，广东深圳518116)Research Progress of Bacillus Thuringiensis and its Parasporal Crystal InsecticidesHuang Huimin1,Zeng Yuanting1,2,Wang Lei1*(1.Department of Pharmaceutical Engineering,School of Materials and Energy,South China Agricultural University,Guangzhou510642；2.Shenzhen Weixin Biotechnology Company Limited,Shenzhen518116,China)Abstract:With the rapid development of economy in our country,we pay more attention to the ecological benefit of the development of agriculture and forestry. The biopesticide is widely used in agriculture and forestry because of its high efficiency,broad spectrum,environmental protection and bio-safety.Till now,the research on Bacillus thuringiensis has a history of more than100years.A kind of protein crystal could produced by Bacillus thuringiensis in the process of sporulation forming.In this paper,the application of Bacillus thuringiensis and its parasporal crystals in insect control was reviewed.Keywords:Bacillus thuringiensis；Parasporal crystal；Insecticide；Biopesticide；Agriculture and forestry development苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，可产生伴孢晶体[1-2]，其相关产品杀虫作用高效，对人类无毒害，对环境无污染，目前在农业杀虫领域得到广泛的应用[3-4]。
苏云金芽孢杆菌的研究——综述
苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。
目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。
本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。
关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。
苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。
自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。
苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1Bt的发展历史1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。
1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
BMB 实验室苏云金芽胞杆菌伴胞晶体和晶体蛋白的制备
BMB 实验室苏云金芽胞杆菌伴胞晶体和晶体蛋白的制备一、胞晶混合物和伴胞晶体的制备按下述方法制备的样品可用于生物测定，提取晶体蛋白和SDS-PAGE 电泳等。
主要适用于苏云金芽胞杆菌库斯塔克和苏云金等亚种的伴胞晶体或130－140kDa 晶体蛋白，如HD-1,HD-2,HD-73,CT-43 等菌株。
(一) 胞晶混合物的制备1．菌体的培养用PM 或LB 液培养基于30℃培养2－3 天(至芽胞完全脱落)。
注意：这是至关重要的一步。
一定要让菌体生长充分，在油镜下观察99.9%的细胞形成芽胞（石碳酸复红染色），也就是要求清晰的看到只存在芽胞和伴胞晶体，不能看见或只能极少看见营养体细胞。
苏云金芽胞杆菌是好氧细菌，在其生长过程中一定要保证充足的供氧条件，否则芽胞形成会不顺利、不完全，导致晶体形成不发生或不彻底，从而严重影响后续操作。
例如，在用500ml 的三角瓶培养时，装量在50－100ml 之间、瓶口用8 层纱布扎、摇床转速在220rpm 或以上可较好保证通气要求。
2．胞晶混合物的制备收集培养物，0.5 mol/L NaCl 洗涤三次，无菌水再洗三次（3500rpm.20min, or5000-6000rpm 5min。
离心时间和转速的设定以能将晶体和芽胞沉淀下来为准，离心时间不要太长）。
注意：在保证菌体生长充分的情况下，此时培养物中的颗粒成分就只有芽胞和伴胞晶体，离心过程中只有它们才会沉淀。
在洗涤过程中，若出现漂浮物或粘性成分，尽量将其除去。
总的原则是，对颗粒状的晶体和芽胞进行洗涤，去除细胞碎片和细胞溶解物等，将纯净的晶体和芽胞保留下来。
(二) 伴胞晶体的制备伴胞晶体的纯化有很多方法，如双相法，密度梯度离心法等（此处不列文献，感兴趣者自查）。
这些方法相对繁琐，此处一般不推荐使用，除非研究伴胞晶体的形态和结构，或单纯检测纯晶体的毒力。
因为在晶胞混合物中，芽胞在许多生化条件下是惰性的，易于通过离心去除。
如果只需使用晶体蛋白，如用于纯化晶体蛋白或用SDS-PAGE 检测晶体蛋白的分子量，可将上述提纯的晶胞混合物用作伴胞晶体。
一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法[发明专利]
![一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/795b0db6f01dc281e43af06f.png)
专利名称：一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法专利类型：发明专利
发明人：李平,李延飞,张晨璐,周丛照
申请号：CN201110109483.5
申请日：20110428
公开号：CN102757993A
公开日：
20121031
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种制备苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的方法，属于微生物工程和生物防治领域，借助紫外线UVC进行诱变，分离纯化苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis菌株，经活化、种子培养后接入发酵培养基，进行饥饿培养，发酵液经过高速冷冻离心，用生理盐水洗涤、稳定，再经无菌水反复洗涤、离心，分离出纯度达到99％以上的伴孢晶体。
与现有技术相比，本发明操作更简便、周期短、成本也相对较低，此方法提取的伴孢晶体纯度达到99％以上，本发明分离纯化的伴孢晶体单一性强，形态均一，便于对伴孢晶体毒力蛋白杀虫机理的研究。
申请人：同济大学
地址：200092 上海市杨浦区四平路1239号
国籍：CN
代理机构：上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：林君如
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苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展
苏云金芽胞杆菌杀虫方面的研究及运用进展摘要：人类对苏云金芽胞杆菌（Bt）的研究至今已有100多年的历史，因其具有特殊的生理特性，在微生物防治害虫方面具有重要的作用。
利用微生物能直接杀死害虫却又不伤害控制害虫的天敌，最重要的是它不污染环境，害虫也更难以产生抗药性，还能通过遗传操纵改造某些性状，以便对其更好的利用。
同时，随着转基因技术的兴起和发展，Bt成为转基因过程中的重要材料，在应用实践中起着巨大的作用，如今成功的转Bt产物已有：转Bt抗虫棉花、转Bt玉米以及备受争议的转基因水稻等等。
本文主要叙述Bt的某些重要特征和当前的研究进展，旨在达到一种科普宣传让人们更加了解有关转Bt产物方面的知识。
关键词：苏云金芽孢杆菌、微生物防治、转基因、农业生产应用苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis，简称Bt )是一种杆状、革兰氏染色阳性反应、能形成内生芽胞的细菌，广泛存在于各种生态环境中。
其营养体具有周生鞭毛或无鞭毛。
在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体，此特点成为苏云金芽胞杆菌区别于分泌肠毒素的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)的主要特征(喻子牛等，1990)。
由于其独特的杀虫特性，自从1901年日本学者Ishiwata首次分离到苏云金芽胞杆菌以来，苏云金芽胞杆菌得到了广泛的关注和研究，在世界范围内已分离得到超过40000个菌株，对其生物活性谱的了解得到了极大的扩展，由最初对鳞翅目的毒性，逐渐发现对双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf等，1998)。
1.苏云金芽孢杆菌的毒素毒素是苏云金杆菌杀虫的核心，主要有三种：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白，Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）即σ-内毒素，苏云金素即β-外毒素，芽孢。
应用生物物理学方法研究苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的穿膜机理
应用生物物理学方法研究苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的穿膜机理苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）在《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版中归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。
它形成芽胞的过程中，在菌体内的一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体（parasporal crystal）。
这种伴胞晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，故又称为杀虫晶体蛋白（ICPs）或δ-内毒素（δ-endotoxin）。
苏云金芽胞杆菌作为一种对人畜安全、无环境污染的微生物杀虫剂，在农、林及卫生害虫的防治中发挥了重要的作用，成为国内外开发应用最成功的一种微生物农药。
近年来，由于环境问题的恶化，Bt制品更被大力加以开发利用。
大批转基因植物的商业化，使得Bt转基因在生产中的地位迅速提高。
因此，在加大应用Bt的同时，各国科学家也纷纷深入研究杀虫晶体蛋白的杀虫机理，期望以此为基础进行蛋白的理性设计和改造，进一步提高其对昆虫的毒杀作用，使这种杀虫蛋白有更好的应用前景。
对于Cry毒素杀虫机理，目前主要存在两种作用方式，一个是多年来人们认为毒素在虫体内的顶端微绒毛细胞上形成孔洞，导致细胞渗透压失衡，虫体死亡。
最近也有人提出毒素之所以能够起到杀虫作用，是因为毒素单体与Bt受体相互作用，激活PKA信号通路，从而导致虫体死亡。
同时，对于普遍被接受的穿孔作用方式，人们提出了三种模型假说。
“刀状模型”认为，Cry晶体蛋白可成对地形成发夹结构作用于质膜，这样的螺旋发夹结构形成的六聚体在质膜上形成一个亲水性的直径为0.6nm的孔。
“伞状”模型认为膜孔的形成是通过形成多聚体，或第一结构区中其它螺旋的插入来完成的.“埋龙模型”指出，蛋白的三个结构域都有插膜。
1 杀虫晶体蛋白穿膜机制研究所用方法1.1磷脂单层膜研究技术脂类—蛋白之间的相互作用可通过测量磷脂单层膜的膜压变化来研究。
等温情况下，在微天平的小槽子上铺一层磷脂，当加入蛋白后，如果蛋白与磷脂有作用，就会引起表面磷脂膜膜压的增加。
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展
1989 年 Hofte 和 White［11 ］
ley 根据氨基酸序列的同源性和杀虫谱双重标准将当时已公 布的 42 种 Bt 杀虫蛋白晶体基因划分为 5 类 14 亚类 。随 着新的基因不断被克隆和发现， 人们发现有些序列相似， 但 其杀虫活性不同， 而某些基因的产物具有相同的杀虫活性，
40 卷 1 期
安徽农业科学
2012 年
过结构域 Ⅱ 与昆虫中肠细胞膜上的受体蛋白专一性结合。毒 素与受体蛋白结合过程分为 2 步： 可逆结合与不可逆结合。 可逆结合是由毒素 （ 结构域Ⅱ或Ⅲ） 与受体之间的静电吸附 引起的， 这一结合可诱导蛋白毒素分子的空间构象发生变 化， 在受体局部发生富集与寡聚化； 不可逆结合发生在可逆 ） 进一步与受体发生紧密结合并直 毒素 （ 结构域 Ⅰ 结合之后， 接插入到细胞膜中， 形成跨膜孔道
。
同源性只有 40% ～ 90% 。结构域Ⅱ 由第 序列的差异性很大， 291 ～ 500 个氨基酸残基组成， 含 3 个 β 折叠片层， 每个片层 顶端各有 1 个突环参与受体蛋白的识别， 决定了对昆虫毒性 由第 504 ～ 644 氨基酸残基构 的特异性。结构域Ⅲ位于 C 端， 含有 2 个反 β 折叠片层组成的三明治结构， 可能能够防 成， 也可能参与 止昆虫肠道蛋白酶对毒性肽分子的进一步降解， 对受体 的 识 别。 不 同 毒 素 蛋 白 C 端 序 列 的 同 源 性 大 于 90% ［17 － 19］。伴 孢 晶 体 的 结 构 （ 毒 素 蛋 白 Cry1Aa、 Cry2Aa、 Cry3Aa、 Cry3Bb、 Cry4Aa 和 Cry4Bb 的 3 个结构域） 见图 2［20］。
［3 ］
。该伴孢晶体具有
高效、 广谱的杀虫作用， 且对人畜及非目标昆虫无害。 Bt 生物农药因具有以下优势而逐渐得到重视： ① 无污 染， 无残留， 对人畜较安全； ②生产中以农副产品作为主要原 料； ③与各类化学杀虫剂复配使用而不受影响。以 Bt 为主 要成分的杀虫剂对鳞翅目、 双翅目、 鞘翅目、 直翅目、 线虫等 200 多种昆虫具有毒力作用， 因此国内外已将其作为生物防 治的一项重要措施
苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达
苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达王智勇;吴柏桦
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】1990(030)004
【摘要】用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensisvar.galleriae 81—6)株有两种小质粒和一种大质粒。
将碱解法抽提到的质粒用 PstI 完全酶解,与同样用 PstI 完全酶解的载体质粒 pCAMPUC 连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis
var.kurstaki HD-1 Cry-B 株的原生质体。
用ELISA 法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。
毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。
【总页数】5页(P249-253)
【作者】王智勇;吴柏桦
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S482.7
【相关文献】
1.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达 [J], 伍金元;冯纪年;张兴
2.5种中国苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白基因分析 [J], 张光美;Raymo.,A
3.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kbDNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究 [J], 胡宏源;夏立秋;史红娟;孙运军;高必达;丁学知
4.苏云金杆菌蜡螟变种晶体蛋白基因在枯草杆菌中的克隆及表达 [J], 余学政;吴柏桦
5.苏云金芽孢杆菌cry1Aa10杀虫晶体蛋白基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达 [J], 侯丙凯;党本元;章银梅;陈正华
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苏云金芽孢杆菌晶体蛋白分离纯化新方法研究
苏云金芽孢杆菌晶体蛋白分离纯化新方法研究杨开杰【摘要】There are many methods such as liquid double phase, density gradient, sediment, bio-physics separation and so on, frequently used to isolate and purify the protein crystal from bacillus thuringiensis (Bt). However, these methods have their own defects as well as advantages. In this paper, the isolation cost, the equipment, the purity, the output and the activity were considered. Three improvements on ultrasonic wave process, suspension liquid preparation and ultraviolet ray radiation were made. Thus, a new method to separate crystal protein from Bt was set up. This technology has a characteristic of low cost, simple operation and high application. The production ratio is improved from 20% to 28% with the product purity of 90%.%分离苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体蛋白常用的方法有液体双相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分离法等，但这几种方法各有优缺点。
苏云金芽孢杆菌的伴胞晶体形成过程分析
小 镊 子 取 出后 转 至 无 菌 生 理 盐 水 中 洗 涤 ３遍 ， 再
转至 生理盐水 中 ， 亦可 直接 侵 入 ９ ％的酒 精 中立 ５ 即提 起 ， 眼点燃 数秒 钟后转 入生理 盐水 中。 火
（ ） 尸体 液的制 备 ： 丝线结 Ｓ Ｎ死 虫 的 口 ２虫 用 Ｌ 腔和 肛 门 ， 用剪 刀从 虫 体 背 面或 腹 面 进行 纵 向解
器。
（） ４ 培养及 其观察 ： 板置 于 ２ ℃培 养 ２ 、 平 ８ ４ｈ
４ 、２ｈ后 ， 取菌 落 制 片 ， ８ｈ ７ 挑 用伴 胞 晶体 染 色法
镜检 ， 观察记 录菌体 ， 芽孢 和伴胞 晶体 的形 态 。在
培养 ７ ｈ后 ， ２ 观察记 录培 养单个 菌落 的培养 特征 。 挑取 ３到 ５ 有伴胞 晶体 的菌株 接 种 到 Ｂ 个 Ｐ斜 面 上 ，０Ｃ培 养 ７ ３。 ２ｈ以上 ； 常规制 片 ， 次用伴 胞 晶 再 体染 色法镜 检 ， 有伴 胞 晶体 的分 泌 物 的 即可 确定 为苏 云金芽孢 杆 菌 ， 并将 其 转 到另 一 Ｂ Ｐ斜 面上 ，
２ １ ２ 菌种 的保藏 ． ．
在 苏 云金 芽 孢杆 菌 培养 ２ ４
２ 结 果 与分 析
２ １ 菌 种 的分离 和纯化 、 ． 保藏 、 化 活 ２ １ １ 菌种 的分 离和 纯 化 在牛 肉膏蛋 白胨 上 ． ． 进 行 固体平 板 的划线 与涂 布的具体 方法 如下 ： （） １ 虫体 消毒 ： 将样 品侵 入 ７ 的酒 精 中 ， ５ 用
７ —８ 。 ５ ０Ｃ水 中热处 理 １ —１ ｉ 。 ０ ５ｒ ｎ ａ （ ） 释分 离 和划 线 ： １ ３稀 用 ０倍稀 释 法将 虫 尸
研 制和 开发 ， 对抗 虫转基 因植 物 的更新换 代 ， 以防
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的制备
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的制备王子佳;李红梅;弓爱君;李圆原;邱丽娜【摘要】采用液体培养和固体培养两种不同的方法培养苏云金芽孢杆菌,并比较了高速离心法、透析法以及等电点沉淀法三种纯化方式对伴孢晶体的纯化效果.镜检观察结果表明,固体培养更有利于菌体产生伴孢晶体.利用棉铃虫进行的生物测定结果表明,透析法纯化所得伴孢晶体生物效价较高,达到150 000 IU·mg-1.扫描电镜观察结果显示,透析法纯化所得伴孢晶体纯度较高且形态完整.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2009(026)009【总页数】3页(P56-58)【关键词】苏云金芽孢杆菌;伴孢晶体;高速离心;透析;等电点【作者】王子佳;李红梅;弓爱君;李圆原;邱丽娜【作者单位】北京科技大学,北京,100083;中国计量科学研究院,北京,100013;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】TQ458苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal protein，ICP)，对敏感昆虫有特异性的防治作用 [1]。
作为世界上开发最成功的微生物杀虫剂[2]，大部分苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因都编码δ-内毒素蛋白[3]。
一般认为，δ-内毒素的作用过程要经过溶解、酶解活化、与受体结合、插入孔洞及离子通道形成5个环节。
对不同昆虫有特异毒性的伴孢晶体(Parasporal crystal)被昆虫吞食后，在昆虫中肠特殊pH值条件下被溶解释放出ICP。
然后,在中肠拟胰蛋白酶的作用下，通过剪切被激活成为抗蛋白酶的毒素核心片段(Toxin core fragment)。
激活的ICP特异地与中肠上皮细胞受体结合，破坏细胞通透性，最后导致膜穿孔,使昆虫因整个细胞代谢失去平衡而死亡。
双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究
双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究
朱仕房;杨曜中
【期刊名称】《世界农药》
【年(卷),期】2000(022)005
【摘要】苏云金芽孢杆菌(Bacillus thringientsis)是一类G^+类,其在生活周期中会产生伴孢晶体(Parasporal crystals)。
最新的分类系统根据伴孢晶体中的活性成份—杀虫晶体蛋白(InsecticideCrystal Protein,ICP)。
氨基酸序列同源性的差异,将苏云金芽孢杆菌基因分为21群,44亚群,64类,116亚类。
伴孢晶体对鳞翅目,鞘翅目,双翅目有杀虫活性,同时对线形动物门,原生动物门,扁形动物门中某些种类害虫有杀虫活性。
【总页数】4页(P39-42)
【作者】朱仕房;杨曜中
【作者单位】华东理工大学的化学研究所;华东理工大学的化学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】TQ453.501
【相关文献】
1.苏云金芽孢杆菌LSZ9408伴孢晶体的形态特征研究 [J], 黄素芳;朱育菁;刘波;阮传清;林捷
2.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展 [J], 李雪;马玉超;李煦;于慧敏;张建
3.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究 [J], 蒋辰;李红梅;弓爱君;邱丽娜
4.苏云金芽孢杆菌的分离鉴定及伴孢晶体蛋白生物毒力效果分析 [J], 刘晨;王祯;朱
先约;杨瑞;倪博立
5.苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展 [J], 黄慧敏;曾远婷;王磊
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苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白提取方法比较研究
罗朝辉;夏立秋;丁学知;王海龙;曾智
【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》
【年(卷),期】2007(030)003
【摘要】采用液体双相分层法和等电点沉淀法提取苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白.原子力显微镜观测,发现液体双相分层提取的晶体蛋白具有完整典型的晶体结构;等电点法提取的得率高,不能检测到完整的晶体结构.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,等电点法提取的蛋白质含量是液体双相法提取的蛋白含量的1～2倍.将2种方法提取的晶体蛋白对初孵棉铃虫幼虫生物测定均表现杀虫生物活性,经统计分析,液体双相法提取的蛋白质生测毒力比等电点法的高1.5～3倍.
【总页数】5页(P94-98)
【作者】罗朝辉;夏立秋;丁学知;王海龙;曾智
【作者单位】湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.拉曼镊子分析单个苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白 [J], 王桂文;姚辉璐;彭立新;何碧娟;黎永青
2.5种中国苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白基因分析 [J], 张光美;Raymo.,A
3.苏云金芽孢杆菌中华亚种CT—43菌株伴胞晶体蛋白的特性 [J], 孙明;喻子牛
4.苏云金芽孢杆菌的分离鉴定及伴孢晶体蛋白生物毒力效果分析 [J], 刘晨;王祯;朱先约;杨瑞;倪博立
5.14株苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对猪蛔虫第3期幼虫的毒性比较 [J], 邓干臻;姚宝安;冯汉莉;袁林茂;周艳琴;李继州;郭玉红;喻子牛
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