狂犬病诊断技术研究
狂犬病的实验室诊断
以提取的RNA为模板，进行逆转录聚合酶链式 反应（RT-PCR），扩增病毒特异性基因片段， 从而判断标本中是否存在狂犬病毒。
标本保存和运输要求
低温保存
标本应保存在-70℃以下的超低 温冰箱中，以确保病毒的活性 和稳定性。
避光保存
避免标本长时间暴露在光线下 ，以免影响病毒活性。
密封运输
02
预防和控制狂犬病需要政府、社会和个人的共同努力，包括加
强疫苗接种、提高公众认知、加强动物管理等措施。
通过有效的预防和控制措施，可以保护人类和动物的健康，维
03
护社会公共卫生安全。
02
实验室诊断方法概述
实验室诊断目的和意义
确诊狂犬病感染
通过实验室诊断方法，可以准确检测狂犬病病毒的 存在，从而确诊狂犬病感染，为临床治疗提供依据 。
实验室空气、表面和水源等也 应定期进行消毒处理，以减少 环境中病原体的传播风险。
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感谢聆听
04
血清学检测方法
酶联免疫吸附试验
原理
将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行， 通过洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后根据酶作用于底物后显色来判断结果。
应用
ELISA法可用于检测狂犬病病毒抗原、抗体等，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、 可批量检测等优点。
注意事项
操作过程中需注意避免交叉污染，设置阴阳性对照，严格控制反应条件等。
荧光抗体技术
原理
用荧光物标记抗体，与待测标 本中的相应抗原或抗体结合， 形成带荧光的抗原抗体复合物 ，在荧光显微镜下观察荧光以 判断结果。
应用
荧光抗体技术可用于狂犬病病 毒的快速诊断和病原学研究， 具有灵敏度高、特异性强、直 观快速等优点。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
原国家卫生部2008年颁布的狂犬病诊断标准：重庆狂犬抗体检测机构
原国家卫生部2008年颁布的狂犬病诊断标准一、原国家卫生部2008年颁布的狂犬病诊断标准根据患者的流行病学、临床表现和实验室检查结果进行综合判断，病例确诊需要实验室证据。
1、临床诊断病例，符合下列任一项即可诊断典型的狂躁型狂犬病临床表现，明确的动物致伤史+典型的麻痹型狂犬病临床表现。
2、确诊病例，临床诊断病例加下列任一项，即可确诊:（1）直接荧光抗体法（或ELISA法）：检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病病毒抗原阳性，或用RT-PCR检测狂犬病病毒核酸阳性。
（2）细胞培养方法：从患者唾液或脑脊液等标本中分离出狂犬病病毒。
（3）脑组织检测：尸检脑组织标本，用直接荧光抗体法或ELISA法检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCR检测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法分离出狂犬病病毒。
二、人用+宠物用双管齐下，助力狂犬病防控我国对狂犬病的防控，至今已有30年。
2014年，康华生物的人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV）获批上市，开启了我国国产狂犬病疫苗的人源新时代。
HDCV在免疫效果和起效速度方面优势明显，免疫持续时间可达10年，不良反应发生率低于1%，适用全人群（包括儿童、老人及孕妇），被视为预防人类狂犬病的金标准疫苗。
此次启动的中国宠物狂犬病疫苗现状调研项目将覆盖宠物医院、宠物美容店，通过调查每年接种疫苗的犬、猫数量，以及宠物主人对于为犬和猫接种疫苗的认知和行为习惯，以期为狂犬病控制和预防提供新的思路和策略参考，促进行业发展。
据透露，未来还将推出新一代、高标准、引用人用狂犬病疫苗生产技术的宠物狂犬病灭活疫苗，配合人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV），从人用和宠物用两个方向加强狂犬病的防控。
在中国，狂犬病（Rabies）是一个重大的公共卫生问题，2015－2018年更是导致每年几百人死亡，超过95%的人类狂犬病病例来源于患狂犬病的狗。
虽然狂犬病是一种严重的人兽共患病，但狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）在我国现行动物库内的循环和分布并不清楚。
狂犬病疾病研究报告
狂犬病疾病研究报告疾病别名：恐水症所属部位：全身就诊科室：传染科病症体征：恶心，排便困难，低热，呼吸困难，头痛，食欲不振疾病介绍：狂犬病是怎么回事？狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染，它多由染病的动物咬人而得，一般认为口边出白色泡沫的疯狗咬到传染，其实猫，白鼬，浣熊，臭鼬，狐狸或蝙蝠也可能患病并传染，患病的动物经常变得非常野蛮，在唾液里的病毒从咬破的伤口进入下一个病人，狂犬病从一个人传到另外一个人极为少见，患狂犬病的人类患者多数会发病身亡，在1971年有1个痊愈的病例，2004年在美国一个未诊断为狂犬病的患者过世之后捐献内脏，获得捐献的三个人因狂犬病身亡，另有同名电影症状体征：狂犬病有什么症状？以下就是狂犬病的症状介绍：狂犬病患者典型三恐（恐风、恐水、恐光）病症占60%，另40%为不典型症状。
潜伏期因为个体差异导致时间差异大。
大多数在3个月以内发病，超过半年者占4%～10%，超过1年以上者约1%，文献记载最长1例达19年。
平均20-90天。
影响潜伏期长短的因素为年龄（儿童较短）、伤口部位（头、面部发病较早）、伤口深浅（深者发病早）、病毒入侵数量及毒株的毒力、受伤后是否进行了正规的扩创处理和接种狂犬病疫苗预防等。
其他如外伤、受寒、过度劳累等均可能促使提前发病。
由吸血蝙蝠啮咬而引起的狂犬病，绝大多数病例不出现兴奋期，也无咽肌痉挛和恐水现象，而以上行性瘫痪为主要临床表现。
临床表现可分为狂躁型（脑炎型）及麻痹型（静型）两型。
狂躁型狂犬病的病变主要在脑干、颈神经或更高部位中枢神经系统，麻痹型狂犬病的病变则局限于脊髓和延髓，因而造成临床症状的差异。
两者都可分为下列三期：1、前驱期两型的前驱期相似。
在兴奋状态出现前大多数患者有低热、嗜睡、食欲缺乏，少数有恶心、呕吐、头痛（多在枕部）、背腰痛、周身不适等；对痛、声、光、风等刺激开始敏感，并有咽喉紧缩感。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
狂犬病的实验室检测与诊断技术
狂犬病的实验室检测与诊断技术武汉生物制品研究所基因工程室严家新研究员一、狂犬病实验室检测与诊断技术的用途1. 狂犬病人存活期内的实验室诊断：目前尚无实验室方法可确认处于潜伏期的狂犬病人。
对可能感染狂犬病毒而尚未发病（即处于潜伏期）的人应尽快接种狂犬病疫苗，必要时还要同时接种抗血清。
国外文献上比较可靠的研究结果已证明，狂犬病的潜伏期可能超过6年。
狂犬病疫苗在暴露后接种越快越好，但只要是在发病前，接种疫苗都会有保护作用，补种疫苗可以说没有时间限制。
狂犬病人一旦发病，其死亡率为100%。
病人在发病后最初几天，检测狂犬病毒的抗原一般是敏感的，常可在其唾液、角膜印片、尿液或皮肤中检出病毒抗原。
检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查。
但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。
皮肤活组织检查最好从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。
出现早期症状时检测抗原，仅有25-50%的患者为阳性；随着病情的进展阳性率也增加。
而脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天才出现。
但在国内护理条件下，狂犬病人发病后，很少能维持生命7天以上。
2. 动物和人狂犬病的死后诊断：可用抗原检测、病毒分离、病毒鉴定等方法进行死因确诊和病毒来源、演化分析。
3. 测定狂犬病毒的抗体:主要用于确定人或动物接种狂犬病疫苗是否成功。
W H O狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示免疫接种成功，能得到有效的保护。
前段时间国内因狂犬病疫苗假冒伪劣产品猖獗，而狂犬病疫苗的质量又是性命攸关的事，疫苗接种者主动要求在疫苗接种后测抗体的越来越多，这是可以理解的。
但只要疫苗的质量和供货渠道（包括保存条件）可靠，通常并不要求每个接种者都检测抗体。
因为除非接种者本身可能有免疫功能方面的异常，合格疫苗的抗体阳转率应为100%。
二、狂犬病的实验室检测与诊断的必要性典型的狂犬病的临床表现十分典型，但也有约40%的狂犬病例属瘫痪型，其表现并不典型，很容易与其他疾病混淆，所以实验室检测手段对狂犬病的确诊非常必要。
狂犬病实验室诊断研究进展
狂犬 病 （ ａ ｉ ） 由狂犬 病 病毒 （ ａ ｉ ｉ ｓ Ｒ ｂｅ 是 ｓ Ｒ ｂｅ ｖｒ ， ｓ ｕ
分ｓ ｅｃ ｌ ｒ ｉｏｕａｉｎ ｔｓ， ＴＣ Ｔ） 小 鼠接 种 ｉ ｕ－ｕｔ ｅ ｎ ｃ ｌｔ ｅｔ Ｒ Ｉ 、 ｓ ｕ ｏ 试验 （ ｕ ｅｉｏ ｕａｉｎ ｔｓ， Ｔ） ｍｏ ｓ ｃ ｌｔ ｔＭＩ 为确 诊 的辅助方 ｎ ｏ ｅ
断 以及 进行 尸体 剖 检 的工 作 人 员 在 工 作 之前 ， 都应 的专业人 员 ， 如接 触患 病动 物 的兽 医 、 能 接触 狂犬 可 人 ， 应 该 接 受 暴 露 后 处 理 措 施 （ ｏｔｘ ｏ ｕ ｅ 都 ｐ ｓｅ ｐ ｓ ｒ
世界 第 ２位 。近 几年我 国人 狂犬 病 发病 数 和死 亡 数 Ｖｒ ｓｎ ｕｒｌ ａｉｎｔｓ， ＡＶＮＴ） Ｅ ＩＡ、 鼠病 ｉ ｅ ｔ ｉ ｔ ｅｔ Ｆ ｕ ａｚ ｏ 、 ＬＳ 小 呈持 续上升趋 势 ， 我 国法 定 报 告 传 染 病 发 病 总数 毒 中 和 试 验 （ ｕ ｅ ｉｕ ｎ ｕｒｌ ａｉｎ ｅｔ 居 ｍｏ ｓ ｖｒ ｓ ｅ ｔａｉ ｔ ｔｓ， ｚ ｏ
法 。用 于病 毒抗 原检 测 的其 他方 法 ， 狂 犬 病快 速 ２ 实验 室检测 样本 的选 择 与评 价 如
酶联 免 疫 吸 附 试 验 （ａ ｉ ｎｙ —ｎ ｅ ｍｍｕ ２ １ 脑 ｒｐｄ ｅｚｍｅｌ ｋｄ ｉ ｉ — ．
ｎ ｓ ｒｅ ｔ ｓａ ， － Ｌ Ｓ ， 测 病 毒 核 酸 的原 位 ｏｏ ｂ ｎ ｓｙ Ｒ Ｅ Ｉ Ａ） 检 ａ 杂交 （ ｉ ｙ ｒ ｉ ｔ ｎ Ｉ Ｈ） 反 转 录一 ｉ ｓ ｕｈ ｂ ｉ ｚ ｉ ，Ｓ 、 ｎ ｔ ｄａｏ 聚合 酶 链 狂犬病 是一 种 以侵 害 中枢 神 经系 统 为特征 的致 死性疾 病 ， 通常 采用 脑组 织学 和 病毒 学检 查来 确诊 。
狂犬病诊断标准（WS281-2008）
狂犬病诊断标准（WS281-2008）狂犬病诊断标准（WS281-2008）1范围本标准规定了狂犬病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。
本标准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对狂犬病的诊断、报告。
2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
2.1狂犬病街毒street virus自然状态下从感染动物或患者中发现的狂犬病病毒。
2.2 狂犬病实验室固定毒 fixed virus狂犬病街毒株经过动物或细胞系列传代适应特定宿主后，其致病性减弱。
3诊断依据3.1流行病学史有被犬、猫、野生食肉动物以及食虫和吸血蝙蝠等宿主动物咬伤、抓伤、舔舐黏膜或未愈合伤口的感染史。
3.2临床表现3.2.1狂躁型狂躁型是我国最常见的类型。
主要表现有：在愈合的伤口及其神经支配区有痒、痛、麻及蚁走等异常感觉，以后出现高度兴奋、恐水、怕风、阵发性咽肌痉挛和交感神经兴奋症状如流涎、吐沫、多汗、心率加快、血压增高等。
逐渐发生全身弛缓性瘫痪，最终因呼吸、循环衰竭而死亡。
3.2.2麻痹型麻痹型在我国较为少见。
临床表现为：前驱期多为高热、头痛、呕吐及咬伤处疼痛等，无兴奋期和恐水症状，亦无咽喉痉挛和吞咽困难等表现。
前驱期后即出现四肢无力、麻痹症状，麻痹多开始于肢体被咬处，然后里放射状向四周蔓延。
部分或全部肌肉瘫痪，咽喉肌、声带麻痹而失音，故称“哑狂犬病”。
3.3实验室检查3.3.1 直接荧光抗体法(dFA)（见A．1）或ELISA（见A．2）检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病毒抗原阳性，或用RT-PCR(见A．3)检测狂犬病病毒核酸阳性。
3.3.2细胞培养方法（见A．4）从患者唾液、脑脊液等标本中分离到狂犬病病毒。
3.3.3脑组织检测尸检脑组织标本，用直接荧光抗体法(dFA)（见A．1）或ELISA （见A．2）检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCR(见A．3)检测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法（见A．4）分离到狂犬病病毒。
狂犬病诊断标准-重庆狂犬抗体检测分析
狂犬病诊断标准一、狂犬病诊断标准（一）原国家卫生部2008年颁布的狂犬病诊断标准根据患者的流行病学、临床表现和实验室检查结果进行综合判断，病例确诊需要实验室证据。
1、临床诊断病例，符合下列任一项即可诊断典型的狂躁型狂犬病临床表现，明确的动物致伤史+典型的麻痹型狂犬病临床表现。
2、确诊病例，临床诊断病例加下列任一项，即可确诊:（1）直接荧光抗体法（或ELISA法）：检测患者唾液、脑脊液或颈后带毛囊的皮肤组织标本中狂犬病病毒抗原阳性，或用RT-PCR检测狂犬病病毒核酸阳性。
（2）细胞培养方法：从患者唾液或脑脊液等标本中分离出狂犬病病毒。
（3）脑组织检测：尸检脑组织标本，用直接荧光抗体法或ELISA法检测狂犬病病毒抗原阳性、RT-PCR检测狂犬病病毒核酸阳性、细胞培养方法分离出狂犬病病毒。
（二）WHO的狂犬病定义临床病例：病例具有急性神经性综合征（如脑炎），主要表现为机能亢奋（如狂躁型狂犬病）或者麻痹综合征（如麻痹型狂犬病），如果没有重症监护支持，病人通常会在首发症状出现后7-11天内进行性发展为昏迷和死亡，常见死因为呼吸循环衰竭。
符合下列实验室标准中的1种或几种即可确诊。
（1）存在病毒抗原。
（2）细胞培养方法或实验动物接种中分离到病毒。
（3）未接种疫苗者的脑脊液或血清中存在病毒特异性抗体。
（4）通过分子生物学方法在活体或尸检样本（如脑活检样本、皮肤、唾液、浓缩尿）中检测到病毒核酸。
（三）WHO的狂犬病病例分类疑似病例：符合临床病例定义的病例。
可能病例：疑似病例，同时具有与疑似狂犬病动物接触的可靠病史。
确诊病例：实验室确认的疑似病例或可能病例。
在缺少动物暴露史或临床疑似脑炎症状的情况下，如果实验室诊断检测明确，仍可进行确定性诊断。
对可能感染狂犬病的患者在采取适当预防措施情况下进行核磁共振成像检查可能有助于诊断。
无论临床类型如何，当脑干、海马、下丘脑、深层和皮层下白质以及深层和皮质灰质的核磁共振T2成像出现模糊、微弱的异常高信号时，均提示可能为狂犬病。
狂犬病病毒实验室检测方法研究进展
狂犬病病毒实验室检测方法研究进展杨妍梅;冯若飞;马忠仁【摘要】狂犬病病毒(RV)属于人畜共患的急性直接接触性传染病病毒,近年来又有感染上升的趋势.因此,急需一种快速、准确、灵敏的检测RV的实验室诊断方法.现就酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体方法(FAT)、快速荧光抑制灶技术(RFFIT)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR,环介导等温扩增技术(LAMP)和基因芯片技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述,为更好地开展实验室诊断提供参考.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)008【总页数】5页(P102-106)【关键词】狂犬病病毒;检测方法;研究进展【作者】杨妍梅;冯若飞;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5狂犬病（Rabies）俗称疯狗病，又称恐水症，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一种人畜共患的急性接触性传染病，发病后病死率几乎为100%。
我国是狂犬病的高发地区，感染狂犬病死亡人数居世界第二，仅次于印度。
当今世界，狂犬病仍然是一种高发的人畜共患病，无论在发达国家［1］，还是发展中国家［2］，都是重点防控的传染病。
狂犬病在我国曾一度得到有效控制，值得关注的是我国城乡养犬、猫等宠物的家庭迅速增加，野犬、猫的数量均呈现增多趋势［3］，使该病的发病率近年有上升趋势。
狂犬病病毒是弹状病科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属的成员，为不分节段的单股负链RNA病毒，基因组长度为11 928nt～11 932nt，编码5种结构蛋白，顺次为核蛋白（N）、磷酸蛋白（M1）、基质蛋白（M2）、糖蛋白（G）和 RNA聚合酶（L），分别由对应的5种结构基因编码，其中N基因具有毒株间相对保守和高拷贝复制的特点，成为病毒分型、系统发生分析和分子诊断的目标序列［4］。
狂犬病的实验室检测与诊断技术
生物安全级别＆对工作人员的要求
(Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受 过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训， 并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的 病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、 有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受 过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和 二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由 在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的 科学工作者监督。
操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在 P2或P3生物安全实验室内进行。
对狂犬病实验室诊断的安全性要求：
①一个封闭的环境，专作狂犬病感染性工作 ②通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进入； ③穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋； ④操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应立即用3％的雷苏尔溶液或其他 相应的消毒剂消毒)； ⑤每日应至少消毒地板一次； ⑥所有用后剩余的标本，尸解工具，实验室材料在拿出实验室前应进行高压蒸气消 毒。
6. 快速狂犬病酶免疫诊断法
Rapid Rabies Enzyme Immunodetection (RREID
酶标抗狂犬病毒抗体
狂犬病毒样品 抗狂犬病毒单抗
6. 快速狂犬病酶免疫诊断法
技术特点：
——本试剂盒操作方便、快速灵敏，适于大量样本的检测。 ——本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C备用。 ——肉眼观察：阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显 黄色样品，无论深浅均认为是阳性。这种肉眼观察已足够作出诊 断，非常经济，因为不需要昂贵的酶标仪，也最适合于作现场流 行病学调查。 ——酶标仪读数：仔细擦净平板底面，用450nm滤光片读数。阳 性对照光密度值（OD）必须大于1.0单位，阴性对照OD值须低于 0.1单位，判定值（CUT OFF）的确定：阴性对照OD值 0.008。 OD值等于或大于CUT OFF的标本均视为阳性。 ——福尔马林固定的样品不适宜作RREID。
1例狂犬病个案报告
茎持续勃起伴皮疹 。 ２ 上午 ９时应患者家 属要求 转云和县 中医 ５日 院 治疗 ，初步 诊 断 ：（ ）败血 症 ；（ ） 尿路 感染 ； １ ２
（ ） 电解 质 紊 乱 ，低钠 低 钾 ； （ ）龟 头 炎 ； （ ） ３ ４ ５ 颈 椎病 。给 予对症 治疗 病情 无好 转 。 ２ ５日晚病 情 加 重 转 送 丽 水 市 中心 医 院进 一 步
２ ６日上午 ８时患者转 回云和县 中医院治疗 ， 由云和县疾病预 防控制 中心采集患者 唾液标本送 检 ，季某 因病 情加重 于 ２ 日中午 １ ：５ 抢救 无 ６ ２ ０经
效 死亡 。
流行病学资料
１ 病例 资 料 患者 季某 ，男 ，５ ３周岁 ，景 宁县 九
龙 乡金 山村 村 民 ，以养 鸡 、鸭 为职业 及 主要 经 济来 源 ，家 中喂养 ９条犬 用于 防卫 。２ １ ００年 １ Ｏ月 １ 日 ５
见图 １ 。
同 日患 者 自行 前 往 云 和 县 人 民 医 院 就 诊 ， 以 “ 明原 因肩 背痛 ” 收 人住 院治 疗 ，住 院期 间 出现 不 恶 心 、呕吐 现 象 ，次 数 频 繁 。饮 水 即 吐 ，头 胸 部 Ｃ Ｔ检查 无殊 ，住 院 治 疗 ２ｄ ４ 日晚 开始 出 现 阴 ，２
３ 疫 情 处 理 对 尸体 进 行 常 规 消 毒 处 理 ，２ 日 ６
１ ： ０在云和殡仪馆火化。对家属、医护人员等 ９ ３ 密切接触者进行预防性接种狂犬病疫苗 ，对病房环 境进行终末消毒。由于患者居住地在景宁县 ，疫点 消毒及处理工作 由景宁县疾病预防控制 中心完成 ， 对患 者污染 的区域及 患者 的分泌 物和排 泄物 、犬舍 进行 消毒 处理 ，并将 家 中未接种过 狂犬 疫苗 的 ６条
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒感染引起的一种人兽共 患中枢神经系统传染病，潜伏期长，一旦发病死亡率为 100%。 几乎所有温血动物都对狂犬病毒易感，其中犬类是主要宿主。 该病的主要感染途径是被患病动物咬伤、抓伤。发病动物唾液 中含有大量病毒，因此该病还可通过皮肤或黏膜损伤处接触 发病动物的唾液而感染，该感染途径时常被人们忽视。
ELISA 也可检测中和抗体，用包被在酶标板上的狂犬病 毒抗原，依次与样本中的抗体、标记有显色酶的抗体结合，产 生颜色反应，用酶标仪检测。是《狂犬病诊断标准》附录 B 中 的参考方法。 3 分子生物学诊断
狂犬病病毒属于具有包膜的单股负链 RNA 病毒，N 基 因是其中最保守、最稳定的核苷酸组，所以用来做狂犬病病 毒的特征基因，一旦检测出 N 基因，就可以证明有狂犬病病 毒的存在。狂犬病病毒的进化中 L 基因的部分核苷酸区域保 守性也很强，也可以做检测目标。
在表现出典型的临床症状前，狂犬病尚无任何确证的检 测方法。人若感染该病毒，一般依据动物咬伤史及临床症状
同时建立肉牛产业从饲养到餐桌整个工程的追溯体系和大 数据系统，实现对肉牛生产、技术推广、安全防疫、屠宰、加 工、市场调控等实现全程管理和调控。
围绕打造世界一流“绿色食品牌”目标，聚焦肉牛产业， 重点培争把“云岭牛”打造成为中国肉牛的名片， 培育成为“中国第一、世界一流”的品牌，扩大“云牛产品”市 场影响力。政府要重点扶持养殖加工企业做大规模、创新技 术、做精产品，提高企业知名度，培育“听牧牛肉”“爱伲牛肉” “谷多牛肉”等企业品牌，抢占行业制高点。重点支持肉牛养 殖加工企业向产品有机化方向发展，并严格按照有机牛养殖 及其产品生产标准、技术规范要求，认定产地环境，配套建设 标准化牛舍、有机屠宰加工生产线及饲草饲料。
狂犬病的实验室诊断
Ｇ Ｉ Ｃ Ａ ） 在病 原及 小 分子 物质 检 测领 域 的快 速 发 狂 犬 病 的 实 验 室诊 断／ 姚真蓝 （ 南 京农 业 大 学 动 物 医 学院 胶体 金 免疫 层析 法 （ 动 物 医学 系 江 苏南 京 ２ １ ０ ０ ９ ５ ） ，黄 国庆 ／ ／ 国外畜 牧学 展， 近年 还 出现 了该技 术用 于狂 犬 病抗 原检 测 的研 究 ， 且 取得 了较 好 效果 。此外 ， 小 鼠颅 内接种 （ Ｍ Ｉ Ｔ ） 和细 胞培 养分 离 （ Ｃ ｌ Ｔ ） 除了可 用 （ 猪 与禽 ） ． － ２ ０ １ ２ ， （ ７ ）． － ４ ９ ～５ ｌ
［ ３ 】 崔华敏 ，董兵 ，张芳 ，等． 河北部分地 区鸭新城 疫血清学调查［ Ｊ ］ ． 中国兽 医杂志 ，２ ０ ｏ ８ ，４ ＿ ４（ ７）：４ ０ — ４ １ ． ［ ４ 】 吴 峻华 ，福州市部分 鸭场新城疫感染 情况的调查 ［ Ｊ ］ ． 养 禽与禽病 防治 ，２ ０ ｏ ８ 。 （ ２ ）：４ ２ — ４ ３ ．
还可单 独作 为诊 断手 段， 或 者配 合Ｆ Ａ Ｔ 进行 病 狂犬 病 是 由弹状 病 毒科 、狂犬 病 病毒 属 的嗜 神经 病 毒 引起 的 于 狂犬病 病毒 培养 外，
一
种 世 界 性 的人 兽共 患病 。一 旦 出现 症 状 ， 病 死 率近 １ ０ ０ ％ 。 由于 原 诊 断 。新鲜 材料 得 到 的单份 阴性 结果往 往 需要 进 行 以Ｍ Ｉ Ｔ 和Ｃ Ｉ Ｔ
表现临 床症状 。但 自１ ９ ９ ７ 年 以来 ，国内不断 有水禽 感染Ｎ Ｄ Ｖ 发病 的 参 考 文 献 报道 ，特别近 两年来 某些鸭 源Ｎ Ｄ Ｖ 强 毒株对 鸭具有 明显的致 病性 。 ［ １ 】 陈伯伦． 鸭病【 Ｍ ］ ． 北京 ：中国农业 出版社 ，２ ０ ０ ８ ． ２ ２ ］ 周锦萍 ，孙 泉云 ，刘佩红 ，等 ． 上海地区近几年 鸭新发病毒性传 用禽 副黏病 毒 Ｉ 型 （ Ｎ Ｄ） 抗 原对 鸭 的Ｎ Ｄ 抗 体进 行检测 ，可以较好 『 染病的血清学调查 ［ Ｊ 】 ． 中国家禽． ，２ ０ ０ ５ ，２ ７（ ３ ）：９ － １ １ ． 的反 映鸭Ｎ Ｄ Ｖ 感染或 疫苗免 痰 隋况 ，这对 鸭新城疫 的研究 具有一定 的意义 。从 检测 结果 看 ，云南 省部 分 鸭场 的Ｎ Ｄ 抗 体 阳性 率较 高 ， 达６ ２ ． ８ ６ ％，检测 样 品 的 阳性率 ５ ０ ． ８ ９ ％，这 与 国 内周 锦 萍 ］ 、崔华 敏 ］ 、吴 峻华 ［ ４ 等在 上海 、河北 、福 州等 地对 鸭群 的Ｎ Ｄ Ｖ 血清 学调
狂犬病的实验室检测和诊断技术
生物安全级别＆对工作人员的要求
(Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受 过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训， 并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的 病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、 有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受 过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和 二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由 在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的 科学工作者监督。
荧光标记抗 狂犬病毒抗体
狂犬病毒抗原
荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原
FAT的技术要求：
—— 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处， 因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。 —— 脑样品印片必须用丙酮固定 5-10 分钟，因为丙酮 可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂 犬病毒结合。 ——脑样品必须保存在含50%甘油的生理盐水中，印片 染色前需用生理盐水洗涤数次。 ——荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因 此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。
2) 唾液腺的获取
为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间 的皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻， 两侧的颌下腺位于颌骨后部边缘表面。 在下颌下淋巴结的后面（这二种不要相 混淆）。
4. 标本的快速收集技术
在某些情况下可能难于或不可能尸解以便 打开颅骨取脑, 为减少这些困难已经设计出简 便的技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑 组织体。 第一种技术是用吸管通过枕骨孔插入并往 前推至一眼睛部位，则吸管中的脑组织内含有 部分脑干，小脑，海马回和皮质。 第二种技术为将吸管通过眼窝后壁(用套管 穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、 海马回、小脑。
狂犬病诊断方法研究
健康养殖·诊疗2021.04 畜牧业环境79摘 要：狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种高度致死性人兽共患性疾病，提高该病的诊断水平对保障人类健康尤为重要。
本文就狂犬病各种诊断方法的研究与应用现状进行综述，将为临床中快速诊断狂犬病提供参考依据。
关键词：狂犬病；诊断方法；研究进展1 前言狂犬病（rabies，RAB）是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一种高度致死性人兽共患传染病，近年来随着我国宠物行业的快速发展，犬科和猫科动物的异地流通加剧，RAB的发病率呈现出明显的上升趋势，提高RAB的诊断水平对该病的综合防控至关重要。
由于RAB引起的临床症状与其他致病原体导致的脑炎非常相似，故对于RAB的确诊需使用实验室诊断方法，一直以来RAB的实验室经典诊断方法为快速荧光灶抑制试验和荧光抗体试验，但两种方法存在操作繁琐、耗时、检测成本高、对试验条件和人员要求高等缺点，随着现代细胞培养技术、免疫学和分子生物学诊断技术的发展，RAB的新型替代诊断方法得到了快速发展，本文就RAB的各种诊断方法的研究与应用情况进行综述，以期为临床中RAB的快速确诊提供参考依据。
2 临床诊断依靠本病典型的临床表现即可做出初步诊断，愈合的咬伤伤口及伤口周围具有麻木发痒或蚁走感，临床表现出极度兴奋或烦躁，对风、水、光、声等外界刺激的敏感性增强，具有“恐水”症状，感染后期出现肌肉瘫痪或颅神经瘫痪。
3 实验室诊断3.1 荧光抗体试验该方法是实验室诊断RAB抗原的经典方法，将采集的临床样品与荧光素标记的抗RAB高免抗体进行反应，通过显微镜观察与抗原结合后的荧光抗体即可判断出样品中是否含有RAB抗原。
3.2 荧光灶抑制试验该方法是实验室诊断RAB抗体的经典方法，将采集人或动物的血清与RABV等量混合，置于37℃下中和反应1h，然后将抗原抗体混合物接种细胞并培养1d，次日对接种的细胞进行固定后进行荧光抗体染色，荧光显微镜下观察荧光灶个数，计算血清抗体效价。
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病毒引起的急性传染病，对人和动物都具有很高的致死率。
早期诊断狂犬病对于采取相应的防控措施以避免病毒传播至人群至关重要。
本文将介绍狂犬病的实验诊断方法，主要包括病理学，病毒学和免疫学诊断。
1.病理学诊断:病理学诊断是狂犬病的“金标准”，通常通过病毒抗原在中枢神经系统的分布和形态学改变来确定疾病的诊断。
疾病的确诊依赖于对患者或动物的脑组织进行取样，并通过病理学切片染色和显微镜观察来确定病毒的存在。
狂犬病的典型病理学特征包括神经细胞的溶解,脑脊液中细胞核的损害以及神经组织的炎症反应。
病理学诊断的优势是可以直接观察到病毒在病变中的分布和相关的病理学改变。
然而，病理学诊断需要从已经死亡的动物或人体中取样，可能需要相当长的时间才能完成。
2.病毒学诊断:狂犬病的病毒学诊断主要侧重于检测体液和组织样本中的病毒。
常见的病毒学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光分析法（IFA）和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
这些方法允许检测狂犬病病毒的核酸或抗原，从而确定疾病的存在。
病毒学诊断的优势是速度快、操作简单，可以在疾病早期进行检测。
然而，由于狂犬病病毒在体内繁殖速度较慢，且体液中的病毒含量较低，因此病毒学诊断的灵敏度可能较低。
3.免疫学诊断:免疫学诊断主要通过检测抗体来确定狂犬病的感染。
常见的免疫学诊断方法包括狂犬病抗体中和试验，免疫荧光抗体试验（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
这些方法可以检测体液中的病毒抗体或使用重组病毒抗原刺激免疫反应，从而确定患者或动物是否感染了狂犬病病毒。
免疫学诊断的优势是灵敏度较高，适用于早期诊断和在感染后一段时间进行检测。
然而，免疫学诊断的主要限制是需要患者或动物具备足够的免疫反应来产生抗体，这可能需要一定的时间。
总结起来，狂犬病的实验诊断方法主要包括病理学、病毒学和免疫学诊断。
病理学诊断是诊断狂犬病的“金标准”，但需要取样和患者死亡，所以时间较长。
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国的狂犬病发病数仅次于印度居世 界 第 ２ ，９７年 后我 国狂犬 病 发 位 １９ 病 数 开始 持 续 回升 。２０ ０５年 发病 数为 ２ ５７例 ， Ｏ ６年 发 病 数 为 ３ ２０ ３２９ ７ 例 】 。狂 犬 病 毒 属 弹状 病 毒 科 狂犬 病毒属 ， 为单股 负链 Ｒ Ａ病 Ｎ 毒 ， 大小 约 ７ ｒ 其 ５ ｍ×１５ ｍ， ａ ７ｒ 由基 ａ
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毒 的 Ｎ基 因相对恒 定 ， 突变发生 点
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温血动物也可 以成为传染源 。狂犬病患者 的器官移植到正 常
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Ｋ ￣ ｇ Ｍａ Ｋ ｒ ｔ ｏ ｌＳ， ｉ Ｙ， ｕ ａａＹ， ｔ １ Ｐ ａｅｅ —ｓ ｓ ｃａｅ ［ Ｍ ｖ ｕ ｔ ｉ ｅ ． ｌｔｌｔａ － ｏ ｉ ｔ ｇ ｅ ａ ａｅ ｎ ａ ｄ ｌ ｄ ｐ ｔ ｎ ｓ ｗ ｔ ｈ ｏ ｉ ｅ ａｉ ｓ Ｃ ｅ ｎ ａｎ ｓ ｎ ｔ－ｌ ｔｌｔａ ｔａ ｔ ｅ － ａｉ ｔ ｉ ｃ ｒ ｎ ｃ ｈ ｐ ｔ ｏ ｔｉ ｔ ｏ ａ ｉｐ ａｅｅ ｕ ｏ ｎ ｉｄ ｅ ｈ ｉ ｔ ｎ － ｂ
（ 四川省狂犬病研究 中心 ， 四川 泸州 ６６ Ｏ ） ４ＯＯ 中图分 类号： ５ ２９ Ｒ １ ．９ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０６２８ （０ ８０ －４７０ １０—０４ ２０ ）３０４ —３
摘要： 狂犬病是由狂犬病毒 引起 的以中枢神经 系统感染为特征 的一种人 畜共 患病 ， 目前病 是 死率最高的传 染病， 几乎为 １０ ０ ％。近年来 ， 狂犬病在我 国的发 病率呈上升 趋势， 时、 及 快速、 准确 的诊断动物和人的狂犬病可 以及 时发现传染源 ， 避免该病的流行。现就 目前国 内外应用的狂犬病 的病原学诊断 、 病理诊断和 影像 学方面 的诊 断技术予 以综述 ， 比较其各种方法的优点和缺点。 并 关键 词： 犬病； 断； 狂 诊 病理 学
狂犬病是 由狂犬病毒引起 的以病犬 与带毒 犬 ， 洲蝙蝠 等其他 欧 纠
的一种人 畜 共 患 病 ， 目前 病 死 率 最 高 的传 染 病 ， 乎 为 是 几
１０ 。狂 犬 病 在 全世 界 范 围 内流 行 ， 报 道 ， 世 界 每 年 死 ０％ 据 全
维普资讯
医学综述 ２Ｏ 年 ２月第 １ ０８ ４卷第 ３期
Ｍｅｉａ Ｒ ｃｏｔ ａ ，ｅ ０８ Ｖ １１ ， ｏ３ ｄｃｌ ｅａｉ ｔ Ｆｂ２０ ， ｏ．４ Ｎ ． ｌ ｕ ｅ
・
４ ４７ ・
狂 犬 病 诊 断 技 术 研 究
王 文玉 （ 综述） 光 开（ ， 余 审校）
因组 的 ３端 到 ５端 依 次 排 列 着 Ｎ、 Ｎ 、 Ｇ、 ＳＭ、 Ｌ五 个 基 因 结 构 ， 犬 病 狂
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