实时荧光定量PCR原理及应用共24页文档
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析 四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点
实时荧光定量pcr检测核酸的原理
实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。
RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。
引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。
PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。
每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。
RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。
荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。
荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。
当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。
通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。
RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。
首先，需要从待检测样品中提取出核酸。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。
接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。
PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。
PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。
最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。
RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。
实时荧光定量PCR技术原理
实时荧光定量PCR技术原理一、PCR反应：PCR反应是qPCR的关键步骤，它利用DNA聚合酶酶及其附加的DNA 引物扩增靶序列，产生大量特异性放大的DNA片段。
PCR的过程包括三个主要阶段：变性、退火和扩增。
1. 变性（Denaturation）：在94-96℃的高温下，DNA双链解旋为两条单链，使其变性成为模板。
2. 退火（Annealing）：将反应体温降至40-65℃， DNA引物与目标序列的互补部分结合，引物与模板序列的退火温度由其碱基组成决定。
3. 扩增（Extension）：将反应体温升至67-72℃，DNA聚合酶酶依托DNA引物的引导进行DNA链合成，合成一个新的DNA链。
PCR通过不断的循环变性、退火和扩增步骤，每一个循环的两倍增加靶序列的数量，从而迅速放大特定的DNA片段。
二、定量方法：实时荧光定量PCR具有准确、快速、高灵敏度和高特异性的特点，可以定量分析目标序列的初始数量。
qPCR主要通过引入荧光标记和检测体系监测PCR反应的进程，并根据监测到的荧光信号的强弱来确定目标序列的起始浓度。
常用的定量方法包括SYBR Green染料和探针法两种。
1. SYBR Green染料法：这是最常用的定量方法，它利用SYBR Green 染料与DNA结合发出荧光信号。
SYBR Green染料结合到PCR反应中的靶序列上，DNA双链解旋后，SYBR Green染料就可以与靶序列结合，并发出荧光信号。
荧光信号的增加与PCR反应进行的循环次数成正比，荧光信号的曲线由荧光分析仪实时记录，通过建立标准曲线或比较Ct值（Ct，Cycle Threshold，荧光阈值周期，即荧光信号超过背景噪音的最小反应周期数）来确定目标序列起始浓度。
2.探针法：探针法需要合成特异性的探针序列，包含荧光物质和有机磷酸盐类物质。
PCR反应中，探针与靶序列的互补部分结合，作为DNA聚合酶酶的模板，聚合酶在待测的DNA靶序列上进行链合成，荧光小分子物质与酶切开的探针结合发出荧光信号，荧光信号与目标序列的起始浓度成正比。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
实时荧光定量PCR的原理及应用
实时荧光定量PCR的原理及应用导读实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA 水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它通过利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，从而可以快速、准确地定量目标序列的数量。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此被广泛应用于基础研究、临床诊断、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面。
首先，PCR反应是实时荧光定量PCR的核心步骤。
PCR反应通过不断循环的高温变性、低温退火和中温延伸，使目标DNA序列得以扩增。
在每一个PCR循环中，目标序列的数量呈指数增长，这种指数增长的特点为后续的定量提供了基础。
其次，荧光探针是实时荧光定量PCR的关键。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光淬灭剂的寡核苷酸探针，它与目标序列特异性结合，并在PCR反应中被3'→5'外切酶切割，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，因此可以通过监测荧光信号的变化来实现对目标序列数量的实时定量。
最后，检测系统是实时荧光定量PCR的重要组成部分。
检测系统包括荧光定量PCR仪和数据分析软件，它能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度，并将荧光信号转化为目标序列的数量。
通过合理设置PCR反应条件和分析荧光信号的曲线，可以实现对目标序列的快速、准确定量。
总的来说，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合，通过PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面的协同作用，实现对目标序列数量的实时定量。
这种原理使实时荧光定量PCR成为一种高效、快速、准确的分子生物学技术，为科研和临床诊断提供了重要的技术支持。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。
首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。
双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。
DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。
这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。
实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。
最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。
在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。
实时荧光定量PCR技术 原理 应用及实践标准资料
❖中国科学院协和医院、 上海瑞金、军事医学 科学院
❖301医院、医院
❖华大基因、诺华制药
❖九强、博奥等
用我们的产品发表的部分SCI文章
❖ a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB
标准曲线分析
-- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
第十九页
Company name
标准曲线分析
y = -ax+b
测定荧光定量PCR反应的有效性
-- 线性的标准曲线：相关系数R2
-- 扩增效率：
扩增效率(E)=10-1/斜率-1
第二十页
荧光定量PCR检测方法
染料标记： ❖ SYBR Green I
第十五页
Company name
Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定
的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。
起始模板量 基线 阈值 Ct值
第十六页
Company name
Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值的特点：
❖相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大 ，但Ct值相对固定；
免疫组化诊断试剂研发平台
约300平米GMP标准的生产车 间
泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生 产公共服务平台
园区公共服 务平台
总 6500万元
4
第四页
泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与 生产公共服务平台
实时荧光定量PCR原理及应用
比较Ct法
对照
假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因) 2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化 倍数
在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到 的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线
高丰度靶基因经常在PCR循环早期开始扩增 需要调整基线的循环终止值
先将基线终止循环数定为6，单击Update然后确 定第一个检测到扩增的循环数（比第一个检测到 扩增的循环数少1或2个循环的数量）
将基线终止循环数定为8
双击Y轴，将图转化为对数图
不正确的基线设置
基线终止循环数太低
基线终止循环数太高
合后才发荧光
SYBR Green I 工作原理
未结合的SYBR green I
结合解离曲线识别不同的PCR 产物
95 ℃ 15sec; 60℃ 20sec; 95 ℃15sec 在60 ℃ ～95 ℃ 之间的Ramp time设为19:59
SYBR Green I的特点
可以用于不同的模板 使用方便，价格相对便宜 灵敏度很高 与非特异性产物结合
引 物 设 计 原 则
在探针确定以后再选择引物 引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠 保持G-C含量在30-80%之间 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超 过4个及以上
用Primer Express软件计算出来的Tm值应 当在58-60 ℃之间 3’的5个碱基中G 和/或 C碱基的总数不能超 过2个
连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的一种变种，它利用荧光探针实现对PCR产物的定量检测。
荧光定量PCR结合了PCR扩增和实时荧光检测技术，能够快速、准确地检测目标DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR的原理及其在科研和临床应用中的重要性。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的原理基本与常规PCR相似，也包括三个步骤：变性、退火和延伸。
其区别在于，在PCR反应体系中加入了含有荧光素的探针，这些探针与目标DNA序列特异性结合，并在PCR反应中被DNA聚合酶酶切，导致荧光信号的释放。
在PCR反应进行过程中，荧光信号与PCR产物量成正比，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程，从而实现对目标DNA的定量检测。
荧光定量PCR可以通过不同的荧光探针来检测多个靶标，实现多重PCR检测。
二、荧光定量PCR的应用1. 病原微生物检测：荧光定量PCR广泛应用于病原微生物的检测，包括细菌、病毒、真菌等。
通过荧光定量PCR技术，可以实现对微生物的快速、准确的检测，有助于早期诊断和治疗。
2. 癌症诊断：荧光定量PCR可用于癌症早期筛查和诊断。
通过检测癌基因的表达水平，可以帮助医生判断肿瘤的类型、分级和预后，指导个体化治疗方案。
3. 遗传病检测：荧光定量PCR可用于遗传病的基因检测。
通过对患者DNA样本进行荧光定量PCR分析，可以准确检测遗传突变，帮助家庭规划和遗传咨询。
4. 食品安全监测：荧光定量PCR可以用于食品中致病微生物和转基因成分的检测。
通过对食品样品中目标DNA的定量检测，可以确保食品安全，保障公众健康。
5. 环境微生物监测：荧光定量PCR可用于环境微生物的监测和鉴定。
通过对环境样品中微生物的定量检测，可以了解微生物种类和数量，指导环境保护和生态恢复工作。
荧光定量PCR作为一种高灵敏、高特异性的分子生物学技术，在医学、生物学、食品安全和环境科学等领域发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术的原理及其应用
Concentration Measurement
DNA Concentration Measurement
1000 900 800
• The Rotor-Gene is fully equipped to do DNA concentration measurement using fluorescent dyes
From: High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen Carl T. Wittwer, Gudrun H. Reed, Cameron N. Gundry, Joshua G. Vandersteen, and Robert J. Pryor. Clinical Chemistry 49:6, 853–860 (2003)
Fluorescence
Muta nts
(T a lle le )
He te ro zyg o te s
82
83
84
85
86
87
88
Temperature (°C)
•Example SNP genotyping using HRM analysis. ACTN3 (R577X) SNP genotypes (C—T).
0.02deg
HRM Profile
HRM on the Rotor-Gene 6000
高灵敏度的光学系统 精确的控温方式 高精度的温度分辨率（0.02 ℃ /S） 高强度的荧光采集速率（1000 次/ ℃） 功能强大的分析软件
Wild typ es
(C a lle le )
Fluorescence
荧光定量pcr原理及应用
荧光定量pcr原理及应用一、前言荧光定量PCR是一种利用荧光信号来检测PCR产物的技术，它可以实现对PCR反应过程中DNA扩增产物的实时监测和定量。
本文将从PCR反应原理、荧光探针设计、实验操作步骤、数据分析等方面详细介绍荧光定量PCR的原理及应用。
二、PCR反应原理PCR是一种体外人工合成DNA的技术，它通过模拟自然界中的DNA 复制机制，使DNA序列在体外得到扩增。
在PCR反应中，需要使用两个引物（primer）和一个DNA模板进行扩增。
引物是特异性的寡核苷酸序列，在反向转录和扩增过程中与目标序列互补结合，作为起始位点进行扩增。
引物的设计需要考虑到目标序列的长度、GC含量、互补性等因素。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤将DNA双链解旋成单链，使引物可以与模板结合；退火步骤使引物与模板形成稳定的复合物；延伸步骤则通过加入Taq聚合酶及其所需离子和碱基三磷酸，使引物向3’端延伸，合成新的DNA链。
三、荧光探针设计荧光定量PCR需要使用荧光探针来检测PCR产物。
荧光探针是一种含有荧光染料和靶向序列的寡核苷酸探针，它可以与PCR产物特异性结合，并在结合后释放出荧光信号。
常用的荧光探针有Taqpman、MGB、Scorpion等。
荧光探针的设计需要考虑到靶向序列的长度、GC含量、互补性等因素。
同时，还需要选择适当的荧光染料和非荧光淬灭剂对，以达到最佳检测效果。
常用的荧光染料包括FAM、ROX、VIC等，非荧光淬灭剂则包括BHQ1、Iowa Black FQ等。
四、实验操作步骤1. 样品提取：从样品中提取目标DNA，并进行纯化。
2. PCR反应：将目标DNA与引物和Taq聚合酶一起加入PCR反应体系中进行扩增。
3. 荧光探针加入：在PCR反应体系中加入特异性结合PCR产物的荧光探针。
4. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，使用荧光定量PCR仪对荧光信号进行实时监测和定量分析。
五、数据分析荧光定量PCR的数据分析主要包括荧光曲线分析和标准曲线法分析。
简述实时荧光定量pcr技术基本原理
简述实时荧光定量pcr技术基本原理实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于检测和定量DNA分子的方法。
其基本原理可以分为以下几个步骤：1. DNA模板准备：从样品中提取目标DNA并纯化。
2. 反应混合物制备：将目标DNA模板与一对引物（Primer）和一种DNA聚合酶（如Taq聚合酶）一同混合。
引物是特异性的DNA片段，用于引导DNA合成的起始。
3. PCR反应：反应开始时，立即开始DNA聚合酶的活性。
DNA聚合酶会从引物的3'端开始合成新的DNA链，直到另一条模板DNA链的末端。
该过程包括三个步骤：变性、扩增和延伸。
- 变性：将DNA模板的双链解链，得到两条单链DNA。
- 扩增：引物结合到模板DNA上，并通过DNA聚合酶的活性引导新的DNA链的合成。
- 延伸：DNA聚合酶在模板链的5'到3'方向上合成新的DNA 链。
4. 荧光探针监测：实时PCR使用一种带有荧光染料的DNA探针，例如SYBR Green或TaqMan探针。
这些探针能够与新合成的DNA片段结合，并发出荧光信号。
- SYBR Green：该荧光染料会与双链DNA结合并发出荧光。
当PCR反应进行时，DNA的数量增加，SYBR Green的荧光信号也增加。
通过检测荧光信号的强度，可以确定PCR反应的进程和目标物质的数量。
- TaqMan探针：TaqMan探针包含一个与目标DNA片段互补的序列，并在其一端有一个荧光染料，如荧光素（FAM）和荧光素内部荧光质体（TAMRA）。
当TaqMan探针与目标DNA结合时，聚合酶开始进行DNA合成，并在过程中释放探针分子。
聚合酶的活动断开荧光染料和荧光质体之间的特定连接，导致发出另一种荧光信号。
通过监测这两种荧光信号，可以确定PCR反应的进程和目标物质的数量。
5. 数据分析：荧光信号的强度与反应温度和时间关联，通过计算PCR循环的阈值周期（CT值），可以确定目标DNA的起始数量。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
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实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
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实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
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RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
实时荧光定量PCR原理、操作及其应用
图中的虚线即为阈值线
二、操作及结果分析
8.熔解曲线分析 熔解曲线（分析）是指定量反应结束后让样品继续升温直到产
物的双链全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光， 这样荧光值会有一个陡然的突降，借以检测产物的特异性， 相当于进行电泳检测。因为不同的产物片段其值不同，单一 的双链其荧光陡降的温度一致，加入含有非特异性扩增产物， 那么其荧光陡降的温度不止一个（两个或更多或杂乱无章）。 如图：
三.应用 (一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三)检测分析
一、原理概述
1 概论
实时荧光定量技术于1996年由美国 公司推出，由于该 技术不仅实现了从定性到定量的飞跃，而且及常规相比， 它具有特异性更强、有效解决污染问题、自动化程度高等 特点，目前已得到广泛应用。
实时荧光定量：在反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号积累实时监测整
基因表达( )是指细胞在生命过程中,把储存在顺序中遗传信 息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子. 遗传 物质首先要把所携带的遗传信息转录成为信使（）,携带遗传 信息的从细胞核进入到细胞质中及核糖体结合，在核糖体中 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变 成蛋白质，至此遗传物质完成了表达过程。期间的转录过程 是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的的多少直接影 响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因含 量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。
(3).变性时，双链分开，无荧光
(4).复性和延伸时，形成双链 发荧光， 在此阶段采集荧光信号。