类芽孢杆菌木聚糖酶产生菌株的筛选及其产酶条件优化
木聚糖酶产生菌的筛选与酶学生化特性
（ ．河南农 业大 学 牧 医工 程学 院 ， 州 ４ ０ ０ ； ．河南 普爱饲 料股 份有 限公 司 ， 口 ４ ６ ０ ） １ 郑 ５０ ２ ２ 周 ６００
摘
要 ： 自然界 中筛选 出可分泌高产木聚糖酶的黑曲霉， 从 并对其产酶条件和酶学特性进行优化和分析。结果表明Ｌｄ ， ｈ ｕｏ ６０ ０ ｈｎ ） ．Ｈ ｎ ｎＰ Ａ ｅ ｏ ， ｔ． Ｚ ｏｋｕ４ ６ ０ ，Ｃ ｉａ Ｆ
Ａｂｓｒ ｃ ： ｈｅｍｉｒ ｂ ｓｗｉ ｉｈ ｌｖ ｌ ｆｘ ｌｎ ｓ ｒ ｄ ｔｏ ｒ ｅｅ ｔｄ．Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔＡｓ ｔ ａ ｔ Ｔ ｃ ｏ ｅ ｔ ｈ ｇ ｅ ｅｓｏ ｙ ａ ａ ｅｐ ｏ ｕｃｉｎ ｗｅ ｅ ｓ ｌ ｃｅ ｈ ｅｒ ｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ
Ｋ ｅ ｒ ｓ： ｐ ｒ ｌｕ ｇ ｒ；ｍｅ ｉ ｙ ｗｏ ｄ Ａｓ ｅｇｉ ｓｎｉｅ ｌ ｄ ａ；ｐ ；ｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ Ｈ ｅ ｅ ａｕ ｅ；ｘ ｌｎ ｓ ｙａ ａ ｅ
木聚糖是植 物细胞壁 的主要 成分之一 ， 属于非淀
粉多糖 （ Ｓ ） 能阻 止动 物 体 对 营养 物 质 的 吸收 ， ＮＰ ， 其抗 营养 作用是通过增 加食糜黏度 、 破坏 消化道微 生
含量分 别 为 ４ 、１和 ２ 。若 在含 有这 些 原料 的 ３６ ８ｇ
饲料 中添 加木 聚糖 酶 ， 可 提 高 饲料 的利 用 率 和 畜 既
禽生 产性 能 ， 降低 粪 便 的 污 染 ， 能 为 畜 禽 生 产 又 带 来 良好 的生产效 益 和经济 效益 Ｊ 。 此外 ， 造 纸 工 业 中 ， 用 木 聚糖 酶 可 以减 少 在 使 化 学漂 白剂 的 用量 ， 善 纸 张 特 性 ， 时 又 能 提 高 改 同 木质 素 的溶 出率 ¨ “ 。木 聚 糖 酶 可 水解 植 物 中半 纤维 素形 成 的戊 糖 ， 可 应 用 于 生 产 木糖 醇 、 精 、 其 酒
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
木聚糖酶产生菌的筛选及其酶学性质初步研究
ＣＨＥＮ ｎ —ｉ ＨＵＡＮＧ — ｉ ｇ ，Ｚ Ｃｏ ｇ ｊ ～， ｎ Ｋｅｙｎ ＨＯＵ Ｈｕ
（ ． ｃ ｏ ｌｏ ａｅ ｉｌ ｉｎ ｅａ ｄ Ｅｎ ｉｅ ｒｎ １ Ｓ ｈ ｏ ｆＭ ｔｒａ ｅ ｃ ｎ ｇｎ ｅ ｉｇ，Ｃｅ ｔａ ｏ ｔ ｉｅｓｔ ｆＦｏｅ ｔｙ ａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏｏ ｙ，Ｚｈ ｚ ｏｕ４ ２ ０ ｃ Ｓ ｎ ｒ ｌＳ ｕ ｈ Ｕｎｖ ｒ ｉ ｏ ｒｓｒ ｎ ｃ ｎ ｌｇ ｙ ｕ ｈ １ ０ ６，Ｈｕ ａ ｎ ｎ，Ｃｈｎ ｉａ‘ ２ ．Ｃｈ ｍｉｔｙ ａ ｄ Ｃｈ ｍｉａ ｇｎ ｅ ｉ ｌ ｇ ｅ ｓｒ ｎ ｅ ｃ ｌＥｎ ｉｅ ｒｎｇＣｏ ｌ ｅ，Ｇｕ ｎ ｉ ｎｖ ｒｉｙ，Ｎａ ｎｎ ３ ０ ４，Ｇｕ ｎ ｉ ｅ ａ ｇｘ ｉｅ ｓｔ Ｕ ｎ ｉｇ ５ ０ ０ ａ ｇｘ ，Ｃｈｎ ） ｉａ
摘 要 ： 采用富集培养 、 平板划线分离 、 明圈平板筛选 的方法 ， 透 从长期堆放玉米芯的土壤 中分离 到９ 株木 聚糖酶产生菌 ， 然后采
用 自然选育的方法从这些菌株中筛选 出一株优 良木 聚糖酶菌株 ， 用该菌株发酵产酶并对其 酶学性质进行 了初步研究． 结果表 明。 在温
度 ２ ￣ ３ ℃ 、 Ｈ初 始值 ５ ０左 右 、 床转 速 ｌ ０ｒｒｉ、 酵 ４ 产 的木 聚 糖 酶 酶 活较 高 ， 聚 糖 酶 活达 到 ｌ ． ８Ｕ／ ８ ０ ｐ ． 摇 ５ ／ ｎ 发 ａ ８ ｈ所 木 ３６ ｍＬ； 酶促 反 应 的 较适 温 度为 ５ ℃ ，Ｈ 值 为 ５ ３ 右 ＃ 酶 较 耐 热 ， 度在 ６ ℃下 ，２ ａｉ 酶 活 仍 残 留 ６ ． ２ ． ３ ｐ ．左 该 温 Ｏ １ ０ｒ ｎ后 Ｏ８
产木聚糖酶枯草芽孢杆菌构建及表达条件优化
而枯草芽孢杆菌W B 600在木聚糖培养基上同步培养
图 1 基 因 .t>7iZF-2 的 P C R 扩增 注 ：M : D L 1 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1，2: P C R 扩 增 得 到 的 叮 n Z F - 2 Figure 1 PCR amplification of^jnZF~2 gene Note: M : D L 1 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1,2: x yn Z ¥ ~ 2 amplified b y P C R
238 基因组学与应用生物学
也 越 来 越 多 ，更多 的木 聚 糖 酶 基 因 在 不 同 的 宿 主 中
M
1
2
得到表达(陈洪洋等，2016)。
10 000 bp 5 000 bp
枯草芽孢杆菌(B a c 山 是 一 种 模 式 生 物 ， 3 000 bp
2 000 bp
其遗传背景清晰，具有很强的分泌能力，能够高效表 1 500 bp
对 重 组 菌 进 行 筛 选 和 酶 活 力 鉴 定 ，再
图 2 pWB980质 粒 与 w ^Z F -2基因双酶切 注 ：M : D L 1 0 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1: 质 粒 p W B 9 8 0 ; 2 : 基因巧TiZF-2 Figure 2 Double digestion o f pWB980 vector and ,r>7iZF-2 gene Note: M: D L10000 DNA Marker; 1: Plasmid pWB980; 2: Gene xynZ¥-2
1.2重组工程菌筛选
接 种 量 为 1 % 时 ，工 程 菌 酶 活 力 达 到 最 大 ，接种
木聚糖酶高产菌株的筛选及固态发酵条件的研究
Ａ ｓｒ ｃ ： Ｍ Ｉ ａ ｔ ｒ ｍ ｔａｎｏ ｐ ｒ ｉ ｕ ｉ ｅ ｉ ｈ ｗａ ｉ ｈ ｆ ｒｐ ｏ ｕ ｔ ｃ ｘ ｌｎ ｓ ｓｆ ｔａｅ ｒ ｍ ｉ ｔａｎ ．Ｔｈ ｂ ｔａ ｔ Ａ ｃ ｅ ｕ ｓ ｒｉ ｆ ｂ ｉ Ａｓ ｅ ｇｌ ｓｎ ｇ ｒｗｈｃ ｓｈｇ ｏ ｒ ｄ ｃｅｌ ｙａ ａ ｅｗａ ｌ ｔｄ ｆｏ ｓｘ ｓｒ ｉｓ ｌ ｉｒ ｅ
木 聚糖酶（ ｙ ｎｓ， Ｃ ２・１・ ） ｘ ｌ ａｅ Ｅ ３・ ａ ８ 是一 类重 要
了研 究 ， 木聚 糖 酶 的工业 化 生 产及 其应 用 提供 依 为
据。
的木糖苷键水解 酶 ， 对于水解植物材 料 中的半纤维 素 有着重要 的作用 。木聚糖酶可用 于纸浆 的预漂 白 ， 有 效降低含氯化 合 物 的用 量 ， 降低环 境 污染 ， 决 严重 解
活 力 最 高可 达 ３８ ｍｏ ｍｉ １・ － 。 ６９ 卜 ｎ Ｉ ｇ。
关 键 词 ： 聚糖 酶 ； 选 ； 酵 木 筛 发 中图 分类 号 ： ５ Ｑ ５ 文献 标识 码 ： Ａ 文 章编 号 ：０ ８ ｌ １ ２ ０ ）３— ０ ０ ３ １０ —３ １ （ ０ ７ ０ ０ １ 一Ｏ
Ｌ ｉ ｕ ａ ｄＬＩ Ｃｈ ｎ ｅ ＩＨｕ—ｊｎ ｎ Ｕ ａ ｇ
（ ．ｅｏ ｏ ｏ ｐｒｔ ｎｃ ｎｅ ｏ ｘｅｎ ｌＨｅａ ｒｖｃ －Ｈｅ ａ ｈ ｎ ｚｏ －５ ０ １Ｃｈｎ ； １ ｃ ｎ ｍｙｃｏ ｅａｉ ｅ ｔｒｆｒｅ ｔｒａ ｎ ｎ ｐｏ ｉ ｏ ｅ ｎｎ ｚｅ ｇ ｈ ｕ ４ ０ １ ｉａ ２ Ｂｉｌｇ ｅ ａｔ ｎ ｆ ｅ ｇｈ ｕｈ ｓ ａ ｄｙａ ｄｅ ｇ ｅ ｎ ｏｌｇ ．Ｈｅａ ｈ ｎ ｚ ｏ － ５ ０ １Ｃ ｉａ ． ｏｏ ｙ ｄ ｐｒｍｅ ｔｏ ｎ ｚ ｏ ｕｂ ｎ ｒ ｎ ｎ ｅｒ ｇ ｃｌ ｅ Ｚｈ ｉ ｅ ｎ ｎｚ ｅ ｇ ｈ ｕ ４ ０ １ ｈｎ ）
木聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及酶谱分析
过 ＩＳ序列 分析 ， Ｔ 并结合 形 态学鉴 定确 定其 属 于拟 盘 多毛孢 属 。该 菌以 燕麦秸 秆 粉和 麸 皮不
溶性木聚糖作为 ｃ源， ５ｃ 于２ ｑ摇瓶光照培养， ３天木聚糖酶的酶活峰值为 ４ ． ／ Ｌ 酶的 第 ９ ３Ｕ ｍ ，
比活 力为 １０ ６ ２Ｕ ｍｇ ６ ． ／ 。经 Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ Ｄ Ａ Ｅ及 酶谱 分 析 ， 菌株 能 够产 生 至 少 ６种 不 同分子 量 该
１５ ２ 提 取 基 因 组 Ｄ Ａ ．． Ｎ
以 ２ Ｃ ５ ｏ 下恒 温 培养 ５天 的菌 丝体 为 材料 ， 用 Ｃ Ａ 采 Ｔ Ｂ法 提取 总 Ｄ Ａ＿ 。 Ｎ ７ ｊ
１５ ３ ＩＳ序 列 Ｐ Ｒ扩 增 ． ． Ｔ Ｃ
ＩＳ序 列 的 Ｐ Ｒ扩 增 ， Ｔ Ｃ 采用 通用 引物 ＩＳ ／Ｔ ４ ， Ｔ ５ ＩＳ Ｊ 引物 由上 海 生 工 生 物 工程 技 术 公 司合 成 。Ｐ Ｒ Ｃ
霉 （ ｅｉ ｌｕ 、 孢 菌 （ ｕａｉｍ） 链 霉 菌 （ ｔｐｏ ｙｅ ｓ 、 孢 杆 菌 （ ａｉｉ 等 ¨ 。 内切 一ｐ一１ ４ Ｐ ｎｃ ｌ ｍ） 镰 ｉｉ Ｆ ｓｒ ｕ 、 Ｓｒ ｔ ｃｔ ） 芽 ｅ ｍ ｅ Ｂ ｃｌ ｌ） ，
一
木聚 糖酶 （ Ｃ ３ ２ １８ 可 以随机 切 断木聚糖 主链 ， Ｅ ． ． ． ） 是木 聚糖 降解过 程 中最关 键 的酶 。微 生物 产生 的
筛选 出高产木 聚糖 酶 的菌株 ， 并进行 酶谱 分析 ， 为进一 步研究 酶 的分 离纯化 及工业 应用提 供理论 依据 。
收稿 目期 ：０ １～０ ２１ ３—１ １
基 金项 目 ： 家 自然科 学基 金 项 目 （０ ６０ ４ 国 ３ ９０ １ ）
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化一、绪论纤维素是一种在自然界中广泛存在的多糖化合物，是植物细胞壁的主要成分之一，包括木质素、纤维素和半纤维素。
据统计，全球每年约有数十亿吨的植物纤维素被合成，其中约有90%的植物纤维素来自于农田作物秸秆、果壳、木材废弃物等。
纤维素具有很高的结晶性和高聚合度，使其难以被微生物降解。
但纤维素又具有广泛的应用价值，例如可用于生物燃料的生产、食品添加剂和医药领域等。
寻找能高效降解纤维素的微生物，对于资源循环利用、环境保护和生物技术的发展具有重要意义。
在农田中，菜地土壤是农作物生长的主要土壤类型之一，其中的微生物种类繁多。
其中一些具有降解各种有机物的潜能。
菜地土壤中的微生物资源对于寻找具有纤维素降解能力的菌株具有重要价值。
本研究旨在从菜地土壤中筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株，并对其产酶条件进行优化，以期能为纤维素资源的有效利用提供科学依据。
二、材料与方法1. 样品的采集本研究选取了5个不同类型的菜地土壤样品作为研究对象，分别是A、B、C、D、E五个样点。
每个样点的土壤样品采集3份，混合后称为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3。
2. 纤维素降解菌的筛选将每份土壤样品分别加入无菌水中，制成不同浓度的土壤悬浊液。
接种于含有纤维素的琼脂板，培养48小时后进行细菌筛选。
通过观察产酶圈直径大小进行初步筛选，然后进行传代培养，最终选取具有较高产酶能力的菌株。
3. 菌株的鉴定通过形态学观察、生理生化实验以及16S rDNA序列分析等方法对菌株进行鉴定和分类。
4. 产纤维素酶条件的优化选取具有较高产酶能力的菌株，通过单因素试验和响应面试验确定最佳的产酶条件，包括温度、pH值、碳源和氮源的种类和浓度。
5. 酶活力测定采用标准方法测定优化条件下菌株产酶的酶活力，并进一步评估其降解纤维素的能力。
三、结果与讨论经过初步筛选和传代培养，从15个菜地土壤样品中筛选出了10株具有较高纤维素酶产酶能力的菌株。
木聚糖酶生产及酶学性质的研究
木聚糖酶生产及酶学性质的研究一、本文概述木聚糖酶是一类能够水解木聚糖及其相关多糖的酶类，广泛存在于自然界中，尤其是在植物、微生物和动物体内。
由于其在生物质转化、食品加工、饲料工业以及医药等领域的重要应用价值，木聚糖酶的研究与生产日益受到关注。
本文旨在全面综述木聚糖酶的生产方法、纯化技术以及酶学性质的研究进展，以期为木聚糖酶的进一步研究和应用提供理论支持和实践指导。
本文将对木聚糖酶的生产方法进行详细阐述。
这包括从天然来源中提取木聚糖酶，以及通过微生物发酵、基因工程等生物技术手段生产木聚糖酶。
在此基础上，还将探讨不同生产方法的优缺点，以及影响木聚糖酶产量的关键因素。
本文将关注木聚糖酶的纯化技术。
纯化是获得高质量、高活性木聚糖酶的关键步骤，本文将介绍常见的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等，并分析各方法的优缺点及适用范围。
本文将重点研究木聚糖酶的酶学性质。
这包括木聚糖酶的分子量、最适pH值、最适温度、动力学参数等基本性质，以及酶的稳定性、抑制剂和激活剂等影响因素。
通过对这些酶学性质的研究，可以更深入地了解木聚糖酶的作用机制和催化性能，为其在各个领域的应用提供理论依据。
本文旨在通过系统研究木聚糖酶的生产及酶学性质，为木聚糖酶的进一步研究和应用提供全面、深入的理论支持和实践指导。
二、木聚糖酶的生产方法木聚糖酶作为一种重要的工业酶，其生产方法主要包括微生物发酵法、化学合成法和基因工程法。
其中，微生物发酵法因其产量高、成本低、条件温和且易于工业化生产等优点，成为目前木聚糖酶生产的主要方法。
微生物发酵法生产木聚糖酶主要利用能够产生木聚糖酶的微生物，如真菌、细菌和放线菌等，通过优化培养基成分、发酵条件和菌种选育等手段，提高木聚糖酶的产量和活性。
目前，黑曲霉、米曲霉和里氏木霉等真菌是木聚糖酶的主要生产菌种。
在发酵过程中，碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养成分对木聚糖酶的产量和活性具有重要影响。
常用的碳源包括木聚糖、葡萄糖、果糖等，氮源则包括蛋白胨、酵母粉、豆饼粉等。
纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化
纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. 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木聚糖酶合成菌株的筛选及其产酶条件的研究
糖酶 的影响分析 ， 出产木聚糖酶的最优条件 ， 得 即在加入 ５ ａｄｌ液体培养基 ， ￣条件下， 物含 量为 ０ ５ ， ０ ｎｅ Ｍ ｓ ２Ｃ ８ 底 ． ｇ ４ ０
接种量为 ２ ｒｌ培养 ３ ｈ Ｏｎ。 ６。
关键词 ： 黑曲霉 ； 木聚糖酶 ； 变； 诱 液体发 酵
中图分类号 ： Ｓ ５ ． Ｔ ２ ５３ 文献标识码： Ａ 文章编号 ：６ １ ６ ９ （ ０ ７ ０ － ０ ４ ０ Ｏ １７ — ８２ ２ ０ ）４ ０ ２ — Ｏ４
维普资讯
第 ４ 卷（ ３ 总第 １８ ） ３期
陈凤莲 等： 糖酶合成菌株的筛选及其产酶条 木聚 件的 研究
２ ５
组 ：１水解 酶， （） 主要 包 括 内切 Ｂ １４ 木 聚糖 酶 ， 一 ，一 它
能将木聚糖主链在随机地 降解短链 的低聚木糖 ； 外
梭 状 芽孢 杆 菌陶 细 菌和 链 霉 菌【 等 明 的培 养 液 中 纯化
得到木聚糖酶。木聚糖酶是降解木聚糖半纤维素的
一
组 酶的总称 ， 它不是单一作用 可将 它们分为两
收稿 日期 ：０ ７ ０ — ５ ２ ０ － ５ ２ 作者简介 ： 陈凤莲 ， ，９ ５ 女 １ ７ 出生 ， 哈尔滨商业大学食品科学与工程学院教师， 博士研究生 ， 。 讲师 研究方向 ： 谷物副产品精 深加 工及 保健与功能 性食品方面的研究
Ｓ ｌｃ ｉ ｎ ｏ ｔ ａ ｎ ｆ ｒ Ｘｙ ａ ａ ｅ Ｓ ｎ ｈ ｓｓａ ｄ Ｓ ｕ ｙ ｏ ｔ ｅｅ ｔｏ ｆＳ ｒ ｉ ｏ ｌ ｎ ｓ ｙ ｔ ｅ ｉ ｎ ｔ ｄ ｎ Ｉｓ Ｐｒ ｄ ｃｎ ｎ ｉｉ ｎ ｏ ｕ ｉ ｇ Ｃｏ ｄ ｔｏ ｓ
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动物益生芽孢杆菌菌株的筛选及发酵条件优化研究的开题报告
动物益生芽孢杆菌菌株的筛选及发酵条件优化研究的开题报告一、研究背景及意义益生菌指一类有益于宿主生理健康的微生物，其对人体健康具有明显的促进作用。
目前已知许多益生菌可用于改善宿主的肠道微生态环境、调节人体免疫功能、预防疾病等方面。
其中，动物益生芽孢杆菌（Animal probiotic Bacillus spp.）在畜牧业中的应用得到了广泛关注和研究。
据报道，动物益生芽孢杆菌可增强动物的消化吸收能力、抵御疾病、提高肉、蛋、奶等产品的质量等方面具有重要作用。
然而，目前市场上能够应用于畜牧业的益生芽孢杆菌产品品种较为单一，且质量参差不齐。
因此对于动物益生芽孢杆菌的筛选及发酵条件优化等方面的研究具有一定的实际意义和经济价值。
二、研究内容本研究旨在筛选出具有良好益生活性的动物益生芽孢杆菌菌株，并通过发酵条件优化提高其产酸数量和活菌数，进一步提高其应用价值。
具体研究内容如下：1. 通过文献调查和实验室试验等方法筛选出具有良好益生活性的动物益生芽孢杆菌菌株。
2. 利用单因素试验和正交试验等方法对所筛选出来的菌株在不同发酵条件下的产酸数量和活菌数进行优化。
3. 对比分析不同发酵条件下所得的发酵液中菌体、菌液等生物活性物质的含量、理化性质、成分等特征。
4. 通过动物实验等方法评价所筛选出的益生菌菌株在畜牧业中的应用效果。
三、研究方法1. 文献调查：通过检索相关文献，了解现有的动物益生芽孢杆菌菌株和发酵条件，为后续实验提供依据。
2. 菌株筛选：采用不同培养基和培养条件，筛选出具有良好益生活性的动物益生芽孢杆菌菌株。
3. 发酵条件优化：采用单因素试验和正交试验的方法，对所筛选菌株在不同发酵条件下的产酸数量和活菌数进行优化。
4. 生物活性物质含量及成分分析：采用化学分析方法，分析不同发酵条件下发酵液中的生物活性物质含量及成分特征。
5. 动物实验评价：采用以饲料为载体喂养动物的方法，评价所筛选出的益生菌菌株在畜牧业中的应用效果。
木聚糖酶高产菌株的筛选及产酶条件
中 图 分 类 号 ： ９ ９９ Ｑ ３ ．９ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ ３０ ２ （０ ０ ０ －１５０ １７ －９ ５ ２ １ ）２ １－６ ０
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产木聚糖酶菌株的筛选、鉴定及木聚糖酶的分离纯化的开题报告
产木聚糖酶菌株的筛选、鉴定及木聚糖酶的分离纯化的开题报告一、研究背景及意义纤维素和木质素是支撑植物细胞壁的主要成分，其中的木聚糖占据了木质素的三分之一到一半。
在生物质能源转化和纤维素生物降解这两个领域中，木聚糖酶（xylanase）作为一种重要的酶类，在分解木质素中发挥关键作用。
因此，开展对产木聚糖酶菌株的筛选、鉴定及木聚糖酶的分离纯化研究，对于优化纤维素资源利用、提升生物质能源转化效率具有重要意义。
二、研究内容及方法1. 产木聚糖酶菌株的筛选从不同源头的样品中采集到自然环境中的细菌和真菌，基于半定量titrimetric法筛选并获得高产木聚糖酶的真菌和细菌菌株。
2. 产木聚糖酶菌株的鉴定采用16S rRNA基因序列比对及盖镁提法（Gram’s staining）等方法对获得的菌株进行鉴定，并进行系统发育的分析。
3. 木聚糖酶的分离纯化摸索适宜的工艺流程条件，如阳离子交换、凝胶渗透等方法，对木聚糖酶进行初步的分离纯化。
并采集部分纯化产物，结合液相色谱-质谱联用技术进行酶学性质的分析。
三、研究意义和创新性1. 针对生物质能源转化和降解这一前沿领域，该研究为更好地开展固体废弃物的生物处理提供了有力的支撑，并为该领域的进一步开发与应用提供了科学的支撑。
2. 研究通过筛选、鉴定产木聚糖酶菌株，并通过对木聚糖酶的分离纯化来提高酶的活性，这一思路在开发新型酶的研究方法与探索中具有一定的创新性，并有望探索出更加高效的方法来促进木聚糖的降解和生物质能源的转化。
四、研究进展与展望1. 目前的研究已获得一些具有潜力的产木聚糖酶菌株，并完成了初步的酶学性质分析，证明该研究在获得更好的酶类推广过程中十分有效。
2. 下一步将进一步深入研究木聚糖酶的分离纯化机制，并结合高通量荧光基质技术及细胞隔离技术对所得酶的生化机制进行深入研究，探索木质素降解转化机理，并进行开发性应用的进一步探究。
响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W-3菌株产木聚糖酶发酵条件
中国畜牧兽医 2024,51(3):936-944C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i ne 响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W -3菌株产木聚糖酶发酵条件肖 遥1,李旭旭1,闫丽欢1,范新凤1,薛智权1,荆小院1,赵 燕2,冯 焱1(1.山西农业大学生命科学学院,太谷030801;2.山西农业大学动物科技学院,太谷030801)摘 要:ʌ目的ɔ应用响应面法对产木聚糖酶的工艺进行优化,为进一步大规模生产提供参考依据㊂ʌ方法ɔ通过单因素试验分别考察碳源㊁氮源㊁p H ㊁温度㊁接种量和转速6个因素对蜡样芽孢杆菌W -3产木聚糖酶的影响㊂通过D e s i g nE x p e r t 10.0.3软件中的B o x -B e h n k e n 进行响应面优化设计㊂通过对小麦麸皮㊁氯化铵㊁p H ㊁温度㊁接种量和转速进行不同组合,系统地优化了发酵条件㊂利用二次响应面回归方法建立酶产量与各因素之间的数学模型,并通过回归分析确定各因素对酶产量的影响程度㊂ʌ结果ɔ小麦麸皮添加量㊁氯化铵添加量㊁p H 和温度是影响发酵的主效应因素,单因子优化显示,蜡样芽孢杆菌W -3发酵产木聚糖酶条件为小麦麸皮35g /L ㊁氯化铵5g /L ㊁p H8.0㊁温度70ħ㊁接种量2%㊁转速210r /m i n ㊂在单因子优化的基础上进一步应用响应面优化,找到了更优的发酵参数,经过优化后的发酵条件为小麦麸皮33.0g /L ㊁氯化铵5.1g /L ㊁p H 8.3㊁温度73ħ㊁接种量2%㊁转速210r /m i n ,该条件下蜡样芽孢杆菌W 3发酵产生的木聚糖酶的酶活为523.24U /m L ㊂ʌ结论ɔ本试验通过响应面法优化了蜡样芽孢杆菌W -3发酵条件,在33.0g /L 小麦麸皮㊁5.1g /L 氯化铵㊁p H8.3㊁73ħ㊁2%接种量㊁210r /m i n 条件下,可获得较高的木聚糖酶的酶活(523.24U /m L ),比优化之前(225.53U /m L )提高了2.32倍㊂关键词:蜡样芽孢杆菌W -3;木聚糖酶;B o x -B e h n k e n 设计;响应面法中图分类号:S 852.61+6文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.03.005 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-03基金项目:山西省自然科学基金项目(20210302124018);山西省科技厅转化项目(J 241942022)联系方式:肖遥,E -m a i l :x i a o y a o s c i @126.c o m ㊂通信作者冯焱,E -m a i l :f e n g ya n 0927@s i n a .c o m S i m u l a t i o nO p t i m i z a t i o no f F e r m e n t a t i o nC o n d i t i o n s f o rX yl a n a s eP r o d u c t i o no f B a c i l l u s c e r e u s W -3b y R e s p o n s e S u r f a c eM e t h o d o l o g yX I A O Y a o 1,L IX u x u 1,Y A N L i h u a n 1,F A N X i n f e n g 1,X U EZ h i qu a n 1,J I N G X i a o yu a n 1,Z H A O Y a n 2,F E N G Y a n 1(1.C o l l e g e o f L i f eS c i e n c e ,S h a n x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,T a i g u 030801,C h i n a ;2.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S h a n x i A gr i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,T a i gu 030801,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i s e x p e r i m e n tw a s a i m e d t oo p t i m i z e t h e p r o d u c t i o n p r o c e s so f x yl a n a s e u s i n g r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ,s oa st o p r o v i d ear e f e r e n c eb a s i sf o rf u r t h e rl a r ge -s c a l e p r o d u c t i o n .ʌM e t h o d ɔE m p l o y i n g s i n g l e -f a c t o r e x p e r i m e n t s ,t h e i n f l u e n c eo f s i x f a c t o r s ,i n c l u d i n gc a r b o ns o u r c e ,n i t r o g e ns o u r c e ,p H ,t e m p e r a t u r e ,i n o c u l u ms i z ea n da g i t a t i o ns p e ed ,o nx y l a n a se p r o d u c t i o nb y B a c i l l u s c e r e u s (B .c e r e u s )W -3w a se x a m i n e d m e t i c u l o u s l y.T h eB o x -B e h n k e n r e s p o n s es u r f a c e o p t i m i z a t i o n d e s i g n i n D e s i g n E x p e r t 10.0.3s o f t w a r e w a s a p pl i e d .T h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es y s t e m a t i c a l l y o p t i m i z e db y v a r y i n g c o m b i n a t i o n so fw h e a tb r a n ,a m m o n i u mc h l o r i d e ,p H ,t e m p e r a t u r e ,i n o c u l u m s i z ea n da g i t a t i o ns p e e d .A m a t h e m a t i c a lm o d e l3期肖遥等:响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W-3菌株产木聚糖酶发酵条件f o r e n z y m e p r o d u c t i o ni nr e l a t i o nt ot h e s ef a c t o r s w a se s t a b l i s h e du s i ng a q u a d r a t i cr e s p o n s e s u r f a c er e g r e s s i o n m e th o d.T h ei m p a c tl e v e l s o f e a c h f a c t o r o n e n z y m e p r o d u c t i o n w e r e d e t e r m i n e dt h r o u g h r e g r e s s i o n a n a l y s i s.ʌR e s u l tɔT h e a d d i t i o n o f w h e a t b r a n,a m m o n i u m c h l o r i d e,p Ha n d t e m p e r a t u r ew e r e t h em a i n e f f e c t f a c t o r s a f f e c t i n g f e r m e n t a t i o n.T h r o u g h s i n g l e-f a c t o r o p t i m i z a t i o n,i t h a db e e nd e t e r m i n e d t h a t B.c e r e u s W-3f e r m e n t s t o p r o d u c e x y l a n a s e u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s:W h e a tb r a nc o n c e n t r a t i o no f35g/L,a m m o n i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o n o f5g/L,p H8.0,at e m p e r a t u r eo f70ħ,a ni n o c u l u m s i z eo f2%,a n da na g i t a t i o ns p e e do f 210r/m i n.H a v i n g b u i l t u p o n t h e s i n g l e-f a c t o r o p t i m i z a t i o n,f u r t h e r r e s p o n s e s u r f a c e o p t i m i z a t i o n l e d t o t h ed i s c o v e r y o f s u p e r i o r f e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r s.T h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s i n c l u d e d33.0g/Lw h e a t b r a n,5.1g/La m m o n i u mc h l o r i d e,p H8.3,a t e m p e r a t u r eo f73ħ,a n i n o c u l u ms i z eo f2%,a n da na g i t a t i o ns p e e do f210r/m i n.U n d e rt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s,x y l a n a s e e n z y m a t i c a c t i v i t y p r o d u c e d b y B.c e r e u s W-3r e a c h e d523.24U/m L.ʌC o n c l u s i o nɔI nt h i se x p e r i m e n t,t h e B.c e r e u s W-3f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w a so p t i m i z e db y r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y.U n d e r t h ec o n d i t i o n so f33.0g/L w h e a tb r a n,5.1g/La m m o n i u m c h l o r i d e,p H8.3,73ħ,2%i n o c u l u ms i z e a n d210r/m i n,a s i g n i f i c a n t l y h i g h e rx y l a n a s ea c t i v i t y o f523.24U/m L c o u l d b e o b t a i n e d,r e p r e s e n t i n g a2.32-f o l d i n c r e a s e c o m p a r e d t o p r e-o p t i m i z a t i o n l e v e l(225.53U/m L).K e y w o r d s:B a c i l l u s c e r e u s W-3;x y l a n a s e;B o x-B e h n k e nd e s i g n;r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y木聚糖酶在自然界分布广泛,可从动物㊁植物和微生物中获得[1-3]㊂木聚糖是麸糠类中普遍存在的抗营养因子,是饲料半纤维素的主要成分之一[4],其多孔网状结构包裹的营养物质未能充分利用[5],猪禽体内不分泌半纤维素酶,因此半纤维素不能被其内源消化酶降解,其在肠道内吸收水分并形成胶体,从而阻碍动物消化吸收,限制麸糠类原料在单胃动物饲料中应用[6-7]㊂木聚糖酶可将饲料中的非淀粉多糖(n o n-s t a r c h p o l y s a c c h a r i d e s,N S P)分解成较小聚合度的低聚木糖,改善饲料性能,消除或降低N S P在动物肠胃中因黏度引起的抗营养作用,同时可破坏植物细胞壁的结构,提高内源性消化酶的活性,改善饲料养分的利用[8-10]㊂通过产木聚糖酶的微生物,可以拓宽饲料原料中木聚糖㊁纤维素等抗营养物质的使用范围,加大非常规饲料如麸皮和米糠在饲料中的用量,降低饲料配方成本,并可提高动物对饲料的营养转化效率,提升集约养殖效益等[11]㊂筛选天然产木聚糖酶微生物并利用生物工程改良低附加值的农业副产物,提升生物技术联合畜牧业低碳环保发展整体水平,利用发酵工程技术对产酶菌株进行发酵条件优化,提高菌株产酶利用率是解决该问题行之有效的方法,也是目前酶工程发酵领域研究的热点㊂响应面法(r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y,R S M)在生物学领域主要用于研究反应混合物中各反应成分所占比例与产物生物学活性之间的关系,以确定生物材料的最优试验条件[12]㊂R S M能弥补单因素方法的缺陷,可通过建立数学模型,预测不同因素对响应变量的影响,拟合最优的因素组合,了解不同因素之间的相互作用,利用该优化法能提高菌株产酶性能,考察各因素之间的交互作用和各因素的最佳水平,快速有效地确定多因子系统的最佳条件[13]㊂蜡样芽孢杆菌在饲料中的应用效果显著[14],能够改善动物的生长性能[15],增强免疫反应和抗病能力[16],同时具有抑制有害菌生长的作用㊂此外,蜡样芽孢杆菌还具有丰富的酶系,包括淀粉酶㊁蛋白酶㊁纤维素酶等[9]㊂本研究运用单因素和R S M对蜡样芽孢杆菌W-3产木聚糖酶在摇瓶发酵条件基础上进行优化,通过单因素试验确定最适培养基组分,结合B o x-B e h n k e n设计和R S M确定最佳产木聚糖酶发酵条件,以期为进一步大规模生产提供基础资料㊂1材料与方法1.1材料原料:甘蔗渣(山西雄达米业有限公司)㊁玉米芯粉(本地产玉米)㊁燕麦㊁小麦麸皮和小麦秆粉(山西文水副产品公司)㊂蜡样芽孢杆菌W-3菌株由山西农业大学生命科学学院315实验室保存,保藏号为C GM C C 19785㊂739中国畜牧兽医51卷L B培养基:N a C l10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母粉5.0g/L,p H7.0㊂基础产酶培养基:榉木木聚糖5.0g/L,蛋白胨5.0g/L,N a C l1.0g/L,K2H P O42.0g/L,C a C l2-2H2O0.1g/L,M g S O4-7H2O0.1g/L,酵母粉1.0g/L㊂1.2木聚糖酶活力测定取0.9m L1%榉木木聚糖溶液于50m L离心管,加入0.1m L稀释酶液,置于37ħ水浴锅中恒温加热30m i n;加入1m Ld d H2O和2m LD N S溶液充分混合,置于沸水浴中煮5m i n,结束后冷却至室温;加入d d H2O定容至25m L,混匀测D540n m值㊂用灭活的酶作空白对照㊂1个单位的木聚糖酶被定义为1m i n水解木聚糖底物形成1μm o l还原糖(以木糖计)所需的酶量㊂1.3蜡样芽孢杆菌W-3发酵单因素优化1.3.1碳源种类和添加量分别选取甘蔗渣㊁燕麦㊁玉米芯粉㊁小麦麸皮和小麦秆粉作为基础产酶培养基的唯一碳源,添加量均为15g/L,在2%接种量㊁60ħ㊁200r/m i n条件下培养㊂将小麦麸皮作为唯一碳源分别在基础产酶培养基中添加5㊁15㊁25㊁35㊁45㊁55g/L,在2%接种量㊁60ħ㊁200r/m i n条件下培养㊂1.3.2氮源种类和添加量分别以牛肉膏㊁蛋白胨㊁氯化铵㊁硫酸铵和尿素为基础培养基的唯一氮源,添加量为5g/L,在2%接种量㊁60ħ㊁200r/m i n 条件下培养㊂在培养基中分别添加1㊁3㊁5㊁7㊁9㊁11g/L氯化铵作为唯一氮源,在2%接种量㊁60ħ㊁200r/m i n条件下培养㊂1.3.3 初始p H分别调整发酵初始p H为6.0㊁7.0㊁8.0㊁9.0㊁10.0,在2%接种量㊁60ħ㊁200r/m i n条件下培养㊂1.3.4发酵温度分别在50㊁60㊁70㊁80㊁90ħ于2%接种量㊁200r/m i n条件下培养㊂1.3.5接种量将培养至对数期的菌种分别按接种量为0.5%㊁1.0%㊁1.5%㊁2.0%㊁2.5%㊁3.0%接入㊂1.3.6 转速分别选择150㊁170㊁190㊁210和230㊁250r/m i n培养㊂在进行单一变量调整时,其他变量的设置并未采用它们的最佳量㊂以上发酵均为48h后测定酶活,每组试验重复3次,取平均值㊂1.4响应面优化设计依据单因素试验结果,对小麦麸皮㊁氯化铵㊁p H 和发酵温度(分别记为A㊁B㊁C㊁D)进行B o x-B e h n k e n设计优化,按照B o x-B e h n k e n试验设计原则[17],各因子分别取3个水平,记为水平―1㊁0㊁1 (表1),进行响应面分析,运用D e s i g nE x p e r t10.0.3软件进行数据统计,得到最适发酵条件㊂表14因素3水平响应面分析试验设计T a b l e1E x p e r i m e n t a l d e s i g n f o r4-f a c t o r3-l e v e l r e s p o n s e s u r f a c e a n a l y s i s水平L e v e l s因素F a c t o r s小麦麸皮W h e a t b r a n/(g/L)氯化铵A m m o n i u mc h l o r i d e/(g/L)p H发酵温度F e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e/ħ―12537.060 03558.070 14579.0802结果2.1单因素条件优化2.1.1碳源对蜡样芽孢杆菌W-3产酶的影响以小麦麸皮木聚糖作为诱导碳源时酶活最高,为332.19U/m L(图1A),故选择小麦麸皮作为碳源㊂进一步探究小麦麸皮添加量对产酶的影响,结果显示,随着小麦麸皮量的增长,酶活力呈先增加后下降的趋势,当添加量为35g/L时酶活最高,为429.33U/m L (图1B)㊂2.1.2氮源对蜡样芽孢杆菌W-3产酶的影响以氯化铵为氮源时酶活最高,为364.33U/m L(图1C)㊂当氯化铵从1g/L增加至5g/L时,菌株产酶能力快速增加;当氯化铵从5g/L增加至11g/L 时,菌株产酶能力逐渐降低(图1D),确定最佳氯化铵添加量为5g/L㊂2.1.3 p H㊁温度㊁接种量和转速对蜡样芽孢杆菌W-3产酶的影响当p H8.0时,菌株产木聚糖酶能力最高;p H>8.0时,酶活逐渐下降(图1E)㊂8393期肖 遥等:响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W -3菌株产木聚糖酶发酵条件当发酵温度为70ħ时,发酵液酶活为475.61U /m L ㊂低于70ħ时,菌株生长不活跃,发酵液较黏稠;而高于70ħ时,酶活逐渐降低(图1F )㊂在0.5%~3.0%接种量下,菌株产酶量缓慢增加;当接种量为2.0%时,发酵液酶活为433.17U /m L ;当接种量为2.5%时,菌株产酶量下降(图1G )㊂在150~250r /m i n之间,随着转速的提高产木聚糖酶的酶活略有增加,但变化幅度较小,在210r /m i n 下测到酶活最高,为407.66U /m L (图1H )㊂图1 蜡样芽孢杆菌W -3产木聚糖酶单因素条件优化F i g .1 O p t i m i z a t i o no f o n e -f a c t o r c o n d i t i o n s f o r x y l a n a s e p r o d u c t i o nb y Ba c i l l u s c e r e u s W -32.2 响应面优化2.2.1 响应面设计及结果 由表2可知,发酵过程中酶活在325~522.42U /m L 之间,发酵条件为:小麦麸皮35g /L ,氯化铵5g /L ,pH8.0,发酵温度939中 国 畜 牧 兽 医51卷为70ħ,酶活为506.32~522.42U /m L ㊂运用D e s i g nE x pe r t 10.0.3软件,设小麦麸皮㊁氯化铵㊁pH 和发酵温度分别为A ㊁B ㊁C ㊁D ,以酶活Y 为响应值对表2数据进行多元回归拟合,得到二次多项回归方程:Y=515.22―6.79A ―8.75B +39.04C +9.77D ―28.16A B ―2.37A C ―20.36A D +19.41B C +10.4B D ―9.41C D-35.35A 2―44.27B2―75.74C 2-23.78D2㊂由表3可知,该回归模型极显著(P <0.01),失拟项不显著(P =0.2429),说明模型拟合程度好,试验值与预测值比较接近,可用该模型对酶活进行分析和预测㊂同时模型回归系数R 2=0.9805,调节后的R 2=0.9610,表明96.10%的数据可用该模型解释,方程可靠性较高㊂一次项p H ㊁发酵温度对酶活具有极显著影响(P <0.01),小麦麸皮㊁氯化铵对酶活具有显著影响(P <0.05),分析各因素的主效应关系为:C>D>B>A ,即p H>发酵温度>氯化铵>小麦麸皮㊂其二次项交互作用A B ㊁A D ㊁B C 对酶活具有极显著影响(P <0.01)㊂剔除对酶活影响不显著的因素,得到回归方程为:Y=515.22―6.79A ―8.75B+39.04C+9.77D ―28.16A B ―20.36A D+19.41B C ―35.35A 2―44.27B2―75.74C 2―23.78D2㊂表2 响应面优化酶活试验结果T a b l e 2 R e s u l t s o f r e s p o n s e s u r f a c e o p t i m i z e d e n z y m e a c t i v i t y t e s t 编号N o .A B C D 酶活E n z y m e a c t i v i t y/(U /m L )12538.070420.8124538.070451.0632578.070470.8244578.070388.4453557.060354.1263559.060441.9473557.080402.6483559.080452.8392558.060423.47104558.060461.82112558.080491.65124558.080448.57133537.070383.63143577.070325.00153539.070427.18163579.070446.20172557.070369.03184557.070361.45192559.070456.61204559.070439.57213538.060472.58223578.060425.37233538.080453.22243578.080447.62253558.070506.32263558.070519.11273558.070522.42283558.070507.74293558.070520.53A ,小麦麸皮(g /L );B ,氯化铵(g /L );C ,pH ;D ,发酵温度(ħ)㊂下同A ,W h e a t b r a n (g /L );B ,A m m o n i u mc h l o r i d e (g /L );C ,p H ;D ,F e r m e n t a t i o n t e m pe r a t u r e (ħ).T h e s a m e a sb e l o w 0493期肖遥等:响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W-3菌株产木聚糖酶发酵条件表3酶活模型及方差分析T a b l e3E n z y m e a c t i v i t y m o d e l a n d v a r i a n c e a n a l y s i s来源S o u r c e s离差平方和S u mo f o f f s e t s q u a r e s自由度F r e e d o m均方M e a n s q u a r eF值F-v a l u eP值P-v a l u e显著性S i g n i f i c a n c e模型M o d e l73158.27145225.5950.24<0.0001**A553.251553.255.320.0369*B919.281919.288.840.0101*C18287.90118287.90175.83<0.0001**D1145.2411145.2411.010.0051**A B3171.3813171.3830.49<0.0001**A C22.37122.370.220.6499n sA D1657.7111657.7115.940.0013**B C1507.3811507.3814.490.0019**B D432.851432.854.160.0607n sC D354.001354.003.400.0863n s A28106.0018106.0077.94<0.0001**B212713.58112713.58122.24<0.0001**C237208.32137208.32357.75<0.0001**D23669.4213669.4235.28<0.0001**残差R e s i d u a l e r r o r1456.0914104.01失拟项M i s f i t t e r m1225.7610122.582.130.2429n s 纯误差P u r e e r r o r230.33457.58总和T o t a l74614.3628*,差异显著(P<0.05);**,差异极显著(P<0.01);n s,差异不显著(P>0.05)*,S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05);**,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.01);n s,N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05)2.2.2响应面结果由图2可知,在p H8.0㊁温度为70ħ,当氯化铵较低时,随着小麦麸皮的增加,酶活呈先快速增加后逐渐减缓的趋势;当氯化铵较高时,随着小麦麸皮的增加,酶活逐渐降低(图2A)㊂小麦麸皮和初始p H㊁麸皮和发酵温度㊁氯化铵和初始p H㊁氯化铵和发酵温度及发酵温度和初始p H的交互效应,酶活呈现先增加后减少的趋势,其中发酵温度和初始p H的交互作用最强,发酵温度和氯化铵添加量交互作用最弱(图2B~2F)㊂2.2.3 最佳工艺条件确定及验证试验通过D e s i g nE x p e r t10.0.3软件分析得到蜡样芽孢杆菌W-3发酵产木聚糖酶的最优工艺条件为:小麦麸皮33.045g/L㊁氯化铵5.097g/L㊁初始p H8.251㊁发酵温度72.502ħ,将该条件修正为:小麦麸皮33.0g/L㊁氯化铵5.1g/L㊁p H8.3㊁发酵温度73ħ㊂在此最优条件下,经3次平行得到实测酶活为(523.24ʃ5.27)U/m L,与预测酶活(521.805U/m L)相差在5%范围内,表明预测值和试验值之间具有良好的相关性㊂149249中国畜牧兽医51卷图2两因素交互作用对酶活响应值的影响F i g.2E f f e c t o f t w o-f a c t o r i n t e r a c t i o no n e n z y m e a c t i v i t y r e s p o n s e v a l u e3期肖遥等:响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W-3菌株产木聚糖酶发酵条件3讨论工业微生物产酶量的高低与发酵条件关系密切,包括温度㊁p H㊁营养物质浓度㊁转速等因素㊂不同微生物对这些因素的需求不同,因此最佳发酵条件需根据微生物种类㊁酶特性和成本确定,常见的木聚糖酶生产菌株,如枯草芽孢杆菌[18-19]和曲霉[20-21],在30~37ħ效果较好㊂小麦麸皮添加量为35g/L时,发酵液黏稠度适中,溶氧充足,维持微生物代谢活性㊂此外,微生物的活性与p H密切相关,过高或过低的初始p H均不利于酶产生㊂响应面法是一种多元二次回归方法,它弥补了正交试验只能处理离散水平值的不足㊂该方法利用多项式函数拟合多因子试验中影响因子与考察指标的相互关系,分析各因子的交互作用,旨在全面分析所选参数㊂响应面法具有试验次数少㊁周期短㊁成本低及高精度的回归方程等优势,在发酵培养基优化方面国内外学者广泛应用响应面分析法取得了显著成果㊂本研究首先通过单因素试验确定了影响蜡样芽孢杆菌W-3发酵产木聚糖酶的8个因素,进一步优化确定最显著的4个影响因素:小麦麸皮添加量㊁氯化铵添加量㊁p H和发酵温度,然后用B o x-B e h n k e n 设计得出最佳发酵条件:小麦麸皮33.0g/L㊁氯化铵5.1g/L㊁p H8.3㊁温度73ħ㊁接种量2%㊁转速210r/m i n㊂优化后,蜡样芽孢杆菌W-3发酵产木聚糖酶的酶活可达到523.24U/m L,比优化前的木聚糖酶酶活(225.53U/m L)提高2.32倍㊂P a w a r 等[22]筛选得到1株腊肠球菌(L e c h e v a l i e r i a a e r o c o l o n i g e n e s),并采用响应面法对该菌产木聚糖酶的条件进行了优化,确定其最佳产酶温度35ħ㊁底物浓度3g/L㊁接种量4%,培养24h最大产率为5.75U/m L,比未优化前提高4.8倍㊂S h r e s t h a 等[23]从污染的肉汤中分离出产木聚糖酶芽孢杆菌(B a c i l l u s s p.),通过响应面法优化得出其最佳培养条件:培养温度40ħ㊁发酵时间24h㊁橘子皮1%㊁接种量2%,该条件下表现出最大的果胶酶(9.49U/m Lʃ1.25U/m L)和木聚糖酶(16.27U/m Lʃ0.52U/m L)活性㊂A lM o u s a等[24]通过B o x-B e h n k e n设计和响应面法优化确定了卷枝毛霉(M u c o r c i r c i n e l l o i d e s)和冻土毛霉(M u c o r h i e m a l i s)产木聚糖酶的最佳参数,分别为培养温度(30和20ħ)㊁p H(9.0和7.0)㊁发酵时间(9和9d)㊁接种量(3和3m L)以及底物浓度(3和3g/100m L),优化后卷枝毛霉和冻土毛霉产木聚糖酶活性最高分别为42.23和35.88U/m L㊂C u i等[25]从腐烂的农业废弃物中分离出来青霉菌(P e n i c i l l i u m s p.)WX-Z1,利用P l a c k e t t-B u r m a n和B o x-B e h n k e n设计对培养基中的营养源进行优化,以促进青霉菌WX-Z1生产木聚糖酶,确定培养基中的重要营养源为麦麸㊁酵母提取物㊁N a N O3㊁M g S O4和C a C l2,最佳量为:麦麸32.8g/L㊁酵母提取物1.02g/L㊁N a N O312.71g/L㊁M g S O40.96g/L㊁C a C l21.04g/L,在最佳条件下木聚糖酶产量达到46.50U/m L,与在30L生物反应器中进行发酵的原始培养基相比,木聚糖酶活性增加1.34倍㊂因此,响应面优化能够高效改善培养基的培养条件,使产量最大化,这对于工业化生产具有极其重要的意义㊂4结论以耐高温且高产木聚糖酶菌株蜡样芽孢杆菌W-3为研究对象,通过对其产酶条件进行了优化,使酶活力从225.53U/m L提高至523.24U/m L,较优化前提高了2.32倍㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B E R G Q U I S T P,T E O V,G I B B S M,e t a l.E x p r e s s i o n o f x y l a n a s e e n z y m e sf r o m t h e r m o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m s i nf u n g a lh o s t s[J].E x t r e m o p h i l e s,2002,6(3):177-184.[2] L AM SK,N GTB.Ax y l a n a s e f r o mr o o t s o f s a n c h ig i n s e n g(P a n a xn o t o g i n s e n g)w i t hi n h i b i t o r y e f f e c t so n H u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s-1r e v e r s et r a n s c r i p t a s e[J].L i f e S c i e n c 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纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化
纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜【摘要】To isolate efficient cellulase-producing bacteria, 180 bacterial isolated from rotten wood, humus, and other soil samples, and 44 were screened from them and confirmed as cellulase-producing bacteria by Gram's iodine solution staining. In the subsequent secondary screening tests, those 44 isolates were cultured in fermentation media and their total cellulase activities(FPase)were measured and compared. The strain J1-3-1, with the highest FPase activity, was identified as Sphingobacterium sp. by 16S rRNA sequence analysis. The optimal fermentation conditions for enzymes production of J1-3-1 were determined. Under the optimal conditions, its activities of FPase, CMCase, and β-glucosidase reached 8.76,28.04和7.02 U/mL, respectively. The results demonstrated that J1-3-1 wasa promising candidate for potential industrial production of cellulase.%以腐烂木材、腐殖土等材料作为菌源,从中分离出180个菌株,以期得到具有纤维素酶活性的菌株.采用革兰氏碘液染色法进行定性初筛,获得了44个纤维素酶产生菌株.将此44个菌株发酵培养后,使用滤纸酶活性测定法进行定量复筛,滤纸酶活性最高的是菌株J1-3-1.通过对J1-3-1菌株的16S rRNA的序列测定分析,将J1-3-1鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.).经对J1-3-1进行产酶发酵条件优化,分别确立了产生最高滤纸酶(FPase)活性、内切葡聚糖酶(CMCase)活性和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)活性的发酵条件.在最优发酵产酶条件下,菌株J1-3-1的滤纸酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最高酶活性分别为8.76、28.04和7.02 U/mL.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】7页(P146-152)【关键词】纤维素酶产生菌;筛选;鉴定;发酵;鞘氨醇杆菌【作者】李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜【作者单位】湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;Department of Biology,Lakehead University,Ontario,P7B 5E1,Canada【正文语种】中文随着人口的膨胀和经济的迅猛发展，全球对能源的需求量大幅提升，其中化石燃料占能源消耗的85%以上［1，2］。
中温木聚糖酶高产真菌菌株筛选及产酶条件
中温木聚糖酶高产真菌菌株筛选及产酶条件摘要:利用以木聚糖作为惟一碳源的基础盐培养基,在30℃培养条件下,从新乡周边土样及腐殖质中筛选到1株β-木聚糖酶高产真菌菌株(Fusarium sp. FLH28)｡该菌株在20~40 ℃生长良好,最适生长温度30 ℃｡产酶培养条件优化结果表明,在培养温度为30 ℃,培养基初始pH 6.0,以玉米芯为碳源,以蛋白胨､酵母粉和玉米浆为有机氮源,发酵4 d,木聚糖酶活性达562.6 U/mL,木聚糖酶最适pH和温度分别为6.5和40 ℃｡关键词:中温木聚糖酶;真菌;筛选菌株;产酶条件Screening and Identification of Moderate Temperature β-Xylanase-Producing Fungi and Optimizing Conditions for Enzyme ProductionAbstract: A β-xylanase producing fungi, Fusarium sp. FLH28, was isolated from soil and humus samples from Xinxiang at 30 ℃ by using basal medium supplemented with xylan as the sole carbon source. The strain FLH28 was capable of growing well at 20~40 ℃; and the optimum growth temperature was 30 ℃. The optimized enzyme production conditions of the strain were as follows, initial pH, 6.0; corncob as carbon source; peptone, yeast extraction and corn steep liquor as nitrogen sources; incubating for 4 d at 30 ℃. Under the optimized conditions, the maximum enzyme activity reached to 562.6 U/mL. Optimum pH and temperature of the xylanase was 6.5 and 40 ℃ respectively.Key words: moderate temperature xylanase; fungi strain(Fusarium sp. FLH28); screening; conditions of enzyme production木聚糖是植物细胞主要结构性多糖,主链由多个β-D-吡喃木糖基通过β-1,4-糖苷键连接的复杂分子多聚糖,主链连有各种取代基,分子中含有许多葡萄糖醛酸､乙酰基､阿拉伯糖､阿魏酸､香豆酸等侧链基团[1]｡木聚糖是自然界含量仅次于纤维素的第二大类多糖,是半纤维素中含量最丰富的一种组分,占地球可再生有机碳的1/3[2]｡它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面,进而影响动物的消化吸收,降低了饲料的营养价值｡木聚糖酶(Xylanase,EC 3.2.1.8)主要以内切方式作用于木聚糖主链上的β-1,4-糖苷键,水解生成以木二糖为主的低聚糖[3],它在生物转化､食品､饲料､医药､能源､造纸､纺织等行业中有着广泛的应用[4],具有很大的商业开发价值｡迄今为止,关于产无纤维素酶活性木聚糖酶的菌株报道很多,包括细菌､真菌和放线菌,其中曲霉属和芽孢杆菌属种类最多[5-8]｡目前,关于耐高温木聚糖酶菌株的筛选是木聚糖酶研究的一个热点,耐高温木聚糖酶对于工业生产木糖高温快速反应及饲料用酶制粒过程的酶活损失有一定的优点,但在37 ℃左右普遍存在酶活较低的问题,对于一些瘤胃动物来说,其最适作用pH往往偏离中性的范围,不利于在饲料中的应用｡因此,筛选中温､最适pH中性且在一定范围内有良好热稳定性的产木聚糖酶菌株对于木聚糖酶在饲料中的应用具有重要的作用｡目前人们研究较多的真菌主要包括木霉､毛霉和曲霉等,关于镰刀菌属(Fusarium)菌种产木聚糖酶的研究很少,且产酶水平较低,在30 U/mL以下[9-12]｡试验筛选得到1株高产木聚糖酶菌株Fusarium sp. FLH28,并对其产酶条件进行了初步研究｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集样品采集于河南新乡周边土壤及太行山南麓丛林土壤及腐殖质中｡1.1.2 培养基1)筛选培养基(g/L):NH4Cl 1.0,(NH4)2SO4 1.0,KH2PO4 0.1,CaCl2 0.4,MgSO4·7H2O 0.1,玉米芯木聚糖1.0,琼脂粉15.0,用HCl调pH 至5.5｡2)分离培养基:PDA培养基[13]｡3)发酵基础盐培养基(g/L):KH2PO4 1.0,MgSO4·7H2O 0.3,CaCl20.4,FeSO4·7H2O 0.1｡1.1.3 试剂酵母提取物､胰蛋白胨(Oxoid);榉木木聚糖､地衣多糖､昆布多糖､微晶纤维素(Avicel)､CMC-Na､木糖(Sigma);标准低相对分子质量蛋白质(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所);玉米芯木聚糖(自制);其他试剂均为分析纯｡1.2 试验方法1.2.1 产木聚糖酶菌株分离分别取土样及腐殖质1 g左右,加入装有灭菌的10 mL 0.9%的NaCl溶液的小三角瓶中,室温振荡30 min,取0.1 mL 涂布筛选平板,倒置,于30 ℃培养3~5 d｡用灭菌牙签挑取单菌落菌丝,转接于PDA分离培养基进行单菌落分离｡1.2.2 产木聚糖酶菌株复筛用接种铲取面积约1 cm2 的菌块,接种于含有蛋白胨10 g/L､酵母粉10 g/L和大麦粉20 g/L的发酵培养基上,180 r/min,30 ℃培养3~5 d｡取发酵液1 mL 10 000 r/min离心5 min,取上清液测定酶活性｡1.2.3 木聚糖酶活性测定取1.0 mL底物溶液与经适当稀释的酶液0.1 mL混合,反应10 min后,沸水煮5 min中止反应,以木糖等作标准,酶活性通过DNS法测定还原糖含量得出[14]｡酶活性单位的定义为:40 ℃､pH 6.5的磷酸缓冲液(50 mmol/L)及底物浓度为10 g/L条件下,每分钟生成1 μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活性单位｡1.2.4 菌种初步鉴定肉眼观察菌落形态和颜色等,石炭酸-棉蓝染色,显微镜观察菌丝､分生孢子梗及孢子形态｡1.2.5 木聚糖酶酶谱分析SDS-PAGE电泳[15]中加入0.1%木聚糖,电泳完毕,20%异丙醇复性3次,50 mmol/L pH 6.5的磷酸缓冲液浸泡3次,每次10 min,直到紫外下显示透明条带｡1.2.6 产木聚糖酶条件优化30 ℃生长4 d的菌落制成孢子悬液(108个/mL),接种添加各种氮源和碳源的基础盐培养基,500 mL三角瓶装量25 mL｡考查不同条件对产酶的影响,试验结果为3次平行试验的平均值｡1.2.7 产木聚糖酶最适pH和最适温度确定40 ℃下,分别测定重组酶在pH2.5~11.0的4种不同缓冲液(50 mmol/L,柠檬酸缓冲液pH 2.5~5.5,MES缓冲液pH 5.0~7.0,磷酸缓冲液pH 6.0~8.5,甘氨酸-NaOH缓冲液pH 8.5~11.0)中的相对酶活性,以最高酶活性为100%;分别于20~90 ℃测定相对酶活性,以最高酶活性为100%｡结果为3次试验数据的平均值｡2 结果与分析2.1 产木聚糖酶菌株筛选结果经含单一碳源的木聚糖筛选平板和30 ℃筛选,共筛选得到产木聚糖酶真菌菌株24株,经摇瓶发酵和酶活性测定,发现1株真菌产酶活性较高,为424.2 U/mL｡该菌株在20~40 ℃范围内生长良好,最适生长温度30 ℃左右｡PDA培养基30 ℃培养4 d的单菌落呈突起絮状,菌丝白色疏松(图1a),背面呈浅褐色(图1b)｡石炭酸-棉蓝染色的菌丝分枝有隔;分生孢子梗单生,散生于气生菌丝上,产生大型分生孢子,镰刀形(图2)｡因此,根据菌落外观形态､颜色,孢子和孢子梗形态[16],初步鉴定该菌株为镰刀菌属,菌株命名为Fusarium sp. FLH28｡2.2 木聚糖酶酶谱分析结果为考查镰刀菌FLH28是否产多个木聚糖酶,取粗酶液进行木聚糖酶的酶谱分析｡结果显示,酶谱只有一条透明带(图3),相对分子质量约为22 600,和多数产木p 2.3.2 碳源添加量对产木聚糖酶的影响于含有蛋白胨和酵母粉各10 g/L的基础盐培养基中,分别添加不同量玉米芯进行产木聚糖酶试验,结果表明,在玉米芯添加量为50 g/L时,酶活性最高(图5)｡随玉米芯含量的增加,酶活性反而有下降的趋势,可能是含量过高的玉米芯影响培养基的流动性,降低氧传递速率所致｡2.3.3 氮源对产木聚糖酶的影响通过添加不同种类和数量的氮源进行试验,30 ℃培养4 d,测定发酵液酶活性,确定产酶的最佳氮源｡结果(表1)表明,以复合氮源豆粕粉+玉米浆及酵母粉+蛋白胨+玉米浆较好,酶活性分别为473.6和482.5 U/mL,即添加玉米浆的复合氮源对木聚糖酶的产生具有较强的促进作用,可能是由于玉米浆中营养成分全面所致,具体原因有待进一步分析｡考虑到工业应用成本,后续试验采用复合氮源豆粕粉+玉米浆｡2.3.4 培养基起始pH对产木聚糖酶的影响以NaH2PO4-Na2HPO4缓冲体系配制浓度为100 mmol/L､不同pH(4.0~8.0)的培养基,接种等量的孢子悬浮液,30 ℃培养4 d,测定酶活性｡结果(图6)显示,培养基起始pH对菌株产酶有明显的影响,最适产酶培养基起始pH 6.0左右,在pH低于5.0及pH高于7.0时,酶活性显著下降｡2.3.5 培养温度对产木聚糖酶的影响接种后的培养液分别于20~45°C培养4 d后,取发酵液测定酶活性,结果见图7｡由图7可见,培养温度对产酶有显著影响,产酶最适培养温度为30 ℃左右,当培养温度高于40 ℃,菌体生物量显著下降,同时,酶活性也显著降低｡2.3.6 培养时间对产木聚糖酶的影响在上述优化条件下,分别培养不同时间,从24 h开始,每隔12 h取样分析酶活性｡结果(图8)表明,在培养120 h时,酶活性最高,达562.6 U/mL,随后酶活性出现缓慢下降,在156 h发现菌丝有自溶现象,但没有出现酶活性快速下降趋势,可能与木聚糖酶对蛋白酶的敏感性低有关｡2.4 FLH28所产木聚糖酶最适pH和最适温度镰刀菌FLH28所产木聚糖酶最适pH约6.5(图9a),在pH 5.0~8.0时相对酶活性可达80%以上｡最适作用温度约40 ℃(图9b),高于70 ℃,相对酶活性显著降低,在30~50 ℃时相对酶活性可达85%以上,表明该木聚糖酶有较宽的pH和温度作用范围｡3 结论从新乡周边土样及腐殖质中筛选得到1株高产木聚糖酶真菌菌株,经对菌落形态特征及分生孢子梗和分生孢子形态的显微观察,初步鉴定为镰刀菌属菌株命名为Fusarium sp. FLH28,其最适生长温度30 ℃,在20~40 ℃时,生长良好｡在培养温度为30 ℃,培养基初始pH 6.0,以玉米芯为碳源,以豆粕粉+玉米浆为氮源,发酵5 d,木聚糖酶活性达562.6 U/mL｡真菌来源木聚糖酶大都热稳定性差,酶作用的最适温度为40~45 ℃,55 ℃以上快速失活｡木聚糖酶要广泛经济高效应用于饲料工业应具备一定条件,要求饲用木聚糖酶有较好的热稳定性且在pH较宽的范围内能保持较高的活性｡而现在颗粒料制粒过程中有一个短暂的高温过程,温度为75~93 ℃,多数木聚糖酶在此高温下会大幅度地丧失活性;同时,饲料中的木聚糖酶最终的作用场所是动物正常体温37 ℃左右的胃肠中,因此能耐制粒高温,且在动物正常体温下具有较高活性成为木聚糖酶在生产中应用的关键｡菌株Fusarium sp. FLH28所产木聚糖酶在pH 4.5~8.5时相对酶活性可达60%以上,在温度60 ℃时相对酶活性可达73%以上,表明该木聚糖酶可很好地应用于食品及饲料工业中｡参考文献:[1] OBEL N,NEUMETZLER L,PAULY M. Hemicelluloses and cell expansion[J]. Plant Cell Monographs,2007,6:57-88.[2] COLLINS T,GERDAY C,FELLER G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases[J]. FEMS Microbiology Reviews,2005,29:3-23.[3] DIETMAR H, BERND N, KLAUS D, et al. Production of fungal xylanases[J]. Bioresourse Technology,1996,58:137-138.[4] SUNNA A, ANTRANIKIAN G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria[J]. Crit Rev Biotechnol,1997,17:39-67.[5] ANTHONY T,RAJK C, RAJENDRAN A, et al. 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木聚糖酶产生菌的筛选、发酵及酶学性质
木聚糖酶产生菌的筛选、发酵及酶学性质何敏超; 刘云云; 陈小燕; 许敬亮; 闫志英; 张金峰【期刊名称】《《中国酿造》》【年(卷),期】2019(038)012【总页数】5页(P107-111)【关键词】木聚糖酶; 黑曲霉; 筛选; 固态发酵【作者】何敏超; 刘云云; 陈小燕; 许敬亮; 闫志英; 张金峰【作者单位】中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室广东省新能源和可再生能源研究开发与应用重点实验室广东广州 510640; 中国科学院成都生物研究所中国科学院环境与应用微生物重点实验室环境微生物四川省重点实验室四川成都 610041; 淮阴工学院江苏省生物质转化与过程集成工程实验室江苏淮安 223003【正文语种】中文【中图分类】Q556木聚糖是被子植物细胞壁中半纤维素的主要成分，其含量仅次于纤维素，是一种丰富的可再生资源。
作为一种杂多糖，其主链由D-木糖以β-1,4-糖苷键连接而成，其侧链由种类各异的糖基侧链组成[1]。
木聚糖酶是指能够降解木聚糖的一组酶的总称。
根据对木聚糖作用方式的不同，分为β-1,4-外切木聚糖酶、β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等。
狭义上的木聚糖酶仅限于β-1,4-内切木聚糖酶。
木聚糖酶的来源相当广泛，已报道产木聚糖酶的微生物主要有曲霉属、木霉属、青霉属、壳霉属、芽孢杆菌和链霉菌等[2-5]。
木聚糖酶在食品、制浆造纸、饲料、生物能源等领域中具有广阔的应用前景。
在食品行业中，木聚糖酶可有效改善面团的持水性和稳定性，增大烘烤后面包的体积，改善面包心质地，降低面包的老化速率，延长货架寿命[6-7]。
在制浆造纸领域中，它可用于纸浆漂白，提高纸浆白度并降低化学漂白剂的用量[8-10]。
在饲料行业中，它可降低水溶性木聚糖导致的食糜黏性增高，同时木聚糖酶可作用于非淀粉多糖，破碎植物细胞壁，最终释放出营养物质[11-12]。
在生物能源领域中，木聚糖酶可以提升木糖的得率，增大总还原糖的量[13-14]。
半纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的研究
半纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的研究张庆芳;马菁玲;孔秀琴;贾小宁;陈吉祥;赵霞【摘要】实验采用木聚糖为唯一碳源,利用平板透明圈筛选和摇瓶培养基发酵相结合的方法,筛选得到一株具有木聚糖降解效果的菌株,记为2a1,经形态学和分子生物学鉴定为曲霉属(Aspergillus).通过液体摇瓶发酵对该株菌发酵产木聚糖酶所需的碳源、氮源、起始pH值、培养温度、培养时间等条件进行研究,从实验结果可以看到上述因素均对产酶量有一定的影响.在单因素的基础上,设计一个3因素3水平的正交试验,根据证交试验结果确定这株菌株的最佳产酶条件为:产酶培养基中木聚糖添加量为6g·L-1,起始pH值为4.5,30℃,150 r·min-1恒温振荡箱培养84h;其中起始pH值的影响最为显著.【期刊名称】《中国沼气》【年(卷),期】2015(033)005【总页数】5页(P11-15)【关键词】筛选;木聚糖酶;液体发酵;优化【作者】张庆芳;马菁玲;孔秀琴;贾小宁;陈吉祥;赵霞【作者单位】兰州理工大学石油化工学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学石油化工学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学石油化工学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学石油化工学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学石油化工学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学石油化工学院,甘肃兰州730050【正文语种】中文【中图分类】Q539.5;S216.4近年来由于产业结构调整，水果和蔬菜集约化种植的迅速发展，果蔬废弃物的大量产生和富集已经构成了对农田、水体、果蔬配送市场和其他人居环境的严重威胁，成为一种不可忽视的污染源。
据统计，中国每年产生的果蔬废弃物高达l 亿吨，其中绝大部分没有进行资源化利用而被当作垃圾随意丢弃或者排放到环境中，给空气、水体和人居环境都带来了风险。
因此，对果蔬废弃物的处理、加工和利用成为消除污染实现资源化利用的必然途径。
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关键 词
分类号
木聚糖酶 ； 芽孢杆 菌； 类 产酶条件 ； 优化
Ｑ ３ ． ９９９
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第３ ６卷 第 ９期 ２０ ０ ８年 ９月
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配方对菌株进行摇 瓶培 养 ， 最佳培养条件为 ： 始 ｐ ７０ 温度 ３ ℃ 、 转数 ２０／ ｉ， 初 Ｈ＝ ． 、 ２ 摇床 ２ ｍｎ在此条件 下培养 ９ ， ｒ ６ ｈ 发酵液 中木聚糖 酶活力达到 １４６ 是未经优化的基础产酶培养条件产 酶能力的 １５ 倍 。 ９．７ Ｕ， Ｉ ．８
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类芽孢杆菌木聚糖酶产生菌株的筛选及其产酶条件优化
包怡红 李雪龙 杨 传平
（ 东北林业 大学 ， 哈尔滨 ，５０ ０） １０４
摘 要 以木 聚糖 为唯 一碳 源 ， 富含半纤 维素 的土壤 中分 离纯化 出 １５株 产木 聚糖 酶的 茵株 ， Ｄ Ｓ法从 从 １ 以 Ｎ 中筛选 出一株 木聚糖酶酶活最高的细菌 ， １ Ｄ Ａ鉴定 其为类 芽孢杆 菌。经单 因素试验 和正 交设 计试 验 ， 经 ６Ｓｒ Ｎ 得 出该菌株 的最佳产酶培养基为 ： 玉米芯木聚糖 ３ ． Ｌ 胰蛋 白胨 ６ ＯｇＬ Ｈ Ｏ ５ ０ｇＬ 吐温 ８ ． Ｌ Ｏ０ 、 ． ／ 、 Ｐ ． 、 ／ ０３ Ｏ 。用此
ｌ ｄ ｒ ａ ｈ ｄ １ ４ ６ Ｕ ｅ ｕ ｔ ｒ ｄ ｉ ｂ ｅ ｔｃ ｌｕ ｅ ｍｅ ｉ ｍ ｎ ｎ ｅ ｈ ｐ ｉ ｕｔ ｅ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｆ ｒａ ｏ ｔ９ ｆ ｉ ｅ ｃ ｅ ９ ． ７ Ｉ ｗｈ ｎ ｃ ｌｕ ｅ ｎ ｔ ｅ ｂ ｓ ｕ ｔ ｒ ｄｕ ａ ｄ ｕ ｄ ｒｔ ｅ ｏ ｔ ｌｃ ｌ ｒ ｏ ｄ ｔ ｎ ｏ ｂ ｕ ６ ｕ ｍａ ｕ ｉ ｈ ｕ ｓ ｈ ｃ ｓ １ ５ ｉ ｓ ｏ ｅ ｏ ｇ ｎ ｌｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｏ ｒ ，ｗ ｉｈ ｗａ ． ８ ｔ ｍｅ ｆｔ ｒ ｉ ａ ｏ ｄｔ ｎ ． ｈ ｉ ｉ Ｋｅ ｒ ｓ Ｘ ｌｎ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ｙ ａ ａ ｅ：Ｐ ｅ ｉａ ｉ ｕ ｐ ａ ｎ ｂ ｃｌ ｓｓ ．：Ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｃ ｌｕ ｅ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｐ ｉ ｚ ｔ ｎ ｌ ｒ ｃ ｉ ｕｔ ｒ ｏ ｄ ｔ ｎ ；Ｏ ｔ ｄ ｏ ｉ ｍｉａｉ ｏ
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