抑制TRAF6的E3泛素连接酶活性减轻野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构

抑制TRAF6的E3泛素连接酶活性减轻野百合碱
诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构*
许正秋， 邱莉华， 陈
睿， 马
倩， 李冰冰△
（南京中医药大学附属鼓楼临床医学院麻醉科，江苏 南京 210008）
［摘
要］ 目的：探讨抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的E3泛素连接酶活性对野百合碱（MCT ）诱
导的肺动脉高压（PH ）大鼠肺血管重构以及相关信号通路的影响。

方法：采用随机数字表法将42只SPF 级健康成年雄性Sprague -Dawley 大鼠分为4组：对照组（n =6）、MCT 模型组（n =15）、C25-140（TRAF6特异性E3泛素连接酶活性抑制剂）组（n =6）和MCT+C25-140组（n =15）。

MCT 及MCT+C25-140组大鼠于实验开始时颈后皮下单次注射MCT 60 mg/kg ，建立PH 模型，其他2组大鼠皮下注射5% DMSO 作为对照。

C25-140组及MCT+C25-140组大鼠于第14天、21天和28天腹腔注射9.8 mg/kg C25-140。

第28天行超声心动图检测评估大鼠肺动脉压力和心室收缩力变化，之后对大鼠进行安乐死并取肺组织。

通过HE 染色和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）免疫荧光染色评估大鼠肺血管形态；采用免疫共沉淀检测大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs ）中信号转导及转录激活因子3（STAT3）的K63泛素化水平；Western blot 检测大鼠肺组织中TRAF6、STAT3、p -STAT3及cyclin D1的表达水平；免疫荧光染色观察大鼠肺血管TRAF6和STAT3的共定位情况。

结果：（1）与对照组比较，MCT 组大鼠肺动脉血流加速时间（PAAT ）和三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE ）明显减少（P <0.05），血管中膜厚度明显增加（P <0.05），α-SMA 免疫荧光染色显示肺小血管明显肌化，提示造模成功。

（2）与对照组相比，PH 大鼠PASMCs 中STAT3的K63泛素化明显升高。

（3）MCT 干预后28天，大鼠肺组织中TARF6、p -STAT3/STAT3比值及cyclin D1水平相对于对照组显著升高（P <0.05）；与MCT 组相比，MCT+C25-140组大鼠PAAT 、TAPSE 明显上升（P <0.05），血管中膜厚度明显减小（P <0.05）。

给予C25-140处理后，肺组织中TARF6、p -STAT3/STAT3比值及cyclin D1水平相对于MCT 组显著降低（P <0.05）。

（4）免疫荧光染色的结果显示MCT 组大鼠肺小动脉中膜TRAF6与STAT3存在显著共定位，C25-140处理能显著抑制两者的相互作用。

结论：抑制TRAF6的E3泛素连接酶活性可降低肺血管STAT3的磷酸化，下调cyclin D1表达，而且能减缓PH 大鼠肺动脉中膜增厚，减轻肺血管重构。

［关键词］ 肺动脉高压；肿瘤坏死因子受体相关因子6；信号转导及转录激活因子3；细胞周期蛋白D1；细胞凋亡；血管重构
［中图分类号］ R363.2； R285.5； R544.1+6 ［文献标志码］ A
doi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.10.006
Inhibition of TRAF6 E3 ubiquitin ligase activity attenuates pulmonary vas⁃
cular remodeling in monocrotaline -induced pulmonary hypertensive rats
XU Zhengqiu ， QIU Lihua ， CHEN Rui ， MA Qian ， LI Bingbing △
（Department of Anesthesiology ， Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine ，Nanjing 210008， China. E -mail ： icecolor@ ）
［ABSTRACT ］ AIM ： To investigate the impact of inhibiting E3 ubiquitin ligase activity targeting tumor necrosis factor receptor -related factor 6 （TRAF6） on pulmonary vascular remodeling and related signaling pathways in monocrota‐line （MCT ）-induced pulmonary hypertensive rats. METHODS ： A total of 42 healthy adult male Sprague -Dawley rats ， graded SPF ， were randomly allocated into four groups ： the control （CON ）group （n =6）， the MCT model group （n =15）， the C25-140 group （n =6）， and the MCT+C25-140 group （n =15）. Rats in the MCT and MCT+C25-140 groups received a
single subcutaneous injection of 60 mg/kg MCT on day 0 to establish the pulmonary hypertension model ，while rats in the other two groups were subcutaneously injected with 5% DMSO as a control. Rats in the C25-140 and MCT+C25-140 ［文章编号］ 1000-4718（2023）10-1773-07
［收稿日期］ 2023-08-08 ［修回日期］ 2023-09-07
* ［基金项目］ 南京市卫健委科技重点发展项目（No. ZKX20017）；南京市青年卫生人才第一层次培养项目（No. QRX17013）△通讯作者 Tel ：158****1974； E -mail ： icecolor@
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groups received intraperitoneal injections of 9.8 mg/kg C25-140 （a TRAF6-specific E3 ubiquitin ligase activity inhibitor）on the 14th， 21st and 28th day after MCT administration. Echocardiography was used to assess changes in pulmonary ar‐tery pressure and ventricular contractility on day 28. Afterward， the rats were euthanized， and lung tissue was extracted. Hematoxylin-eosin （HE）staining and α-smooth muscle actin （α-SMA）immunofluorescence staining were employed to evaluate the morphology of pulmonary vessels， while the K63 ubiquitin level of STAT3 in rat pulmonary arterial smooth muscle cells （PASMCs） was detected by immunoprecipitation. Western blot was used to assess the expression levels of TRAF6， signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）， p-STAT3 and cyclin D1 in lung tissue. Immunofluo‐rescence staining was performed to observe the co-localization of TRAF6 and STAT3 in pulmonary vessels.RESULTS： In comparison to the CON group， the MCT group rats exhibited a significant decrease in pulmonary artery flow acceleration time （PAAT） and tricuspid annular plane systolic excursion （TAPSE）（P<0.05）， along with a notable increase in vascu‐lar media thickness （P<0.05）. α-SMA immunofluorescence staining revealed evident muscularization of pulmonary arteri‐oles，indicating successful modeling.The K63 ubiquitination of STAT3 in PASMCs of pulmonary hypertensive rats was considerably higher than that in PASMCs from the CON group.After 28 days of MCT intervention，TARF6，p-STAT3/ STAT3， and cyclin D1 levels in rat lung tissue were significantly increased compared to the CON group （P<0.05）. PAAT and TAPSE significantly increased in the MCT+C25-140 group compared to the MCT group （P<0.05），and pulmonary vascular tunica media thickness significantly improved （P<0.05）.After C25-140 treatment，the levels of TARF6，p-STAT3/STAT3 ratio， and cyclin D1 in lung tissues significantly decreased compared to the MCT group （P<0.05）. Immu‐nofluorescence staining results showed significant co-localization of membrane TRAF6 and STAT3 in the small pulmonary arteries of rats in the MCT group， which was significantly inhibited by C25-140 treatment.CONCLUSION： Inhibition of TRAF6 E3 ubiquitin ligase activity led to decreased STAT3 phosphorylation and down-regulation of cyclin D1 in pulmo‐nary vessels， thereby retarding the thickening of pulmonary artery tunica media and improving pulmonary vascular remod‐eling in rats with pulmonary hypertension.
［KEY WORDS］pulmonary hypertension； tumor necrosis factor receptor-related factor 6； signal transducer and activator of transcription 3； cyclin D1； apoptosis； vascular remodeling
肺动脉高压（pulmonary hypertension， PH）是一类严重影响人类生活质量的心血管疾病，表现为肺血管重塑和肺血管后负荷进行性升高，严重时引起患者右心功能衰竭甚至死亡［1］。

肺动脉平滑肌细胞过度增殖和凋亡抵抗导致肺小动脉中膜增厚甚至闭塞是PH的主要病理机制之一［2-3］。

尽管目前临床上使用的血管扩张药物主要包括前列环素类似物和前列环素受体激动剂、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶-5抑制剂和可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂等药物在一定程度上对PH患者的症状有缓解作用［4］，但对于改善患者的远期生存率效果不佳，仍需要进一步探讨
PH的血管重塑机制，为靶向治疗提供新的策略。

肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor re‐ceptor-associated factor 6， TRAF6）是一种能够介导蛋白间相互作用的适配蛋白以及免疫调节受体家族的下游因子［5］，有研究报道发现其N端的RING结构域具有E3泛素连接酶的活性，能够介导其自身在内的多种蛋白质的多聚泛素化以及信号转导［6］。

信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）是一类细胞信号转录因子，有研究表明磷酸化的STAT3能促进肺动脉平滑肌细胞的增殖与凋亡抵抗，导致PH的发生［7］；研究发现在荷瘤小鼠模型中，来源于肿瘤组织的髓源性抑制
细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）中TRAF6的表达显著上调，且TRAF6能够与STAT3结合，介导STAT3的K63连接的多聚泛素化及STAT3的磷酸化激活来调节MDSCs的免疫抑制活性，促进肿瘤的发展［8］。

但在PH中TRAF6的E3泛素连接酶活性是否对STAT3的磷酸化激活至关重要目前还不清楚。

因此，本研究探讨了PH中TRAF6的泛素连接酶活性对STAT3激活和肺血管重构的影响。

材料和方法
1　实验动物与试剂
雄性SD大鼠42只，6~8周龄，质量为180~220 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司［实验动物许可证号：SYXK（苏）2021-0007］。

维持环境温度20~ 21 ℃，湿度50%~60%，动物采用普通饲料喂养，自由饮食。

本研究所有的动物相关操作均按照动物实验伦理的规定进行。

野百合碱（monocrotaline， MCT）为Sigma产品；C25-140（TRAF6特异性E3泛素连接酶活性抑制剂）购自MedChemExpress；抗TRAF6抗体（ab33915）为Abcam产品；抗STAT3抗体（4904T）及抗p-STAT3抗体（9145T）为Cell Signaling Technology 产品；抗细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体及抗β-ac‐tin抗体为Proteintech产品；抗K63 ubiquitin抗体为
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Cell Signaling Technology产品。

免疫共沉淀试剂盒（2179S）购自上海碧云天生物技术有限公司。

2　动物分组及处理
在饲养环境适应1周后，将42只SD大鼠随机分为4组：对照（control， CON）组，C25-140组，MCT组及MCT+C25-140组。

MCT组及MCT+C25-140组的大鼠均先在颈后皮下单次注射野百合碱，浓度为2%，剂量为60 mg/kg，建立PH模型。

C25-140组及MCT+C25-140组大鼠于造模后第14天、21天和28天腹腔注射剂量为9.8 mg/kg的C25-140化合物。

3　实验方法
3.1　超声心动图检测　大鼠吸入异氟烷麻醉，体动反应消失后仰卧固定于鼠板，固定呼吸面罩，以500 mL/min流量的异氟烷维持，去除胸前毛发，将耦合剂涂抹于超声探头，准备超声检测。

脉冲多普勒模式测量肺动脉血流加速时间（pulmonary arterial acceler‐ation time， PAAT），在心尖四腔切面使用M超测量三尖瓣环平面收缩期位移（tricuspid annular plane sys‐tolic excursion， TAPSE）。

3.2　肺组织取材　大鼠安乐死后，暴露出双肺和心脏，剪开左心耳，经左心室用肝素生理盐水对肺循环持续进行灌注，直至双肺颜色转白停止灌注。

取右肺部分置于−80 ℃保存，左肺用4%多聚甲醛固定24 h，用于之后的病理学染色。

3.3　大鼠原代肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arteri⁃al smooth muscle cells, PASMCs）分离培养　大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸泡于75%乙醇5 min，于无菌手术台上开胸取出肺组织，无菌PBS冲洗3次。

显微镜下分离出肺动脉，剔除血管周围肺组织、神经及筋膜等，分离干净的血管转移至新10 cm培养皿中。

纵行剪开肺血管，用镊子轻轻刮拭内层，去除内皮细胞层。

用眼科剪剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小块，接种到含1 mL DMEM培养基（含20%血清、100 U/mL双抗）的平皿中，轻摇培养基，使每块组织块间间距约为0.8~1.0 cm。

静置于37 ℃、5% CO2 培养箱中2 h，待组织贴牢后，缓慢添加DMEM培养基（含20%血清、100 U/mL双抗）完全覆盖组织块，继续培养至细胞从组织块周围爬出。

3.4　HE染色　将固定好的大鼠肺组织进行脱水、石蜡包埋，切成5 µm厚的切片，用苏木精和伊红进行染色，在400倍镜下观察各组管径20~150 µm的肺中小动脉形态，使用Image-Pro Plus 6.0测量肺小动脉中膜厚度（media thickness， MT）和血管外径（exter‐nal diameter， ED），计算肺小动脉中膜厚度百分比（中膜厚度百分比=2MT/ED×100%）。

3.5　Western blot　称取50~100 mg的新鲜肺组织，
用预冷的PBS清洗，去除多余水分后加入含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解液，剪碎组织后匀浆，冰上静置30 min，离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度。

使用相应浓度的SDS-PAGE进行蛋白分离、转膜、封闭，加Ⅰ抗（TRAF6和cyclin D1抗体，1∶5 000；STAT3和p-STAT3抗体，1∶2 000；β-actin抗体，1∶10 000），置于4 ℃摇床上孵育过夜。

TBST洗膜3次，加入相应的HRP标记的Ⅱ抗，室温下孵育1.5 h，TBST再次洗涤后进行曝光，留取图片，使用ImageJ分析条带的灰度值，以目的条带和内参条带的灰度值之比反应目的蛋白的表达水平。

3.6　免疫共沉淀　取CON组及PH组大鼠PASMCs 各一皿，弃培养基，PBS清洗后加入含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解液，用细胞刮将细胞刮下并转移至
1.5 mL离心管中，冰上裂解30 min，离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度。

取适量CON组和PH组细胞蛋白上清液，加入STAT3抗体工作液（稀释度1∶200）和IgG工作液，置于侧摆摇床，4 ℃孵育过夜。

采用免疫共沉淀法测定STAT3的K63泛素化水平。

将免疫沉淀后的上清使用相应浓度的SDS-PAGE进行分离、转膜、封闭，加Ⅰ抗K63 ubiquitin抗体（稀释度1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜。

TBST洗膜3次，加入相应的HRP标记的Ⅱ抗，室温下孵育1.5 h，TBST再次洗涤后进行曝光，留取图片。

3.7　免疫荧光染色　新鲜取材的肺组织用OCT进行包埋，切成7 µm的厚度。

用0.5% Triton X-100溶液进行通透，PBS洗涤3次。

5% BSA溶液室温封闭35 min。

甩去封闭液，加入适量TRAF6（稀释度1∶50）和STAT3（稀释度1∶1 000）的Ⅰ抗混合液，4 ℃过夜。

孵育相应的Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗后，加DAPI （含抗荧光淬灭剂）封片。

荧光显微镜下观察肺中小动脉中目标蛋白的定位和表达，拍照并存图。

4　统计学处理
采用GraphPad Prism 9软件进行分析处理，正态分布的计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，配对样本采用t检验，多个样本比较时采用单因素方差分析。

以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1　腹腔注射C25-140对PH大鼠肺血管重构的影响与CON组比较，MCT组大鼠PAAT和TAPSE明显缩短（P<0.05），中小肺动脉中膜明显增厚（P< 0.05），α-SMA荧光强度明显增强（P<0.05）；MCT+ C25-140组大鼠PAAT和TAPSE相对MCT组增加，肺中小动脉中膜增厚程度减小（P<0.05），α-SMA荧光强度降低（P<0.05），见图1和2。

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2　PH 大鼠PASMCs 中STAT3的K63泛素化情况
与CON 组PASMCs 比较，PH 大鼠PASMCs 中STAT3的K63泛素化水平明显升高，见图3。

3　腹腔注射C25-140对PH 大鼠肺组织TRAF6表
达、STAT3磷酸化及cyclin D1表达的影响
与CON 组比较，MCT 组大鼠肺组织TRAF6蛋白水平、p -STAT3/STAT3比值及cyclin D1蛋白水平明显升高（P <0.05），而MCT+C25-140组大鼠肺组织中TRAF6蛋白水平、p -STAT3/STAT3比值及cyclin D1蛋白水平相对于MCT 组有所降低（P <0.05），
见图4。

Figure1.　Comparison of PAAT ， TAPSE and related indexes of vascular remodeling in rats before and after modeling. Mean±SD. n =6. **P <0.01 vs CON group ； &&P <0.01 vs MCT group.
图1　造模前后大鼠PAAT 、TAPSE
及血管重构相关指标的比较
Figture 2.　HE staining and α-SMA immunofluorescence of small pulmonary vessels in rats （scale bar=50 µm ）. Mean±SD. n =6. *P <0.05 vs CON group ； &P <0.05 vs MCT group.
图2　大鼠肺组织HE 染色和α-SMA 免疫荧光结果
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4　腹腔注射C25-140对PH 大鼠肺组织TRAF6与STAT3共定位影响
与CON 组相比，MCT 组大鼠肺血管中膜TRAF6和STAT3存在共定位，经C25-140处理以后，两者的共定位明显减弱，见图5。

讨论
PH 是一种严重的心血管疾病，被称为心血管系
统中的癌症，其主要病理特征是肺动脉中膜平滑肌细胞的异常增殖，内膜和外膜的纤维化，原位血栓形
成、丛状病变以及周围血管炎症浸润，引起肺动脉持续性异常收缩，肺血管阻力和肺动脉压升高，最终导致右心衰竭甚至死亡［9］。

在本研究中，采用单次皮下注射野百合碱的方式构建大鼠PH 模型，造模后PH 大鼠PAAT 和TAPSE 明显缩短，中小肺动脉中膜厚度明显增加，α-SMA 荧光强度明显增加，提示造模成功。

TRAF6是一种具有E3泛素连接酶活性和免疫
调节双重作用的蛋白，已有研究表明TRAF6在结肠
癌、乳腺癌、
肺癌以及胰腺癌等多种恶性肿瘤中均存
Figure 3.　K63 ubiquitin level of STAT3 in pulmonary artery smooth muscle cells.图3　肺动脉平滑肌细胞中STAT3的K63
泛素化情况
Figure 4.　The protein expression of TRAF6， STAT3， p -STAT3 and cyclin D1 in each group. Mean±SD. n =6. *P <0.05， **P <0.01 vs CON group ； &P <0.05， &&P <0.01 vs MCT group.
图4　肺组织TRAF6、STAT3、p -STAT3及cyclin D1的表达
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在异常表达，并参与肿瘤细胞的增殖、转移及血管生成等过程［10-13］。

本研究发现MCT 诱导的PH 大鼠肺组织中TRAF6也存在明显升高，通过使用化合物C25-140抑制TRAF6的泛素连接酶活性后，TRAF6的蛋白水平有所下降，可能是由于TRAF6泛素连接酶活性受到抑制时，功能失活的TRAF6自身稳定性有所降低，继而被降解，但具体的降解机制还需要进一步的探究。

STAT3是一种细胞信号转录因子，参与正常细胞的分化、增殖和血管生成等多种生命活动［14］。

STAT3静息状态下通常以非活性状态定位于细胞的胞质当中，磷酸化是STAT3激活的重要步骤，STAT3一旦被激活即转移到细胞核当中，充当多种靶基因的转录激活剂［15-16］。

早在2012年，Wei 等［17］就通过免疫共沉淀实验证明在哺乳动物细胞中E3泛素连接酶TRAF6能够与STAT3结合，负调控TAK2-STAT3信号通路的激活，下调STAT3下游的靶基因CRP 和ACT 的表达；另外，Ruan 等［18］的研究证实了鼠沙门氏杆菌感染宿主细胞时可以特异性诱导
TRAF6发生泛素化，随后TRAF6在STAT3的SH2结构域介导K63连接的泛素化，促使STAT3被招募到细胞膜，发生磷酸化激活，以利于沙门氏杆菌在宿主
细胞内生长繁殖。

在本研究当中，在TRAF6的E3泛素连接酶活性受到抑制时，STAT3的磷酸化水平明显降低，且免疫荧光共定位的结果也显示抑制TRAF6的泛素连接酶活性时肺动脉上STAT3与TRAF6的共定位情况明显减弱。

由此可见，通过抑
制TRAF6的E3泛素连接酶活性，可能影响TRAF6与STAT3的相互结合，从而影响STAT3的磷酸化激
活过程。

cyclin D1是一种细胞周期调节蛋白，在有丝分
裂的G 1期向S 期转变的过程中发挥关键调节作用，是细胞增殖的关键靶点［19］。

多项研究表明cyclin D1是STAT3下游靶点，能够被 STAT3直接调控。

Deng 等［20］发现在肠上皮细胞中STAT3能够调节下游cy‐clin D1的表达，促进肠上皮细胞的增殖。

另外Zhou 等［21］发现血管平滑肌细胞当中STAT3也能够直接靶向下游的cyclin D1，促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移。

cyclin D1的过表达与PH 发病密切相关，Zhu 等［22］发现在PH 发病过程中，血小板衍生生长因子能
够诱导肺动脉平滑肌细胞中cyclin D1的过表达，引起PASMCs 增殖。

类似地，Xiao 等［23］发现在缺氧诱导的PH 大鼠肺动脉平滑肌细胞当中cyclin D1明显过表达。

在本研究中，当抑制TRAF6的泛素连接酶活性时，STAT3的磷酸化水平下降，下游的cyclin D1水平也随之改变，故PH 疾病当中TRAF6-STAT3-cyclin D1信号通路激活并调控肺动脉平滑肌细胞的增殖。

综上所述，TRAF6分子上调介导STAT3泛素化后磷酸化激活，磷酸化的STAT3随后激活下游cyclin
D1等细胞周期因子的转录，导致肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡抵抗，肺动脉中膜增厚，肺血管重构。

当抑制TRAF6的泛素连接酶活性时，STAT3的磷酸化水平降低，抑制STAT3与TRAF6相互作用，最终可降低大鼠肺动脉压力、增强右心的收缩力和缓解肺血管中膜增厚，故TRAF6作为一种E3泛素连接酶直接介导STAT3泛素化后磷酸化激活的机制可能在PH
的发病过程中发挥重要作用。

Figure 5.　Immunofluorescence of TRAF6 and STAT3 in lung tissue of rats in each group （scale bar=50 µm ）.图5　肺血管TRAF6与STAT3的共定位情况
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（责任编辑：余小慧，李淑媛）
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