激发光谱与荧光磷光光谱
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合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 <15nm的同步光谱只显示酪氨酸 特征光谱； >60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定。
2020/
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
2020/3/29
2020/3/29
3.激发光谱与发射光谱的关系
Relations between excitation and emission spectrum
a.Stokes位移
指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长
比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能量(如能级图 2
四.应用 Applications
1. 荧光分析法
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc
2020/3/29
（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
2020/3/29
磷光检测 Phosphorescence detection
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。
室温测量时，不需要 杜瓦瓶。
2020/3/29
Fluorescence or phosphorescence spectrum
固定激发光波长(选 最大激发波长), 化合物 发射的荧光(或磷光强度) 与发射光波长关系曲线( 图中曲线II或III)。
2020/3/29
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
1.分子产生荧光必须具备的条件 Conditions （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2020/3/29
2.化合物的结构与荧光 Structure
2020/3/29
（2）火焰中的化学发光反应
在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮
NO + H → HNO* HNO * → HNO + h 发射光谱范围：660～770nm； 最大发射波长：690nm； 在富氢火焰中： NO2 + 2H → NO + H2O 该反应十分迅速；
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
3. 溶液pH Acidity
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
2020/3/29
内因：Internal 1.内滤光作用和自吸现象
Inner filtration and self-absorption
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光，如色胺酸中的重铬酸钾；
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；
2020/3/29
氧原子与NO的发光反应：
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） NO + O → NO2* NO2 * → NO2 + h 发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；
12.3.3 化学发光分析法
Chemiluminescence analysis
2020/3/29
12.3.1 分子荧光与磷光
Molecular fluorescence and phosphorescence 一、激发光谱与荧光(磷光)光谱
Excitation spectrum and fluorescence spectrum
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 振动能级2之间 的跃迁几率最 大，相反跃迁 也然。
2020/3/29
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
2020/3/29
三、荧光的产生与分子结构的关系 Relation between fluorescence and molecular structure
A
t 0
I cl t dt
cl
t 0
dc dt
dt
cl
c
2020/3/29
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应
a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振
动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如
‘ 2
)。
c. 镜像规则 Mirror image role
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
2020/3/29
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
2020/3/29
2.化学发光效率 Luminous efficiency
发射光子的分子数
cl 参加反应的分子数 ce em
化学效率：
激发态分子数
ce 参加反应分子数
发光效率：
产生光子数
em 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
Icl
t
cl
dc dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
2020/3/29
2020/3/29
四、影响荧光强度的因素 Influencing factors on fluorescence
影响荧光强度的外部因素 External
1.溶剂的影响 Solvent
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响 Temperature
氧原子与CO的发光反应：
CO + O → CO2* CO2 * → CO2 + h 发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；
2020/3/29
c. 乙烯与O3的发光反应
乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：
CH2O* → CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应 范围1 ng/cm-3 ～1g/cm-3；
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
(2)生物与有机化合物的分析 见表
2020/3/29
2020/3/29
2020/3/29
2.磷光分析法
(1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析
烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3
2020/3/29
仪 器 光 路 图
2020/3/29
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
2020/3/29
同步扫描技术 Synchronous scanning
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种；
同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。
2020/3/29
3.化学发光强度与化学发光分析的依据
在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多， 对于一级动力学反应：
dc/dt =Kc；
K 为反应速率常数。
定性依据：
（1）在一定条件下，峰值光 强度与被测物浓度成线性；
（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被 测物浓度成线性：
(3).药物分析和临床分析
见表
2020/3/29
2020/3/29
2020/3/29
12.3.3 化学发光分析法 Chemiluminescence 一、基本原理 principle 1. 化学发光反应
在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从 激发态返回基态时，发射出一定波长的光。
A +B = C + D* D* → D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170～300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中， 称生物发光(bioluminescence)。
二、定量荧光分析 Quantitative analysis
1. 特点 Features
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
一、仪器结构流程 Instrumentation
荧光仪主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单 色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
2020/3/29
2.溶液荧光的猝灭 Fluorescence quenching
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
2020/3/29
12.3.2 荧光与磷光分析法 Fluorescence and phosphorescence analysis
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
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2.定量依据与方法 Principle
(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
12.3 分子发光分析法 Molecular luminescence analysis
12.3.1 分子荧光与磷光
Molecular fluorescence and phosphorescence
12.3.2 荧光与磷光分析法
Fluorescence and phosphorescence analysis
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线Excitation spectrum
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
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2.荧光光谱(或磷光光谱)
2020/3/29
b.硫化物
挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富 氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：
SO2 + 2H2 → S + 2H2O S + S → 2S2 * S2 * → S2 + h 发射光谱范围：350～460nm； 最大发射波长：394nm； 灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。
2020/3/29
（3）液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、，F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、；Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
2020/
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
2020/3/29
2020/3/29
3.激发光谱与发射光谱的关系
Relations between excitation and emission spectrum
a.Stokes位移
指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长
比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能量(如能级图 2
四.应用 Applications
1. 荧光分析法
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc
2020/3/29
（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
2020/3/29
磷光检测 Phosphorescence detection
荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。
测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。
室温测量时，不需要 杜瓦瓶。
2020/3/29
Fluorescence or phosphorescence spectrum
固定激发光波长(选 最大激发波长), 化合物 发射的荧光(或磷光强度) 与发射光波长关系曲线( 图中曲线II或III)。
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荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
1.分子产生荧光必须具备的条件 Conditions （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2020/3/29
2.化合物的结构与荧光 Structure
2020/3/29
（2）火焰中的化学发光反应
在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮
NO + H → HNO* HNO * → HNO + h 发射光谱范围：660～770nm； 最大发射波长：690nm； 在富氢火焰中： NO2 + 2H → NO + H2O 该反应十分迅速；
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
3. 溶液pH Acidity
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
2020/3/29
内因：Internal 1.内滤光作用和自吸现象
Inner filtration and self-absorption
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光，如色胺酸中的重铬酸钾；
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；
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氧原子与NO的发光反应：
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） NO + O → NO2* NO2 * → NO2 + h 发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；
12.3.3 化学发光分析法
Chemiluminescence analysis
2020/3/29
12.3.1 分子荧光与磷光
Molecular fluorescence and phosphorescence 一、激发光谱与荧光(磷光)光谱
Excitation spectrum and fluorescence spectrum
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 振动能级2之间 的跃迁几率最 大，相反跃迁 也然。
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荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
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三、荧光的产生与分子结构的关系 Relation between fluorescence and molecular structure
A
t 0
I cl t dt
cl
t 0
dc dt
dt
cl
c
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4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应
a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应
, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振
动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如
‘ 2
)。
c. 镜像规则 Mirror image role
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
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镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
2020/3/29
2.化学发光效率 Luminous efficiency
发射光子的分子数
cl 参加反应的分子数 ce em
化学效率：
激发态分子数
ce 参加反应分子数
发光效率：
产生光子数
em 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
Icl
t
cl
dc dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
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四、影响荧光强度的因素 Influencing factors on fluorescence
影响荧光强度的外部因素 External
1.溶剂的影响 Solvent
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响 Temperature
氧原子与CO的发光反应：
CO + O → CO2* CO2 * → CO2 + h 发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；
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c. 乙烯与O3的发光反应
乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：
CH2O* → CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应 范围1 ng/cm-3 ～1g/cm-3；
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
(2)生物与有机化合物的分析 见表
2020/3/29
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2.磷光分析法
(1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析
烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3
2020/3/29
仪 器 光 路 图
2020/3/29
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
2020/3/29
同步扫描技术 Synchronous scanning
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种；
同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。
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3.化学发光强度与化学发光分析的依据
在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多， 对于一级动力学反应：
dc/dt =Kc；
K 为反应速率常数。
定性依据：
（1）在一定条件下，峰值光 强度与被测物浓度成线性；
（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被 测物浓度成线性：
(3).药物分析和临床分析
见表
2020/3/29
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12.3.3 化学发光分析法 Chemiluminescence 一、基本原理 principle 1. 化学发光反应
在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从 激发态返回基态时，发射出一定波长的光。
A +B = C + D* D* → D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170～300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中， 称生物发光(bioluminescence)。
二、定量荧光分析 Quantitative analysis
1. 特点 Features
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
一、仪器结构流程 Instrumentation
荧光仪主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单 色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
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2.溶液荧光的猝灭 Fluorescence quenching
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
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12.3.2 荧光与磷光分析法 Fluorescence and phosphorescence analysis
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
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2.定量依据与方法 Principle
(1)定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
12.3 分子发光分析法 Molecular luminescence analysis
12.3.1 分子荧光与磷光
Molecular fluorescence and phosphorescence
12.3.2 荧光与磷光分析法
Fluorescence and phosphorescence analysis
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线Excitation spectrum
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
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2.荧光光谱(或磷光光谱)
2020/3/29
b.硫化物
挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富 氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：
SO2 + 2H2 → S + 2H2O S + S → 2S2 * S2 * → S2 + h 发射光谱范围：350～460nm； 最大发射波长：394nm； 灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。
2020/3/29
（3）液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、，F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、；Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：