打破传统酶切克隆的新方法：基于IIS型限制性内切酶克隆

打破传统酶切克隆的新方法：基于IIS型限制性内切酶克隆
1什么是IIS型限制性内切酶？
限制性内切酶根据酶切方式的不同分为4种不同的类型（Type I、Type II、Type III、Type IV）。

我们最常使用的限制性内切酶（如EcoRI）属于Type II，此类限制性内切酶识别特异性的4-8 个核苷酸序列，识别序列反向重复，且切割位点位于识别位点内，酶切后生成粘性末端或者平末端。

图1：Type II和Type IIS限制性内切酶识别序列和切割位点的比较
相对来说，Type IIS限制性内切酶是一组比较特殊的内切酶，其在识别位点下游特定位置处切割DNA（图1）。

这是由于此类限制性内切酶的序列识别区域和催化区域被一个多肽连接子分开（图2）。

图2. Type IIS限制性内切酶的计算机生成结构
Type IIS内切酶对切割位点的序列没有要求，也就是说，识别序列外的位置可以是任意核苷酸的组合。

酶切末端序列具有256种可能，多个片段DNA可通过互补末端进行组装，这种克隆技术通常被称为Golden Gate assembly。

2如何使用IIS型限制性内切酶进行分子克隆
Type IIS限制性内切酶的偏移剪切的一个特点是酶切后一个片段上仍保留完整的识别序列，而另一个片段则失去了识别序列。

第二个特点是酶切位点与识别位点间的距离是酶依赖的，一旦酶与其识别位点结合，将剪切适当距离的任意DNA序列。

该酶切机制的结果是特定的IIS型内切酶剪切的两个不同DNA片段所形成的突出末端不配对——除非两个片段是经过特异设计的。

所以，基于以上原理，通过前期设计（选择或构建IIS兼容克隆载体，通过基因合成或PCR引物设计获取克隆片段），克隆流程可以大大简化。

此外还可以实现同时以特定的顺序组装多个插入片段至单个克隆载体中。

克隆的DNA片段可以是PCR产物、TOPO克隆的PCR片段及基因合成的片段。

片段末端的IIS型内切酶识别位点需要定向，以便能切出匹配的末端，同时去除酶识别位点。

载体也需同样的设计，以便产生的末端能和片段末端互补（图3）。

图3. 使用IIS型内切酶进行单片段克隆
图4. 使用IIS型内切酶进行多片段克隆
3如何设计DNA组装片段
有多种方法可用于获取IIS型内切酶克隆的片段，这里主要列举两种常用的方法：
1. 通过PCR扩增（图5）
（1）引物设计——引物需包含IIS型内切酶识别位点和4个独特的核苷酸；
（2）PCR扩增——使用含IIS内切酶识别位点的引物对目的片段进行扩增；
（3）酶切和连接——具有互补末端的PCR片段按照自定的顺序进行组装和连接；
（4）完成组装——片段和最终的目的载体进行连接；
图5. 通过PCR获取IIS型内切酶克隆所需片段
2. 通过寡核苷酸合成（图6）
（1）按照设计合成相应的寡核苷酸；
（2）将每个合成的寡核苷酸5’末端磷酸化
（3）将合成的寡核苷酸退火形成双链；
（4）通过连接入最终目的载体完成组装；
图6. 通过寡核苷酸合成获取IIS型内切酶克隆所需片段
4使用IIS型内切酶克隆与传统酶切克隆的区别
传统的分子克隆流程包含多个流程（图7），包括载体的酶切、磷酸化、纯化，目的片段的酶切、纯化等多个步骤。

相比之下，利用IIS 型内切酶的克隆方法可实现在单一反应管中完成单个或多个片段的插入。

通常反应在热循环仪中进行，反应温度在酶切最佳温度（37 ℃）和连接最佳温度（23℃）间反复循环。

此种克隆方法减少了繁复的动手操作，且不需要进行凝胶纯化。

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图7. 传统克隆与Golden Gate克隆流程的对比
IIS型内切酶克隆的优势：
（1）同一反应管中进行克隆——由于连接产物中酶切位点消失，所以酶切和连接可同时在同一反应管中进行
（2）无痕克隆——不会引入多余序列
（3）同时组装多个片段——使用正确的互补末端组合可同时组装多个片段
5可提供的Invitrogen Anza Type IIS限制性内切酶
赛默飞世尔科技最新上市的Invitrogen Anza系列限制性内切酶均使用统一缓冲液，可实现15min-16h的灵活酶切，完全杜绝星号活性，红色缓冲液可实现酶切后直接电泳，带来高性能的、简便的DNA 酶切体验。

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