动物胚胎干细胞技术
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
哺乳动物胚胎干细胞的分离和培养
哺乳动物胚胎干细胞的分离和培养随着科技的发展，胚胎干细胞已经成为了诸多领域中相当受重视和关注的一种细胞，其独特的生物学特性在组织再生、细胞治疗、疾病研究等方面得到了广泛的应用。
而胚胎干细胞的获取途径，主要有胚胎干细胞的分离和培养，后来又发展了生殖细胞干细胞和诱导多能干细胞等变体。
其中，胚胎干细胞的分离和培养是获取胚胎干细胞的最主要方式之一。
实现胚胎干细胞的分离和培养，需要克服很多技术难题，因此需要结合内分泌学、遗传学、细胞学等许多知识和方法。
一、哺乳动物胚胎干细胞的来源和种类体内的胚胎其实是非常珍贵的资源，而哺乳动物胚胎是分离并培养胚胎干细胞的最主要来源之一。
而胚胎干细胞又分为内胚层干细胞和外胚层干细胞两种。
内胚层干细胞发源于极早期的胚胎，负责形成所有的胚胎层组织和器官。
而外胚层干细胞则起源于滋养层，是胚胎和胎儿的外层，主要分化为胎盘和涵盖胚胎的腔囊。
二、胚胎的提取和悬浮培养胚胎干细胞的提取是分离和培养胚胎干细胞的最基本步骤。
其实胚胎的提取有很多种方法，如体外受精、腹腔注射、放置细胞培养皿等。
其中，放置细胞培养皿的方法成本较低且技术难度较低，成为了主要的选项之一。
在胚胎提取之后，需要进行悬浮培养。
悬浮培养的目的是维持胚胎在一定的温度和湿度下进行生长和发育，同时也为胚胎干细胞的分离、培养提供了条件。
悬浮培养要注意的是，其浓度和成分的选择应当因胚胎发育的不同阶段而有所不同。
三、哺乳动物胚胎干细胞的分离哺乳动物胚胎干细胞的分离是胚胎干细胞的获取的最关键的步骤之一，也是技术难度最大的步骤。
目前主要有三种方法来从胚胎中分离胚胎干细胞，即机械分离法、酶消化分离法和选择性黏附法。
相比于其他两种方法，机械分离法是分离胚胎干细胞的常用方法。
首先，需要用小胚胎钳和针管将胚胎的外壳和滋养层取出，释放出内部的细胞块。
然后用切割或挤压的方式分离胚胎内部的细胞并编集成单个细胞，萃取出胚胎干细胞。
四、哺乳动物胚胎干细胞的培养哺乳动物胚胎干细胞的培养在细胞注重环境及其能力与组合方面具有极高的要求。
干细胞生产工艺流程
干细胞生产工艺流程一、干细胞的来源干细胞是一种具有自我更新和分化能力的特殊细胞，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两种来源。
胚胎干细胞来自于早期胚胎发育阶段的内细胞团，具有较强的分化潜能；而成体干细胞则存在于成年人的各种组织和器官中，分化潜能相对较低。
二、胚胎干细胞的生产工艺流程1. 胚胎培养胚胎干细胞的生产首先需要进行胚胎的培养。
在体外受精后，受精卵会经历一系列的细胞分裂和发育，形成胚胎。
这些胚胎会被置于培养皿中，经过适当的培养条件，如温度、湿度和营养物质的供给，以促进胚胎的正常发育。
2. 胚胎分离在胚胎发育到适当的阶段时，需要将其分离出来以获得内细胞团。
这一步骤通常通过微操作技术来完成，确保对胚胎的损伤最小化。
3. 内细胞团的培养分离得到的内细胞团会被置于含有适当培养基的培养皿中进行培养。
培养基中含有的营养物质和生长因子可以提供细胞生长和分化所需的条件。
4. 干细胞的提取与培养在内细胞团的培养过程中，会产生一些干细胞样的细胞群。
这些细胞群可以通过特定的细胞表面标记物进行筛选和提取。
提取到的干细胞样细胞会被进一步培养和扩增，以获得足够数量的干细胞。
5. 干细胞的分化提取到的干细胞可以通过特定的培养条件和生长因子的调控，实现向特定细胞类型的分化。
这一步骤是干细胞研究和应用的关键环节，通过合适的培养条件和外界刺激，干细胞可以分化为心脏细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞类型。
三、成体干细胞的生产工艺流程1. 干细胞的筛选和提取成体干细胞的生产过程通常从人体或动物的组织和器官中筛选和提取干细胞。
这一步骤需要进行组织样本的采集和处理，以获得含有丰富干细胞的细胞群。
2. 干细胞的分离和纯化提取到的组织样本中含有多种细胞类型，需要进行干细胞的分离和纯化。
常用的方法包括负选择和正选择，通过对细胞进行某些表面标记物的筛选，将干细胞与其他细胞类型进行分离。
3. 干细胞的培养和扩增分离和纯化得到的干细胞会被置于含有适当培养基的培养皿中进行培养和扩增。
动物细胞工程—干细胞技术
• 全能性或多能性 • 种系传递性 • 体外遗传可操作性 • 无限扩增(自我更新)
干细胞技术
面临问题
扩增变 异
来源问题
（宗教、法律及文 化背景）
技术普 及
干细胞技术
成体干细胞
成体干细胞是指存在于一种已经 分化组织中的未分化细胞，这种细胞 能够自我更新并且能够特化形成组成 该类型组织的细胞。
动物生物技术
干细胞技术
第一章
干细胞技术
干细胞技术
干细胞定义及分类
干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞,能够产生至 少一种类型的、高度分化的子代细胞。
胚胎
干细胞
按来
分
源分 类
成体
干细胞
全能 干细胞
按分化 潜能分
多能 干细胞
单能 干细胞
干细胞技术
胚胎干细胞（ES细胞）
胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs， 简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期 之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞。
诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs或iPS) 技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性 干细胞。
优点分析
分离和培 养宿主细
胞
基因导入 宿主细胞
细胞种植 及重编程
出现及鉴 定ES样
克隆
• 没有伦理学的问题 • 不会有免疫排斥的
➢生物学特性 •多能ห้องสมุดไป่ตู้ •迁移性 •可调控性 •广泛性
优点分析
• 相对容易获取 • 不存在组织相容性 • 致瘤风险很低，伦理学争议
较少 • 多向分化潜能
小鼠胚胎干细胞的鉴定
小鼠胚胎干细胞的鉴定小鼠ES细胞的鉴定主要围绕ES细胞的形态、核型、分化潜能和特异性染色等方面进行。
一、形态学观察小鼠ES细胞的形态特点为圆形或扁圆形，表面平滑，体积较小，核质比大，有一个或多个凸起的核仁结构。
经培养后紧密聚集，细胞之间界限不清，形成岛状，巢状群体生长状态，集落边缘整齐，与滋养层细胞界限分明且色泽深亮，克隆的边缘可以看到比较清晰的单个细胞。
多次传代消化或改变培养基的成分，如降低血清浓度、去除LIF或碱性FGF等某些生长因子时，悬浮培养形成的细胞团开始出现松散，球形的边缘可以清楚地看到圆而大的细胞，细胞团开始自分化。
二、核型分析正常的二倍体核型特征是ES细胞全能性的基础，因此需要对所建立的ES细胞系的核型进行鉴定分析。
【实验材料】1.材料载玻片、镊子、离心管、移液管、吸管、35mm 培养皿（Corning，430165）。
2.试剂Demecolcine（Sigma，D6165）、Giemsa（Sigma，G4507）、NaH2 PO4（Sigma，S6566）、Na2HPO4（Sigma，S5136）、甲醇、冰醋酸。
配制类试剂：①磷酸缓冲液：0.2mol/L NaH2PO4+0.2mol/L Na2 HPO4；②Giemsa染液：8ml磷酸缓冲液+2ml Giemsa贮存液，吹吸混匀；③固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1（现用现配）。
【实验步骤】1.将需要做核型分析的ES传代，通常用一个35mm皿的细胞做核型，在传代后25～40小时向培养皿中加入0.2µg/ml democolcin，继续培养1～2小时。
2.取出培养皿，用标准传代的消化方法将其消化成单细胞悬液，1200r/min离心10分钟，弃上清，注意：上清要吸得彻底些。
3.加入事先预热至37℃的0.56%KCl低渗液4ml，用滴管吹打成单细胞悬液（较剧烈），37℃低渗处理15～20分钟。
4.配10ml固定液，4℃冰箱预冷。
转基因动物的技术方法
转基因动物的技术方法根据外源基因导入的方法和对象的不同，转基因动物的技术方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）法、电脉冲法、精子载体导入法等。
1、显微注射是最常用且成功率较高的方法。
基因显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达lOOkb（10万个碱基对）。
它可直接获得纯系，所以实验周期短。
但需要贵重精密仪器，技术操作难度大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。
2、反转录病毒感染法该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。
由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。
此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。
3、胚胎干细胞法胚胎干细胞（ES细胞）指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育全能性，能进行体外培养；扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。
本法外源基因整合率高，植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞，克服了以前只能在子代选择的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是很有前途的技术。
缺点是不易建立ES细胞系。
并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。
4、电脉冲法电脉冲法（electroporation）又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。
5、精子导入法利用精子作为外源基因载体，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中，称之为精子载体导入法，是构建转基因动物的一种新尝试。
该法简单、方便，依靠生理受带过程，免去了对原核的损伤。
但在实践中成功率较低，对于精子是否可作为外源DNA 载体也存在争论。
胚胎干细胞应用
胚胎干细胞应用
如下是有关胚胎干细胞的应用：
1.生产克隆动物
胚胎干细胞从理论上讲可以无限传代和增殖而不失去其正常的二倍体基因型和表现型，以其作为核供体进行核移植后，在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体，胚胎干细胞与胚胎进行嵌合克隆动物，可解决哺乳动物远缘杂交的困难问题，生产珍贵的动物新种。
亦可使用该项技术进行异种动物克隆，对于保护珍稀野生动物有着重要意义。
2.转基因动物
用胚胎干细胞生产转基因动物，可打破物种的界限，突破亲缘关系的限制，加快动物群体遗传变异程度，可以进行定向变异和育种。
利用同源重组技术对胚胎干细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种;利用胚胎干细胞技术，可在细胞水平上对胚胎进行早期选择，这样可以提高选样的准确性，缩短育种时间。
3.器官组织移植
作为一种被称之为"种子细胞"的胚胎干细胞，为临床的组织器官移植提供大量材料。
人胚胎干细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。
这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。
4.用于细胞治疗
细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。
胚胎干细胞经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。
以胚胎干细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意的转基因胚胎干细胞系，为克服目前基因治疗中导入基因的整合和表达难以控制，以及用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代开辟了新的途径。
第十二章动物干细胞技术简介
胚胎干细胞，又称全能干细胞，存在于未发育成熟的胚胎 ，高水平表达端粒酶，可分化为除构成脐胎盘，脐带等之 外的任何一种特定类型细胞。即能长成动物的任何组织和 器官。
(1)全能性干细胞它具有形成完整个体的分化潜能。如胚 胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的 分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类 型，进一步形成机体的所有组织、器官。
➢ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从
延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当 时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。
第一节 干细胞简介
干细胞的定义 自我更新和分化潜能的细胞,在细胞发育过程中处于较原 始阶段.
干细胞的分类 干细胞有两方面区别于其它细胞的特征： 1，可分化为与自身完全相同的细胞，
2，可生产出特异性分化的细胞。
根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为 两类：胚胎干细胞及成体干细胞。
1.带间充质干细胞：大量存在于脐带组织中，具有胚胎干细 胞类似的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富、取材方便、 无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，疗效显著 ，可以扩增和传代，同时又没有配型、排斥等问题，不但能 够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，也是最具临床应用 前景的多能干细胞。
2.骨髓间充质干细胞：人体骨髓干细胞细胞数量及增殖分化 潜能随年龄的增大而下降，从自体骨髓提取间充质干细胞， 虽然技术门槛比较低，但需要抽取病人大量骨髓（往往难以 做到），其干细胞数量也难以稳定满足临床治疗的要求。因 此骨髓间充质干细胞有一定的局限。
3.脐带血干细胞：脐带血除了包含正常血液的红细胞、白细胞，淋巴 细胞外，还包含单个核细胞、造血干细胞。目前最具应用价值的是利 用脐血中的造血干细胞治疗白血病（骨髓移植）。利用脐带血所含的 单个核细胞和造血干细胞治疗血液病以外的疾病，由于所含干细胞数 量稀少（仅占脐血细胞的0.98%），虽然有一定的治疗效果，但不能 等同于真正意义上的间充质干细胞治疗，可作为间充质干细胞治疗的 补充。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。
干细胞的提取技术及注意事项
干细胞的提取技术及注意事项干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞。
它们具有极大的应用潜力，可用于再生医学、组织工程以及疾病治疗等领域。
为了充分利用干细胞的潜能，科学家们一直致力于研究和开发干细胞的提取技术。
本文将介绍干细胞的提取技术以及在操作过程中需要注意的事项。
一、胚胎干细胞提取技术胚胎干细胞是从早期胚胎中提取的多能性细胞，可以分化为其他各种细胞类型。
胚胎干细胞提取技术主要分为以下几种：1. 胚胎移植：该方法通常涉及将胚胎内细胞块移植到营养培养基中培养，细胞块中的干细胞会继续生长和分化。
这种方法比较简单，但提取效率较低。
2. 基因编辑：通过基因编辑技术，科学家可以针对特定的基因进行操作，使胚胎中的细胞表达特定的基因，从而产生干细胞。
这种方法提取效率较高，但需要对基因进行精确编辑。
3. 克隆技术：克隆技术是指将细胞核从一个成体细胞中提取出来，并将其注入到一个无细胞核的胚胎细胞中。
经过培养和发育，可以得到含有干细胞的胚胎。
这种方法提取效率较低且存在伦理争议。
二、成体干细胞提取技术成体干细胞是存在于成熟组织或器官中的细胞，它们可以自我更新并分化为特定的细胞类型。
成体干细胞提取技术主要有以下几种：1. 骨髓移植：骨髓中含有大量造血干细胞，这些干细胞可以分化成不同的血细胞。
通过骨髓移植，可以提取到大量的成体干细胞。
但这种方法涉及到手术操作和损伤，对供体有一定的风险。
2. 脐带血提取：婴儿出生后，脐带中含有大量的造血干细胞，可以进行提取和保存。
这种方法相对简单，无需手术操作，对供体无损伤。
3. 脂肪组织提取：脂肪组织中含有丰富的成体干细胞。
科学家可以通过脂肪吸取手术来获取脂肪组织，并提取其中的干细胞。
这种方法安全可靠，提取效率较高。
三、提取干细胞的注意事项在进行干细胞提取的过程中，需要注意以下事项：1. 伦理规范：提取干细胞涉及到胚胎或组织的损伤，因此需要遵守伦理规范。
研究人员应当确保使用符合伦理规范的方法进行提取，并在动物实验中进行充分的伦理审查。
动物胚胎工程技术的研究进展及展望
动物胚胎工程技术的研究进展及展望摘要：动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，在育种中可使优良的种质特性和遗传潜力得到充分的发挥，是家畜繁殖领域的一次技术革命。
本文综述了动物胚胎工程包含的技术及研究进展，并对胚胎工程技术发展前景进行了展望。
关键词：胚胎工程；技术；研究进展动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割与胚胎嵌合、胚胎性别控制、胚胎干细胞、动物克隆等技术[1]。
这些技术的出现不仅大大扩展胚胎移植的研究领域，而且促进畜牧业、医药卫生行业发展，具有重大理论意义。
1 胚胎移植技术哺乳动物的胚胎移植始于1890年，当时英国剑桥大学Heape首次获得兔受精卵移植的成功。
Heape的成功，第一次证实了受精卵在寄主体内发育的可能性，从而奠定胚胎移植的生理学基础和原则。
2 排卵控制排卵控制分为排卵时间控制和排卵数量的控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG等[3]。
3 胚胎冷冻保存胚胎冷冻是对胚胎采取一定保护措施和降温程序，使之在-196℃条件下细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被抑制从而处于一种“停滞”状态，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能够得到长期保存的一种生物技术[4]。
玻璃化冷冻技术作为一种新发展起来的生物技术，具有许多潜在的应用价值。
而应用此项技术进行卵母细胞冷冻保存，可将优良品种动物废弃卵巢中的大量卵母细胞保存起来，向建立“精子库”和“胚胎库”那样建立“卵子库”，为体外受精、核移植、转基因等各种胚胎生物技术的开展提供充足的材料，并解除了时间和空间上的限制；而且可以为珍稀动物、濒危动物的遗传资源的保存提供可能。
5 胚胎分割和嵌合5.1 胚胎分割胚胎分割是采用显微手术的方法，将早期胚胎一分为二，一分为四或更多次的分割，再（或经过体外培养后）移回受体妊娠产仔，是动物克隆的一种[8]。
胚胎干细胞的研究及其应用
动物繁殖技术学课程论文胚胎干细胞的研究及其应用姓名学号系名专业班级指导老师2017年1月1日胚胎干细胞的研究及其应用摘要：胚胎干细胞 (ES 细胞)是一类从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离和克隆出的、具有发育全能性和多能性的细胞。
ES 细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学、遗传学以及制作动物疾病模型等的研究应用中起着重要的作用。
本文介绍了胚胎干细胞的生物学特性, 国内外研究进展和研究动态, 阐明了建立 ES 细胞系的技术要点以及 ES 细胞的应用及发展前景。
关键词：:动物;胚胎干细胞;发育；研究进展目录1.ES 细胞的研究概况 (3)2.ES 细胞的形态学及其基本特征 (4)2.1 ES细胞的形态学特征 (4)2.2 ES 细胞的基本特征 (4)3. ES 细胞系的建立概况及建系的技术要点 (5)3.1 ES 细胞系的建立概况 (5)3.2 ES 细胞建系的技术要点 (5)4.ES细胞的应用与前景 (5)4.1 ES细胞与动物克隆 (5)4.2基因载体 (5)4.3加快组织工程发展 (6)4.4其他 (6)5.存在的问题 (7)6.参考文献 (8)胚胎干细胞 (Embryonic stem cells, Es细胞)是一种从早期胚胎内细胞团(Inner cellmass, ICM)或原始生殖细胞 (primor-dial germ cells, PGCs)经体外分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的细胞。
目前, ES 细胞已经引起广大学者的注意和兴趣, 对 ES细胞的研究也取得了很大进展。
该细胞除细胞和细胞集落有一定形态和生长行为外 ,经细胞表面抗原检测、体内体外分化实验为阳性 ,核型正常并可产生嵌合动物个体。
目前 ,除小鼠 ES细胞分离克隆成功称ES细胞系以外 ,其它动物 ES细胞研究虽然获得很大进展 ,但只称作类 ES细胞系或 ES样细胞。
主要原因是未能证明 ,经嵌合体实验发生生殖腺嵌合的嵌合体。
动物胚胎工程与生物技术
动物胚胎工程与生物技术动物胚胎工程是生物技术的一个重要分支，主要涉及胚胎采集、人工受精、胚胎移植、胚胎体外培养、性别鉴定与胚胎选择、基因编辑与转基因动物、克隆技术与核移植以及干细胞与再生医学等方面。
1.胚胎采集与人工受精胚胎采集是指从母体中收集胚胎的过程，通常在母体自然发情后的一段时间内进行。
人工受精则是通过人工方式将精子引入母体子宫，使其与卵子结合受精。
这些技术的运用，使得优良性状的基因得以传递和利用。
2.胚胎移植胚胎移植是指将早期胚胎从一个母体移植到另一个母体子宫内，使其继续发育的技术。
这种技术可以用于扩大优良性状的基因，增加优良品种的数量。
3.胚胎体外培养胚胎体外培养是指将早期胚胎在人工模拟的体内环境中继续发育的技术。
这种技术可以用于研究胚胎发育过程中的规律和影响因素，为胚胎移植成功率提供更好的保障。
4.性别鉴定与胚胎选择性别鉴定是指对胚胎进行基因检测，确定其性别的技术。
这种技术可以用于实现性别比例的控制，以满足某些特定需求。
同时，根据性别的不同，人们可以选择性地淘汰某些不良的胚胎，提高整体品质。
基因编辑和转基因动物技术是近年来发展迅速的前沿技术，它们为人类提供了改变和优化生物遗传信息的能力。
基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，可以精确地编辑生物基因组，消除有害基因或引入有益的基因变异。
转基因动物技术则是将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞中，产生含有该基因的新的遗传物质的动物。
这些技术的应用为疾病治疗、药物研发、农业生产和生物科学研究等领域带来了巨大的潜力。
6.克隆技术与核移植克隆技术是一种无性繁殖的技术，通过将一个细胞的核移植到另一个去核的细胞中，产生出一个基因型完全相同的后代。
这种技术可以用于拯救濒危物种、生产克隆动物以及为人类提供治疗性克隆组织等。
核移植则是将一个早期胚胎细胞核移植到一个去核的卵母细胞中，使其重新编程并发育成一个新的胚胎的技术。
这种技术可以用于生产转基因动物和人类疾病模型的建模等。
《2024年阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞培养技术的研究》范文
《阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞培养技术的研究》篇一一、引言近年来，随着生物科技的快速发展，干细胞培养技术逐渐成为生物学领域的研究热点。
特别是对于畜牧业而言，胚胎干细胞培养技术为动物育种、疾病防治等方面提供了新的可能。
阿尔巴斯白绒山羊与绵羊作为重要的经济动物，其胚胎干细胞培养技术的研究具有重要的实践意义。
本文将就阿尔巴斯白绒山羊与绵羊的胚胎干细胞培养技术进行深入研究，以期为相关研究与应用提供理论支持。
二、阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞的培养1. 材料与方法（1）实验材料：选择健康的阿尔巴斯白绒山羊与绵羊的早期胚胎，实验室条件下的细胞培养基、生长因子等。
（2）方法：采用无菌操作技术，将早期胚胎置于特定的培养基中，通过添加生长因子等物质，促进胚胎干细胞的增殖与分化。
2. 培养过程胚胎干细胞的培养过程需要严格控制温度、湿度、pH值等环境因素，以保证细胞的正常生长与分化。
同时，还需要定期更换培养基，添加必要的生长因子等物质，以满足细胞生长的需求。
3. 培养结果通过胚胎干细胞培养技术，可以获得大量具有高度增殖能力和多向分化潜力的干细胞。
这些干细胞可用于进一步的研究与应用，如动物育种、疾病防治等。
三、阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞的应用1. 动物育种：通过胚胎干细胞的培养与分化，可以获得具有优良性状的新个体，从而加速动物的育种进程。
2. 疾病防治：胚胎干细胞可用于研究动物疾病的发病机制，为疾病的预防与治疗提供新的思路与方法。
3. 医学研究：胚胎干细胞具有高度的自我更新能力和多向分化潜力，可应用于医学研究领域，如组织工程、药物研发等。
四、讨论与展望阿尔巴斯白绒山羊与绵羊的胚胎干细胞培养技术为动物育种、疾病防治等方面提供了新的可能。
然而，该技术仍存在一些挑战与问题，如培养环境的控制、干细胞的分化与调控等。
未来，我们需要进一步深入研究胚胎干细胞的生物学特性，优化培养条件与方法，以提高干细胞的增殖与分化效率。
胚胎干细胞技术与IPS技术
成熟动物细胞分化的可逆性与iPS技术中文摘要英国发育生物学家约翰·格登在20世纪60年代就发现已分化成熟的动物体细胞细胞核具有去分化从而表达全部遗传信息的潜能，他当时所做的实验即把美洲爪蟾的小肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。
后来日本京都大学的山中伸弥在格登等人的研究基础上在24个遗传基因中挨个移除，直到确定了4个不能缺少的因子，然后利用iPS成功将成熟的体细胞诱导成为多功能胚胎干细胞，并将其分化成不同的细胞。
关键词：动物细胞、可逆分化、干细胞、iPS2012年诺贝尔生理学或医学奖在瑞典斯德哥尔摩揭晓，京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心主任长山中伸弥、英国发育生物学家约翰·戈登因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获奖。
所谓细胞核重编程即将成年体细胞重新诱导回早期干细胞状态，以用于形成各种类型的细胞，应用于临床医学。
格登和山中伸弥的研究成果是在前人的基础上取得的。
想了解清楚格登和山中伸弥在细胞核重新编程研究领域获得的成果，首先得弄清楚细胞的分化与多功能干细胞相关的知识。
在个体发育中，细胞在形态结构和功能上发生变化的过程称为细胞分化。
一般来说，已分化成熟的细胞保持分化后的状态，直至死亡。
从分子水平看，细胞分化意味着各种细胞内合成了不同的专一蛋白质（如水晶体细胞合成晶体蛋白，红细胞合成血红蛋白，肌细胞合成肌动蛋白和肌球蛋白等），而专一蛋白质的合成是通过细胞内一定基因在一定的时期的选择性表达实现的。
因此，基因调控是细胞分化的核心问题。
多细胞植物的生长发育之初，只是一团形态相同或相近的细胞，后来长成由各种形态结构、生理功能各异的细胞组成的个体。
这一切都归功于细胞的分化。
植物细胞具有全能性，即每个细胞都具亲本所有的遗传信息，在一定的内外条件下可发育生长成相同的细胞和个体。
动物细胞分化的一个显著特点是分化状态的稳定性，特别是在高等生物中，分化一旦确立，则分化状态十分稳定。
胚胎干细胞的分化与操作技术
胚胎干细胞的分化与操作技术胚胎干细胞是一类极为重要的细胞类型，它们具有无限制的自我更新能力和分化能力，可以分化为各种不同类型的细胞，如神经细胞、心肌细胞和肝细胞等。
因此，胚胎干细胞在组织工程、再生医学和药物筛选等领域中具有广泛的应用前景。
本文将从胚胎干细胞的分化和操作技术两个方面探讨其相关知识。
一、胚胎干细胞的分化1. 胚胎干细胞的来源胚胎干细胞来源于早期胚胎发育的内质球，一般来自人类或动物的受精卵。
在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以不断地自我更新和分化，形成各种不同类型的细胞。
这种特殊的分化潜能使得胚胎干细胞成为了组织工程和再生医学领域中重要的研究对象。
2. 胚胎干细胞的分化类型2.1. 向神经细胞分化在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以通过一系列的生化处理和激素调节，分化为神经细胞。
这种无细胞移植的技术，已被广泛地应用于神经系统疾病的治疗，如帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤等。
2.2. 向心肌细胞分化在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以通过生长因子和激素的管理，分化为心肌细胞。
这种技术目前已经实现了体外培育心肌片，对心脏病和心肌损伤的治疗有着广泛的应用前景。
2.3. 向肝细胞分化在体外培养的条件下，胚胎干细胞可以通过化学物质和激素的调节，分化为肝细胞。
这种技术可以应用于肝脏损伤和肝癌的治疗中。
二、胚胎干细胞的操作技术1. 胚胎干细胞的提取目前，胚胎干细胞主要通过体外受精的方法获得。
从优质卵子和精子中提取出受精卵后，使其在体外进入早期胚胎的发育进程。
从发育过程中的早期胚胎的内质球中分离出胚胎干细胞，科学家就可以开始对其进行操作。
2. 胚胎干细胞的培养在实验室中，胚胎干细胞通过培养基的供应进行体外培养。
培养基中的维生素和氨基酸等成分可以保证细胞分化所需的元素，并且可以保证其无限制的自我更新能力。
这种培养方法使得生物医学领域中各种研究得以开展。
3. 胚胎干细胞的操纵在实验室中，胚胎干细胞可以通过各种方法和技术进行操纵。
利用培育技术进行胚胎干细胞研究的实验步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞研究的实验步骤胚胎干细胞研究是生命科学领域的一项重要研究课题，它对于理解人体发育过程、疾病治疗和组织再生等方面具有潜在意义。
而在胚胎干细胞研究中，培育技术是至关重要的一环。
本文将介绍胚胎干细胞研究中利用培育技术的实验步骤。
首先，胚胎干细胞的获取是进行研究的第一步。
在动物模型中，研究者通常选择小鼠胚胎作为胚胎干细胞的来源。
小鼠胚胎干细胞的获取通常是通过体外受精的方式，将小鼠卵子和精子结合并进行体外培育，待胚胎发育到适当的阶段时，可以将其收集下来进行后续实验。
在人类胚胎干细胞研究中，由于伦理和法律的限制，获取胚胎干细胞的方式相对复杂。
一种常用的方法是通过人类体外受精（IVF）技术，从试管婴儿中获得过剩的胚胎。
这些胚胎经过特定的处理和培养条件，可以获得人类胚胎干细胞。
接下来，培养胚胎干细胞需要提供合适的培养基。
培养基是一种特殊的液体，可以提供胚胎干细胞所需的营养物质和生长因子。
常用的培养基包括DMEM/F12等。
在培养基中，还需要添加适当的血清或血清替代物，以提供额外的营养和生长因子。
同时，在胚胎干细胞培养过程中，细胞需要附着在培养器皿上进行生长。
因此，在实验中，需要将胚胎干细胞转移到预先涂有特殊细胞粘附层的培养器皿中。
常用的细胞粘附层包括凝血素、明胶和胶原等。
在胚胎干细胞的培养过程中，温度和CO2浓度也是需要严格控制的因素。
一般情况下，胚胎干细胞的培养需要在37摄氏度和5% CO2的气氛下进行。
这样的环境条件可以模拟人体内的生长环境，促进细胞的正常生长和分化。
此外，胚胎干细胞在培养过程中需要定期检查和处理。
研究者通常使用显微镜观察细胞的生长状态，以及细胞形态的变化。
当细胞生长到一定程度时，需要进行细胞分离和传代，以保持细胞的稳定生长。
细胞分离可以通过使用胰蛋白酶等消化酶来实现，将细胞从培养器皿上分离下来，然后重新接种到新的培养器皿中。
在培育技术的基础上，胚胎干细胞研究可以进一步开展细胞分化实验。
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2 成体干细胞 部分分化潜力 如骨髓间充质干细胞
3 诱导的多能性干细胞 具有与ES细胞同样的分化潜力
第三节 干细胞的应用
一、胚胎干细胞的应用 二、成体干细胞的应用 三、iPS的应用
一、胚胎干细胞的应用
1 细胞替代治疗 我国目前 人体器官 的供求比 为1∶100
2 体内发育模型 可在体外再现 从内细胞团分化 至各个组织器官 发育的过程，为 研究人类早期发 育的机制提供了 平台
二、成体干细胞
1 细胞替代治疗
1 克隆器官
三、 iPS的应用
1 临床应用 风险太大
2 基础研究
1 病理模型
2 细胞治疗
四、存在的问题
1. 2. 3. 4.
免疫排斥 伦理 致癌 关键技术的突破
内容
第一节 干细胞研究历程 第二节 涉及干细胞的一些基本概念 第三节 干细胞的应用前景
第一节 干细胞研究历程
1981年建立了小鼠ES（EK）细胞系， 花了8年的时间； 1988年建立了仓鼠ES细胞系； 1994年用胚胎培养和原始生殖细胞培养 法获得了猪的ES细胞； 1998年美国威斯康星大学从体外受精囊 胚中分离得到了人的ES细胞，人ES细胞 的分离成功引起了生物学界和医学界的 广泛关注。
体内还存在有另一种未完全特化的原始 细胞，称为成体祖细胞/干细胞 具有向终末细胞分化的能力，但却不能 自我更新，部分可以短期的自我复制， 但经过几次细胞分裂后，产生的子代细 胞最终都会分化 成体祖/干细胞是干细胞向终末细胞分 化的中间阶段细胞
诱导的多潜能干细胞
2006 年7 月，日本科学家首次宣布发现了将 小鼠皮肤细胞转化为多能干细胞的方法 2007 年11 月，美国和日本科学家将人类细 胞诱导为iPS 细胞，被《Science》杂志评为 2008 年世界十大科技进展之首。 据《Nature》杂志报道，研究人员从iPS 细胞 （诱导多功能干细胞）培育出了能存活的成 年小鼠。研究人员采用了“四倍体互补”技 术，使注射的多能细胞生成嵌合小鼠，而胚 胎组织则完全来自注射的细胞
干细胞是一类特殊的细胞，“干”译自英 文“stem”，意为“( 树) 干”和“起源”。 干细胞就如同树的枝干，是一群结构和功 能未特化的原始细胞。干细胞一个很重要 的特点是自我更新，指的是干细胞在长期 的细胞增殖过程中，每次细胞分裂后产生 的子代细胞中至少有一个(或同时两个)还保 持着干细胞的原始状态，即干细胞能够长 期的进行自我复制。干细胞另一个重要的 特点是分化能力，尽管干细胞停留在原始 状态，但是在特定条件下能够分化产生一 种或多种终末细胞
第二节 涉及干细胞的一些基本概 念
一、 什么是干细胞 二、干细胞的分化潜能
一、 什么是干细胞
动物体的构成始于1 个受精卵反复分裂 而成。从这个原始受精卵能分化出动物 的一切种类的细胞和组织 在胚胎发育初期的干细胞即ES细胞,在 试管内培养即可分化出机体的各种细胞。 1981 年从大鼠胚泡内部的细胞团( ICM) 初次分化培养建立ES 细胞株