乙醇诱导的肝癌细胞HCC-9204 凋亡及其与Bax 和Bcl-2 蛋白的关系

Ethanol-induced apoptosis of hepatoma cell line HCC-9204 and its relationship to Bax and Bcl-2 proteins
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R-Z>J[1-3[ 0\ P>[G0.0XH V ]02J[G /M.M[>JH /-LM:>. O3M^-J ’ NM[H V YM _ >3 &$%%)5 V "G>>3?M PJ0^M3:- V ,GM3>
$ 材料和方法 $< $ 材料 人肝癌细胞系 D,,’E5%7 为本室建立， 用含 $8% 1B C B 新生牛血清的 ;P/! $F7% 培养液 于 )&b 、8c ,d5 条件下进行培养。噻唑蓝 * /@@ 4 和 碘化 丙 啶 * P! 4 为 美 国 "MX1> 公司 产 品 。 @O#QB 细胞凋亡检 测试剂盒为德国 S0-GJM3X-J />33G-M1 公司产品。;#>N- = 为美国 PJ01-X> 公司产品。鼠
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!""# $%%&’(&)( 细胞与分子免疫学杂志 * + ,-.. /0. !11230. 4 5%%$6 $& * 7 4
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抗人 9:; 单克隆抗体 * 1<= 4 和鼠抗人 9>.’5 1<= 均 为美国 ?3>0@-3- 公司产品。免疫组化 <9, 试剂盒 为美国 A->B0C 公司产品。 $D 5 方法 $D 5D $ 肝癌细胞凋亡的诱导 将接种于 E8 孔板的 F,,’E5%7 细 胞 培 养 至 对 数 期 ， 换 用 含 5% G $%% 1H I H 乙醇的培养液 * 每个浓度设 J 个复孔 4 继续 培养 8 K，并以 F,,’E5%7 细胞和单纯的培养液作 为对照，于倒置显微镜下观察细胞的形态学变 化 。 用 常 规 /LL 法 ， 检 测 不 同 浓 度 的 乙 醇 对 F,,’E5%7 细胞的杀伤作用，获得的 <7E% 值经 B 检 验处理，并按下列公式计算杀伤率 *M 4：杀伤率 * M 4 N * $’ 实验组的 <7E% 值 I 对照组的 <7E% 值 4 O $%%M 。选择诱导 F,,’E5%7 细胞凋亡效果最为明 显的乙醇浓度，用于以下诱导 F,,’E5%7 细胞凋亡 的实验。 $D 5D 5 肝癌细胞凋亡的检测 * $ 4 /PP 法染色：! 细胞爬片用 EJ% 1H I H 乙醇固定 $J 1Q3；"滴加 /PP 染液染 5 G J 1Q3；#脱水、透明、封片。以 F,,’E5%7 细胞和用含 $%% 1H I H 乙醇的培养液培 养 8 K 的 F,,’E5%7 细胞分别作为活细胞和坏死细 胞对照。 * 5 4 LR#SH 检测法：固定细胞爬片后，按 LR#SH 试剂盒中的说明书进行。检测中以 T9" 代 替 U!L, 标 记 的核 苷 酸 和 LVL 反 应 液 作 为阴 性 对 照，于荧光显微镜下观察。 * ) 4 不同细胞周期 W#< 含 量 的 分 析 ： 细 胞 经 &%% 1H I H 乙 醇 固 定 和 X#:Y- < 处理后，用 T! 染色，并以流式细胞仪记 录波长 7(( 31 处的红色荧光。 $D 5D ) 免疫细胞化学染色和图象定量分析 细胞 滴 片 经 EJ% 1H I H 乙 醇 固 定 后 ， 分 别 以 鼠 抗 人 9:; 或 9>.’5 1<= 为一抗，进行常规免疫细胞化学 <9, 法染色。打开 FT!<"’$%%% 彩色病理图文分析 系统的免疫组化定量分析窗口，在显示器上随机 选取每张细胞片中不相重叠的 7% O 视野 * 向同一方 向移动细胞片 4 ，计数约 )%% 个细胞。由计算机给 出平均光吸收 * :Z-C:@- 0[BQ>:. :=Y0C=:3>-\ <?< 4 和 积 分 光 吸 收 * Q3B-@C:. 0[BQ>:. :=Y0C=:3>-\ !?< 4 数 值，以及 B 检验的结果 *T 值 4 。
Keywords: -[G>30.6 >Z0Z[0NMN6 G-Z>[0:-..2.>J :>J:M301>6 9:.’5
Abstract: Aim @0 -?Z.0J- [G- -[G>30.’M3L2:-L >Z0Z[0NMN -\\-:[ 03 G-Z>[0:-..2.>J :>J:M301> * D,, 4 :-..N >3L M[N J-.>[M03NGMZ [0 [G- -?ZJ-NNM03 0\ >Z0Z[0NMN’>NN0:M>[-L X-3-NV 9>? >3L 9:.’5< Methods @G- :H[0[0?M: -\\-:[ 0\ 5% A $%% 1B C B -[G>30. 03 D,, :-.. .M3- D,,’E5%7 K>N [-N[-L 9H [GM>‘0.H.’9.2- * /@@ 4 >NN>H< @G-3 >Z0Z[0NMN 0\ D,,’E5%7 :-..N K>N M3L2:-L KM[G F% 1B C B 0\
* $ 第四军医大学病理学教研室，陕西 西安 &$%%)5， 5 上海第二医科大学第九人民医院口腔医学研究所，上海 5%%%$$ 4
关键词：乙醇；细胞凋亡；肝细胞癌；9:.’5 基因
中图分类号：;&)8< &
文献标识码：=
摘 要： 目的 探讨乙醇对肝癌细胞凋亡的诱导作用及其与 凋 亡 相 关 基 因 9>? 和 9:.’5 表 达 的 关 系 。 方 法 用 噻 唑 蓝 * /@@ 4 法检测浓度分别为 5% A $%% 1B C B 的乙醇对肝癌细 胞系 D,,’E5%7 的杀伤作用。然后，用 F% 1B C B 乙醇作用 F G 诱 导 D,,’E5%7 细 胞 凋 亡 。 以 />H’IJ23K>.L’IM-1N> * /II 4 染色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的 LO@P 缺口 末端标记 * @O#QB 4 法和流式细胞术分别分析凋亡细胞的形 态学变化、R#= 断裂情况和不同细胞周期的 R#= 含量变 化。用免疫细胞化学染色图象分析法，检测诱导凋亡前、 后 S>? 和 S:.’5 蛋白表达水平的变化。结果 随着乙醇浓度 的 增 加 ， 其 对 D,,’E5%7 细 胞 的 杀 伤 作 用 逐 渐 增 强 。 F% 1B C B 乙醇可使 D,,’E5%7 细胞发生明显的细胞凋亡的形 态学变化，并且大部分细胞为 @O#QB 阳性着色。流式细胞 术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰。诱导凋亡后的 D,,’E5%7 细胞 S>? 蛋白的表达水平明显增高，而 S:.’5 在 诱导凋亡前、后的 D,,’E5%7 细胞中均未见表达。结论 低 浓 度 乙 醇 对 肝 癌 细 胞 D,,’E5%7 具 有 明 显 的 凋 亡 诱 导 作 用，其凋亡的发生与 S>? 蛋白表达水平的增高有关。
!!!!!!!!!!!! 收稿日期：5%%% e %F e 5)6 修回日期：5%%% e %E e )% 作者简介：杨连君 * $EF(’ 4 ，男，黑龙江哈尔滨市人，讲师，博士
西安市长乐西路 $& 号，@-.< * %5E 4 ))&787$’$$8
-[G>30. \0J F G< @G- 10JZG0.0XM:>. :G>3X-V R#= 9J->a>X- >3L [G- :G>3X- 0\ R#= :03[-3[ 0\ LM\\-J-3[ :-.. :H:.-N 0\ [G- >Z0Z[0[M: :-..N K-J- L-[-:[-L 9H />H’IJ23K>.L’IM-1N> * /II 4 N[>M3M3XV >3L [-J1M3>. L-0?H32:.-0[MLH. [J>3N\-J>N-’1-LM>[-L LO@P 3M:a -3L .>9-.M3X * @O#QB 4 >NN>H >3L \.0K :H[01-[-J J-NZ-:[M^-.H< @G- :G>3X-N 0\ -?ZJ-NNM03 .-^-. 0\ S>? >3L S:.’5 ZJ0[-M3N K-JL-[-:[-L 9H M11230:H[0:G-1M:>. N[>M3M3X >3L M1>X- >3>.HNMN< Results @G- GMXG-J [G- :03:-3[J>[M03 0\ -[G>30. K>NV [G- N[J03X-J [G- :H[0[0?M: -\\-:[ 03 D,,’E5%7 :-..N K>N< F% 1B C B 0\ -[G>30. :02.L .->L [0 09^M02N.H 10JZG0.0XM:>. >Z0Z[0[M: :G>3X-N 0\ D,,’E5%7 :-..NV >3L 1>U0JM[H 0\ [G- :-..N K-J- @O#QB Z0NM[M^9H @O#QB .>9-.M3X >NN>H< @HZM:>. >Z0Z[0[M: N29’I$ Z->a K>N 09N-J^-L 9H \.0K :H[01-[-J< @G- .-^-. 0\ S>? ZJ0[-M3 -?ZJ-NNM03 M3:J->N-L NMX3M\M:>3[.H >\[-J M3L2:-L KM[G F% 1B C B 0\ -[G>30. \0J F GV 30 -?ZJ-NNM03 0\ S:.’5 K-J- \023L 9-\0J- >3L >\[-J M3L2:-L KM[G -[G>30.< Conclusion B0K L0N- 0\ -[G>30. :>3 M3L2:- >Z0Z’ [0NMN 0\ D,,’E5%7 :-..N 09^M02N.HV >3L 0::2J>3:- 0\ [G- >Z0Z’ [0NMN MN J-.>[-L [0 [G- M3:J->N- 0\ [G- .-^-. 0\ S>? ZJ0[-M3 -?’ ZJ-NNM03<