毕业答辩-叶芳

16.8±1.9
12.2
19.7 ＞51.5
79.2±15.5
45.3±6.7
形态描述: 雌虫热杀死后，向腹面 弯曲。唇区缢缩明显，口针 基部球明显。中食道球椭圆 形，食道腺长叶状。单卵巢 前伸，卵母细胞单行排列。 子宫囊较长，尾圆锥形，逐 渐变细，末端收缩，尾端具 3-4个小突起。雄虫，体前 部与雌虫相似，尾部向腹面 弯曲，单精巢前伸，交合刺 玫瑰刺状，基顶和喙突中等 发达，尾端形态与雌虫相似。
2.7 电泳检测
扩增反应结束后，在1.2%琼脂糖凝胶中电泳； 电泳结束后用溴化乙锭染色20 min, 凝胶成像仪 观察。
2.8 目的片段DNA回收
在紫外灯下用无菌的刀片将目的片段切割下 来，尽可能地去掉不含目的片段的琼脂糖凝胶。
2.9 测序以及引物与探针设计
将产物（菌液）送Genetime公司测序，并设 计引物与探针。
2 材料与方法
2.1 线虫样本来源
从重庆市收集马尾枯死松木样品1份，分离 马尾松枯死中线虫。2.2 线虫的分离
取枯死样木的木质部，劈成细木条约100g， 用常规的贝尔曼漏斗法收集线虫。
2.3 线虫的培养和固定
用吸管挑取线虫培养在灰葡萄孢上，25℃ 下培养5-10天，收集。在65℃水浴锅中热杀死 后固定，其中，固定液用FG(福尔马林+甘油)双 倍固定液。
3 结果与分析
3.1 分离物形态鉴定
经过线虫分离鉴定， 从重庆市收集的1份 马尾松枯死木样品中 分离到薄荷滑刃线虫， 其形态计测值、形态 n 特征等鉴定结果如表 1. L/µm 分类地位: 滑刃目， a 滑刃总科，滑刃科， b c 滑刃属。 C’ 寄主：马尾松。 v 分布：重庆市。
St/µm
Sp/µm Tail/µm 表1 Aphelenchoides menthae不同虫口的比较 Tab.1 The comparison of morphometrics of different population of Aphelenchoides menthae Lisetskaya,L.F. 重庆 1971 雌 雄
3.2 分离物形态鉴定
3.3 引物与探针特异性验证
图3 松材线虫引物与探针扩增结果
由图可以看出，仅薄荷滑韧线虫扩增产物出现阳性 信号，而星尖滑韧线虫、双尾滑刃线虫以及阴性对照的 均无阳性扩增产物。因此，薄荷滑韧线虫引物与探针具 有种特异性，为薄荷滑韧线虫的特异引物与探针。
4 结论与讨论
从重庆市马尾松枯死木中分离到的一株种 寄生线虫，经形态鉴定，属于滑刃目的薄荷滑 刃线虫 。 对所分离的薄荷滑刃线虫进行培养，测定 了ITS序列。利用软件设计了引物与荧光探针。 经特异性验证，薄荷滑韧线虫引物与探针具有 种特异性，可以检测样品中是否含有该种线虫。 本研究分离得到的薄荷滑刃线虫 与原始描 述相同，雌虫尾较长，末端具3-4个小突起，雄 虫交合刺玫瑰刺形。体长较长大于原始描述的 590-980µm，a值相比原始值小，与黄任娥等描 述的形态特征相同，测量值相近。故认为L和a 值与原始描述不同，可能是不同地理来源和环 境影响的结果。
重庆市马尾松枯死木一株 线虫分离物的鉴定与检测
专 指导教师： 陈凤毛 业：树木与观赏植物保护 学生姓名： 叶 芳
内容提纲
1 2 3 4 5 选题的背景和意义 材料与方法 结果与分析 结论与讨论 致 谢
1 选题的背景和意义
随着松材线虫对我国部分地区松树的毁灭性 危害，人们越来越重视松树寄生线虫与松树的健康 关系。目前，在我国松树上已经发现寄生线虫有11 属的42种以及11个未定种。除松材线虫外，一些 线虫如拟松材线虫等能够引起某些松树的死亡。如 何对松树体内这些优势线虫种群进行鉴定和区分， 是检疫实践上亟待解决的问题。 本文拟对来自重庆市马尾松枯死木内分离的一 株线虫的种类进行形态鉴定，期望摸清体内寄生线 虫的情况，开发相应的分子检测技术，为松树检疫 性有害生物管理决策提供参考。
6致
谢
本论文是在陈凤毛导师和徐国芳 师姐的悉心指点和帮助下完成的， 在这里我表示深深的谢意，并向各 位老师不辞辛苦参加我的论文答辩 表示衷心的感谢，并对大学四年来 我有机会聆听教诲的各位老师表示 由衷的敬意！
15
10 590-980
1035.5±169.0
868.6±78.6
42.8±11.9
12.6±3.7 13.1±1.0 6.9±1.8 63.0±2.9
49.0±8.0
10.6±1.8 19.5±2.8 4.0±0.5
55-75
10.8-12.6 15-19 ＞4.8 68-75
12.6±2.2
11.5±0.9
2.4 线虫永久玻片制备
（1）线虫的杀死（4%的甲醛溶液热杀死法） （2）线虫的固定 （3）甘油处理 （4）封片
2.5 线虫的鉴定
用LeicaDFC320光学显微镜观察线虫体 内和体表结构，根据Deman公式进行形态 测计。
2.6 基因组DNA的提取以及 核糖体ITS区PCR扩增
（核糖体ITS区序列测定结果—第3部 分）