人型支原体实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立_张慧芳

人型支原体（ Mycoplasma hominis） 是支原体的 一 种 ，寄 居 于 人 的 泌 尿 生 殖 道 ，是 引 起 泌 尿 生 殖 道 感染，尤其是 女 性 泌 尿 生 殖 道 感 染 的 常 见 病 原 之 一［1］，可引起 女 性 盆 腔 炎、肾 盂 肾 炎、阴 道 炎 等 疾 病。国内对人型支原体研究起步较晚，始于 20 世 纪 80 年代。目前其科研报道较少，临床诊断技术 相 对 落 后 ，缺 乏 快 速 准 确 地 诊 断 技 术 ，导 致 部 分 患 者确诊 困 难，从 而 影 响 治 疗，增 加 了 临 床 疾 病 负 担。人型支 原 体 分 离 培 养 营 养 要 求 高，需 要 在 培 养基中添加胆固醇和核酸前体。相对其他生殖道
依据人型支原体gap 基因保守区域使用 Beacon Designer 7. 0 软件设计引物和探针，建立人型支原体 real-time PCR 检
测方法并优化。对优化后的方法进行实验室灵敏度、特异度和检测限评价，并与聚合酶链反应（ PCR） 进行比较。 结果 该 real-time PCR 对于人型支原体的检测限为 50 cfu，PCR 检测限为 5 × 103 cfu，其检测灵敏度为 的 100 倍。
基金项目： 国家科技重大专项课题（ No． 2011ZX10004 － 001） 作者单位： 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防
控制国家重点实验室，北京 102206 作者简介： 张慧芳，女，山西省太原市人，硕士，主要从事细菌的分离
培养工作 通信作者： 赵飞，Tel： 010 － 58900754，Email： zfneversaydie@ yahoo． com． cn 收稿日期： 2011 － 10 － 14
www． jbjc． org·DOI： 10. 3784 / j． issn. 1003 － 9961. 2012. 3. 011
疾病监测 2012 年 3 月 31 日第 27 卷第 3 期 DISEASE SURVEILLANCE，Mar． 31，2012，Vol. 27，No. 3
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萄球菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌。使用 浓度 1 ～ 106 cfu / μl 的人型支原体核酸质粒标准品对 体系检测限检测，检出限和特异度试验均重复 3 次。 1. 5 与 PCR 方法检测比较 使用人型支原体核酸 质粒标准品对 PCR 与该 real-time PCR 方法进行检 测能 力 比 较。 扩 增 PCR 扩 增 引 物 Mh-F： 5'-TCA GGC GCT TCA TGT ACT ACT AAC-3'； Mh-R： 5'-GTG GAG CAT CTT GTA ATC TTT GG-3'，使 用 TaKaRa Ex Taq Kit 对浓度 10 ～ 106 cfu / μl 的人型支原体核 酸质粒 标 准 品 扩 增，10 × ExTaq buffer 2 μl，dNTP Mix 1. 6 μl，Ex Taq 0. 1 μl，引物 Mh-F / R（ 10 mmol / L） 各 0. 4 μl，模板 5 μl，去核酸水补至20 μl。反应条件： 94 ℃ 5 min，然后 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共 30 个 循 环。PCR 结 果 使 用 1. 5% 琼 脂 糖 电 泳 观察。
所建立的检测方法对其他 10 种常见支原体、12 种泌尿生殖道感染病原菌染色体及人类染色体的扩增均为阴性。
结论 本研究建立的 real-time PCR 方法可灵敏、特异的检测人型支原体，有望用于临床标本检测。
关键词： 人型支原体； 实时荧光聚合酶链反应； 检测
中图分类号： R518． 9
文献标识码： A
文章编号： 1003 － 9961（ 2012） 03 － 0202 － 03
Establishment of real-time PCR assay to detect Mycoplasma hominis ZHANG Hui-fang，ZHANG Jian-zhong，ZHAO Fei． State Key Laboratory for Communicable Diseases Prevention and Control，Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China Corresponding author： ZHAO Fei，Email： zfneversaydie@ yahoo． com． cn Abstract： Objective To develop a real-time PCR assay to detect Mycoplasma hominis． Methods By analyzing the gap gene of M． hominis，an optimized real-time PCR assay w as designed． The specificity，sensitivity and detection limit of the assay w ere evaluated and compared w ith conventional PCR assay by using standard concentration DNA of M． hominis． Results The detection limit of the assay w as about 50 cfu and the specificity of the assay appeared to be 100% ． The sensitivity of this real-time PCR assay w as 100 times higher than that of conventional PCR． Conclusion This real-time PCR assay might be a suitable method for the clinical detection of M． hominis． Key words： Mycoplasma hominis； real-time PCR； detection This study was supported by the National Science and Technoloy Key Project of“Major Infectious Diseases Such as AIDS and Viral Hepatitis Prevention and Control”（ No． 2011ZX10004 － 001）
常见病原菌，其生长速度较慢，临床标本需培养 48 ～ 96 h。鉴于以上特点，一般临床不使用分离培养 作为人型支原体常规检测手段。目前已有许多报 道使用聚合酶链反应（ PCR） 和巢式 － 聚合酶链反 应（ Nest-PCR） 检 测 各 种 支 原 体 感 染［2］，国 内 目 前 对于 人 型 支 原 体 多 使 用 上 述 两 种 方 法 进 行 检 测［3 － 5］。由于 PCR 其 检 测 灵 敏 度 有 限，会 造 成 低 带菌量标 本 检 测 假 阴 性 结 果； Nest-PCR 灵 敏 度 优 于 PCR，但是 其 操 作 过 程 很 容 易 造 成 污 染 引 起 假 阳性扩增，同 时 检 测 时 间 更 长。鉴 于 以 上 两 种 方 法的不足，多 种 病 原 菌 都 已 建 立 更 加 快 速、灵 敏、 特异的实时荧光聚合酶链反应（ real-time PCR） 检 测方法，并 适 用 临 床 标 本 检 测。目 前 国 内 还 未 发 现有关 人 型 支 原 体 real-time PCR 检 测 方 法 的 报 道，建立 real-time PCR 检 测 方 法 对 于 提 高 人 型 支 原体检测 准 确 度，提 升 检 测 效 率 有 重 要 意 义。本 研究拟建立一种灵敏、特异的人型支原体 real-time
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◇传染病监测◇
人型支原体实时荧光聚合酶链反应 检测方法的初步建立
张慧芳，张建中，赵飞
摘要： 目的 建立一种快速、灵敏和特异的人型支原体实时荧光聚合酶链反应（ real-time PCR） 检测技术。方法
2 结果
2. 1 体系扩增效率 对 50 ～ 5 × 106 cfu / μl 标准品 核酸检测 获 得 扩 增 标 准 曲 线 及 斜 率 （ 图 1 ） ，斜 率 为 － 3. 523，可信度 R2 = 0. 999。经公式计算该体系 扩增效率 E = 92. 3% 。 2. 2 特异度及检测限 该体系对常见 10 种支原体 及 12 种泌尿生殖道感染病原核酸扩增结果均为阴 性，人 类 染 色 体 扩 增 结 果 也 为 阴 性，特 异 度 达 100% 。经人型支原体核酸质粒标准品检测，该体系 检测限约为 50 cfu。对于 50 ～ 5 × 106 cfu 带菌量的 标本有良好的检测能力。 2. 3 与 PCR 方法比较 使用浓度 1 ～ 106 cfu / μl 的 人型支原体核酸质粒标准品，PCR 扩增产物大小为 133 bp，对上述人型支原体浓度梯度核酸检测限 5 × 103 cfu（ 图 2） ，real-time PCR 方法检测限为50 cfu，检 测灵敏度比 PCR 高 100 倍。
PCR 检测方 法，为 临 床 人 型 支 原 体 感 染 检 测 提 供 新的技术支持。
1 材料与方法
1. 1 引物与探针 使用 Beacon Designer 7. 0 软件 对人型支原体 gap 基因核酸序列设计检测特异性引 物 Primer-F： 5'-AAG CGA AGG TGT TAA AAC-3' 和 Primer-R： 5'-GTT GGC AAT AGG AGC TAA-3'，探针 Prob： 5'-（ FAM） TCA GTA AAC GAA GAT （ BHQ1 ） ATC ATT ACG CCA GAA G-3'，引物和探针由上海 辉睿生物公司合成。 1. 2 Real-time PCR 检 测 体 系 及 条 件 12. 5 μl Platinum quantitative PCR SuperMix-UDG （ Invitrogen C11730 － 025） ，1. 0 μl MgCl2 （ 50 mmol / L） ，上下游引 物（ 25 μmol / L） 各 0. 4 μl，探针（ 25 μmol / L） 0. 2 μl， 0. 25 μl Platinum Taq DNA polymerase （ Invitrogen C10966 － 034 ） ，1 μl PCR nucleotide mix （ Promega C1141） ，5 μl DNA 模 板，使 用 nuclease-free water （ Promega P1193） 补至 25 μl。体系混合后使用 C1000 Thermal Cycler （ BIO RAD） real-time PCR 仪扩增检 测。优化的 PCR 反应条件： 95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s， 55 ℃ 30 s，共 40 个循环。 1. 3 扩增效率检测 使用上述优化的扩增体系及 条件对浓度 10 ～ 106 cfu / μl 的人型支原体核酸质粒标 准品对体系扩增效率进行检测。获得核酸质粒标准 品扩增曲线及对数曲线斜率，根据公式计算扩增效率 （ % ） = （ E － 1） × 100% ，式中： E = 10 －1/斜率。 1. 4 特异度及检测限 使用人类染色体及多种支原 体和泌尿生殖道致病菌核酸进行体系特异度验证，包 括生殖支原体、解脲脲原体、穿透支原体、梨支原体、 发酵支原体、肺炎支原体、唾液支原体、口腔支原体、 咽喉支原体、猪鼻支原体、草绿色链球菌、无乳链球 菌、肺炎链球菌、A 族链球菌、C 族链球菌、 金黄色葡