SIV、PCV-2、PRRSV三重PCR检测方法的建立

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PRRSV2PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制-微生物与感染

PRRSV 2PCV2重组病毒的构建及PRRSV 转录调控机制研究郑海红1,2　孙　志1　朱兴全2　袁世山1 【摘要】　目的　本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS V )感染性cDNA 克隆作为猪圆环病毒(PC V2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRS V 复制转录过程进行解剖。

方法　以北美株PRRS V 感染性克隆pAPRRS 为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS 的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PC V2ORF2,且对拯救病毒vPC V 进行了病毒学及分子生物学鉴定。

结果　vPC V 的sgmRNA211利用了PRRS V mRNA2的转录调控序列(TRS ),形成由PRRS V G P2和PC V2衣壳蛋白组成的sgmRNA211。

外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS 而产生3条新亚基因组,其中sgmRNA212和sgmRNA213采用PC V2上的序列来取代PRRS V RNA2本身的TRS;另一条sgmRNA214则为非经典型亚基因组,其TRS 在PRRS V 相应的AUG 下游。

结论　2株PRRS V -PC V2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRS V 遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS 序列的引入及插入片段(718bp )过长导致PRRS V ORF2TRS 本身和其两翼序列的RNA 结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因;PRRS V 可以利用TRS 样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRS V 复制转录过程奠定了基础。

【关键词】　猪繁殖与呼吸道综合征病毒;猪圆环病毒Ⅱ型;载体表达;转录调控序列Construction of recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressing porcine circovirustype Ⅱ(PRRSV 2PCV 2)antigen and study of PRRSV transcription mech anisms with this novel viral vectorZHENG Hai 2hong 1,2,SUN Zhi 1,ZH U Xing 2quan 2,YUAN Shi 2shan 1(Department o f Animal Infectious Diseases ,Shanghai Veterinary Research Institute ,China Academy o f Agricultural Sciences ,Shanghai 200241,China )【Abstract 】　Objective The g oal of the current study is to develop in fectious porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRS V )cDNA clones as expression vectors for porcine circovirus type Ⅱ(PC V2)ORF2antigens and to use this new vector to dissect the replication and transcription abilities of PRRS V 1Methods ORF2from PC V2was inserted into our previously established in fectious clone of PRRS V ,designated pAPRRS ,at three locations :1)between ORF1b and ORF2a ;2)between ORF5and ORF6;and 3)between ORF6and ORF71The three full length mutant clones were then trans fected into M ARC 2145cells ,resulting in three recombinant viruses 1The genetic instability of recombinant virus was further examined via PRRS V ’s mRNA22specific RT 2PCR sequence analysis of sgmRNA2,which enabled us to determine the origin of the sequence at the junction site 1R esults Our results dem onstrated that the sgmRNA2of this recombinant PRRS V 2PC V2has one TRS derived from the PRRS V ORF2TRS ,and tw o TRS segments were derived from the sequence of PC V21One TRS was derived from the PRRS V ORF2noncanonical TRS located at the downstream of PRRS V ORF2initiation cordon 1Conclusion T w o recombinant PRRS V 2PC V viruses are stable for m ore than ten passages ,which makes them useful as marker vaccines 1The m ost comm on reas on for genetic instability of the PRRS V 2PC V recombinant virus is an insertion of a sequence that resembles TRS and a subsequent change of the RNA structure for PRRS V ORF2TRS and its flanking sequence 1PRRS V can use a PC V2sequence as its own TRS ,which is useful for dissecting the mechanism behind PRRS V replication and transcription 1【K ey w ords 】　P orcine reproductive and respiratory syndrome virus ;　P orcine circovirus type Ⅱ;　Express vector ;T ranscription 2regulation sequence 基金项目:国家自然科学基金重点项目资助(编号:30530580);上海市浦江人才项目(2006P J48114) 作者单位:11中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病研究室,农业部动物寄生虫病重点实验室,上海200241;21华南农业大学兽医学院,广州510642 通讯作者:袁世山,E 2mail :shishanyuan @shvri 1ac 1cn 猪繁殖与呼吸道综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus ,PRRS V )和猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus type Ⅱ,PC V2)是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome ,PMWS )的主要病原,给全世界养猪业带来了巨大经济损失。

PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用

PCV-2、PPV和PRV多重PCR检测方法的建立及初步应用陈光达;许信刚;童德文【摘要】【Objective】 A multiplex polymerase chain reaction assay was developed for the clinical detection of porcine circovirus type 2,porcine pseudorabies virus and porcine parvovirus infection of swine.【Method】According to the highly conserved genome sequence of PCV-2,PPV and PRV,three pairs of primers targeting PCV-2 ORF2,PPV NS1 and PRV gB were synthetized.The multiplex PCR reaction condition was optimized and the multiplex PCR for simultaneous detecting PCV-2,PPV and PRV was established.The specificity,sensitivity and repeatability of the multiplex PCR were detected and the multiplex PCR method was applied to clinical sample detection.【Result】 All target fragments were well amplified,when the primers concentra tions were 1.0 μmol/L and the annealing temperature was 57.2 ℃;The specificity test showed that a fragment of 353,265 and 198 bp was amplified from the genomic DNA of PCV-2,PPV and PRV respectively.Three fragments were amplified from the mixed DNA sample of PCV-2,PPV and PRV simultaneously,and no amplification was achieved from other negative control groups.The sensitivity test showed that the multiplex PCR of PCV-2,PPV and PRV DNA could be detected as 26.88,25.34 and 24.9 pg/μL;The results of 3 replication test for each sample at different time were consistent indicating that multiplex PCR had good repeatability.The initial application test showed that the 39 clinical samples were subjected to multiplex PCR.Among these samples,PCV-2 positivepercentage was 53.84%,PPV positive percentage 17.95% and PRV positive percentage 5.13%,co-infection of PCV-2 and PPV percentage 15.38%,co-infection of PCV-2,PPV and PRV percentage 2.57%.【Conclusion】 These results indicated that multiplex PCR had specificity,sensitivity,and repetitive characteristics and multiplex PCR had potential values for detecting of PCV-2,PPV and PRV co-infection in pigs.%【目的】建立可用于临床同时检测PCV-2、PPV和PRV 3种DNA病毒感染的多重PCR方法。

PCV2_PRV和PRRSV多重PCR方法的建立及其应用_耿庆华

兽医研究所，黑龙江哈尔滨１５０００１）
摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ登录的猪伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、猪圆环病毒２型（ＰＣＶ２）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的参考基因序列，设计３对引物分别用于扩增ＰＣＶ２的ＯＲＦ２基因、ＰＲＶ的ｇＥ基因、ＰＲＲＳＶ的Ｎ基因的目的片段，通过优化反应中各个影响因素，建立了ＰＲＶ、ＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ的多重ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）检测方法。敏感性和特异性的结果表明，该方法对这３种病毒的最低核酸检出量分别为３２．５（ＰＲＶ）、２５．２（ＰＣＶ２）、３５．９ｐｇ（ＰＲＲＳＶ）。该方法对猪流感病毒（ＳＩＶ）、猪圆环病毒１型（ＰＣＶ１）、大肠杆菌、猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）、猪流行性腹泻病毒（ＴＧＥ）等病毒的检测结果均为阴性。２００份临床样品的多重ＰＣＲ结果表明，ＰＣＶ２感染率为８０％（１６０／２００），ＰＲＶ感染率为２１％（４２／２００），ＰＲＲＳＶ的感染率为７８％（１５６／２００）。２００份临床样品主要为ＰＣＶ２和ＰＲＲＳＶ混合感染，阳性率达５６．０％（１１２／２００）。该方法的建立对这３种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。关键词：ＰＲＶ；ＰＣＶ２；ＰＲＲＳＶ；多重ＰＣＲ中图分类号：Ｓ８５２．６５文献标志码：Ａ文章编号：１００５－４５４５（２０１４）０９－１３９３－０５
片段长度／ｂｐ１０５７
５００
４６０
１．４临床样品收集收集来自辽宁省的３０份猪呼吸道综合征肺脏样品，吉林省５０份保育仔猪脾脏和淋巴结样品，黑龙江省４０份断奶仔猪脾脏和淋巴结样品，山东省５０份猪流产胎儿样品，福建省３０份保育猪病料。所有样品均提取ＤＮＡ和ＲＮＡ，用于多重ＰＣＲ和单一病毒ＰＣＲ临床样品的检测。１．５样品ＤＮＡ和总ＲＮＡ的提取将临床样品利用ＤＮＡ提取试剂盒（按照天根生化科技有限责任公司生产的ＤＮＡ提取试剂盒说明书进行）和ＲＮＡ提取试剂盒（按照杭州爱思进有限责任公司生产的ＤＮＡ提取试剂盒说明书进行）进行核酸提取。将提取的ＤＮＡ和总ＲＮＡ于－８０℃保存。１．６ＲＴ－ＰＣＲ反应逆转录反应在２０μＬ体系中进

猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR_GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：猪圆环病毒（PCV ）包括猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）。

近些年来，PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染，因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 鉴别检测方法显得尤为必要。

本试验通过特异性引物筛选，各项反应条件优化，建立了实时荧光定量PCR 鉴别方法。

结果表明：PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL 。

与猪瘟病毒（CSFV ）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）、猪伪狂犬病病毒（PRV ）、猪细小病毒（PPV ）均无交叉反应。

批内及批间变异系数均小于1%。

对98份PCV 疑似阳性病料检测结果表明，PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%，共感染率为7.1%。

该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。

关键词：猪圆环病毒；特异性；敏感性；SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）06-0085-07D evelopment and Application of a SYBR Green Real-Time Quantitative PCR Method for Differentiation of Porcine Circoviruses 1, 2 and 3收稿日期：2021-05-24基金项目：山东省重大科技创新工程项目（2023CXGC010705）；山东省现代农业产业技术体系项目（SDAIT-08-06）；山东省自然基金（ZR2022MC011）；济南市“新高校20条”资助项目（202228112）；山东省科技型中小企业创新能力提升工程（2023TSGC0734）；山东省农业科学院创新工程（CXGC2018E10, CXGC2023G03, CXGC2023E02, CXGC2023A21）作者简介：田瑶，女，硕士，主要从事动物病毒学与免疫学研究通信作者：李俊，E-mail：***************；韩先杰，E-mail：**********************猪圆环病毒1型、2型、3型 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 鉴别方法的建立及应用田瑶1,2，时建立2，彭喆2，李琛2，徐绍建2，吴晓燕2,3，李佳昕1,2，杨莹2,3，王硕2，刘畅2，韩红2，李俊1,2,3，韩先杰1（1.青岛农业大学动物医学院，青岛266109；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南250100；3.山东师范大学生命科学院，济南250100）2023,31(6):85-93Abstract: Porcine circovirus (PCV) includes three genotypes: Porcine circovirus 1 (PCV1), Porcine circovirus 2 (PCV2) and Porcine circovirus 3 (PCV3). In recent years, there have been co-infections among these 3 genotypes. Therefore, it is particularly necessary to develop a fast, speciﬁ c and sensitive SYBR Green I real-time quantitative PCR method for differentiation of PCV1, PCV2 and PCV3. In this experiment, a real-time ﬂ uorescent quantitative PCR method was developed by using speciﬁ c primers and optimizing various reaction conditions. The results showed that the lower limits of detection were 40.3 copies/μL for PCV1, 25.2 copies/μL for PCV2 andTIAN Yao 1,2, SHI Jianli 2, PENG Zhe 2, LI Chen 2, XU Shaojian 2, WU Xiaoyan 2,3, LI Jiaxin 1,2,YANG Ying 2,3, WANG Shuo 2, LIU Chang 2, HAN Hong 2, LI Jun 1,2,3, HAN Xianjie 1(1. College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine , Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 3. College of Life Sciences, Shandong Normal University,Jinan 250100, China)· 86 ·中国动物传染病学报2023年12月猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是圆环病毒科圆环病毒属的一种无囊膜环状单链 DNA 病毒，也是迄今为止发现的具有自主复制能力的最小的动物病毒[1-2]。

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制

购白天根生化科技有限公司；引物由宝生物（大连）Ｔ程有
（ＰＲＶ）、猪圆环病毒（ＰＣＶ一２）、猪细小病毒（ＰＰＶ）造成的猪繁殖障碍性疫病越发严重，常常出现混合感染．给养猪场造成了巨大的经济损失［１－３１。目前，主要的检测方法有病毒
盒检测结果与单一ＰＣＲ检测结果完全符合。结果表明该多
重ＰＣＲ试剂盒具有很好的特异性和敏感性．可用于临床
ＰＲＶ、ＰＣＶ一２和ＰＰＶ的检测
１．１病毒和细茵ＰＲＶ、ＰＣＶ一２、ＣＦＳＶ石门系株、ＰＲＲＳＶ美洲株株、大
环病毒２型（ＰＣＶ一２）ＯＲＦ２、猪细小病毒（ＰＰＶ）ｖＰ２基
因序列，设计了３对引物，研制了检测ＰＲＶ、ＰＣＶ－２和
ＰＣＲ，ｍＰＣＲ）诊断方法可一份样品中同时检测出多种病原体，且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低，适合大量临床样品（特别是混合感染样品）中病原体的快速诊断。本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ中的猪伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）ｇＥ、猪圆环病毒２型（ＰＣＶ一２）ＯＲＦ２、猪细小病毒（ＰＰＶ）ＶＰ２

PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR检测方法的建立

维普资讯
第３０卷第５期
２０年５月０８
中国预
防兽
医学报
ＶＯ．０．ｏ５１３Ｎ．Ｍａ２ｙ００８
ＣｈｎｅｅＪｒａｒｖｎｉｔｒｎａｙｅｃｎｅｉｓｏｕｎｌｏｆＰｅｅｔｖｅＶｅｅｉｒＭｄｉｉ
ｆｇｎｓｏｒｍｅｔｆＤＮＡｍｐｉｃｔｎａｐａｅｎ４６ｂ，５ｐ４ｐ２２ｂｎ０ｐｒｓｅｔｅｙＢａｅｎｔｅｏｔｉｅａａｌａｉｐｅｒｄｉ６ｐ７９ｂ，３９ｂ，０ｐａｄ７６ｂ，ｅｐｃｉｌ．ｓｄｏｈｐｉｚｄｉｆｏｖｍｓｇｅＰＣｃｎｉｏｓｔｅｍｕｔｌｘＰｉｌＲｏｄｔｎ，ｈｌｐｅＣＲｆＰｎｉｉｏＣＶ２ＰＶ－ＲＰ一ＰＰＶ— ＲＲＳＣＳＶｓｄｖｌｐｄｔｐｏｉｅａｉＶ— Ｆｗａｅｅｏｅ．Ｉｒｖｄｄａｒｐｄ，ｓｎｉｖｎｅｓｉｅａｄｔｓｅｉｃｄｔｃｉｎｔｃｎｑｅｆｒｔｅｐｅｅｔｎａｄｃｎｒｌｆＣＶ２ＰＶ，ＲｐｃｆｅｅｔｅｈｉｕｏｒｖｎｉｎｏｔｉｏｈｏｏｏＰ，ＰＰＶ，ＲＰＲＳａｄＣＳＶｎｅｔｎＶｎＦｉｆｃｉ．ｏＫｅｒｓｐｒｉｅｃｒｏｉｓｔｐ；ｐｒｉｅｐｒｏｉｓｓｕｏａｉｓｖｒｓｏｃｎｅｒｄｃｉｅａｄｒｓｉｔｒｙ＆ｏｅｙｗｏｄ：ｏｃｎｉｃｖｒｅ２ｏｃｎａｖｖｒ；ｐｅｄｒｂｅｉ；ｐｒｉｅｒｐｏｕｔｎｅｐｒｏｓｎｍｕｙｕｕｖａｙ

PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用

ｂｐ（ＰＲＶ），２５５ｂｐ（ＰＣＶ２）ａｎｄ７５９ｂｐ（ＰＰＶ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
Hale Waihona Puke ｗｉｔｈｇｏｏｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｖｉｒｕｓｅｓｗｅｒｅ２．５ｘ１０～ｎｇ，２．２ｘ１０～ｎｇａｎｄ３．７ｘｌＯ～ｎｇ，ｒｅ— ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｉｆｔｙ－ｓｉｘｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ
瑚
㈣
２５５１９２
Ｍ．２０００ＤＮＡＭ盯ｋｅｒ；１．ＰＲｖ，Ｐｃｖ２，ＰＰｖ；２．ＰＲｖ；
图３
ＰＲＶ，ＰＣＶ２，ＰＰＶ－－ｉＰｃＲ特异性
３．ＰＣＶ２；４．ＰＰＶ；５．阴性对照
Ｍ２３４５
图２
ＰＲＶ、ＰＣＶ２、ＰＰＶ
ＰＣＲ扩增
２．２
ＰＣＲ产物的鉴定
将ＰＣＲ产物连接ｐＭＤｌ９一Ｔ载体后，转化Ｔｏｐｌ０感受态细胞，送上海英骏生物技术有限公司测序。结
ＨＡＯＦｅｉｌ，ＬＩＵＪｉａｎｌ，ＬｉＤａｌ，ＷＥＩＧｕａｎｄｏｎ９１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００２５，Ｃｈｉｎａ；
２．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｅｒｖｉｃｅＣｅｎｔｅｒｏｆ
Ｌｉａｎｇｓｈｕｉｊｉｎｇ
收稿日期：２０１４—０４—２９；修回日期：２０１４－１０－２９基金项目：贵州大学研究生创新基金（研农２０１４０１３）；贵州省科学技术基金（黔科合Ｊ字［２０１３］２ｌｌｏ号）；贵州省２０１４年农业攻关项目［黔科合ＮＹ字（２０１４）３０５５号］作者简介：王洪光（１９８９一），女，硕士生＋通信作者：汤德元，教授，博士，硕导，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｄｙｕａｎ

PRV,CSFV,PCV,PRRSV,等抗体检测试剂盒说明书

猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒说明书Pseudorabies Virus gpI Antibody Test Kit (PRVgpI -Ab)用途畜得测PRV gpI 是用于检测猪血清中伪狂犬病病毒（PRV）gpI抗体的酶联免疫检测试剂盒。

gpI(又名gE)抗体的存在表明猪曾感染PRV的野毒株和/或接种过含gpI抗原的疫苗。

在美国，该试剂用于猪场管理和猪伪狂犬病的根除计划。

当猪场使用gpI缺失PRV疫苗（如Boehringer Ingelheim 公司，Norden公司，Syntrovet公司和Solvay公司产品），并由批准实验室检测时，该试剂被用作州/联邦猪伪狂犬病消除计划的正式判定实验。

概述用来保护猪免受伪狂犬病感染的传统策略，包括使用普通PRV疫苗和USDA许可的基因缺失PRV 疫苗。

传统的血清学方法检测免疫后PRV的感染情况有很大的局限性，因为它们不能区分免疫猪和自然感染猪。

国际上许多疫苗生产商研制了安全有效的PRV gpI缺失疫苗，这种疫苗的使用可以使血清学方法区分免疫猪和自然感染猪。

在这些疫苗中使用的病毒经过选择后消除了毒力因子的合成，但并不影响病毒的抗原性。

另外，由于编码非必需蛋白质gpI的DNA序列的自然缺失，从而提供了血清学的鉴别机制。

因此畜得测PRV gpI检测试剂盒能够排除gpI缺失PRV疫苗免疫抗体的干扰，从而能特异性地检测出野毒株感染的动物和含有gpI抗原的PRV疫苗免疫的动物。

试剂盒中使用的抗体是gpI特异性单克隆抗体。

使用gpI缺失疫苗免疫前，应使用该试剂盒或畜得测PRV筛选和/或确认试剂盒来确定猪的免疫状态。

猪经过免疫后，应至少每半年使用PRV gpI试剂常规检测一次猪PRV野毒株的感染情况。

原理畜得测PRV gpI试验使用两倍稀释(1:2)的血清在PRV抗原包被的微孔中进行。

在第一次的孵育阶段，存在于血清中的包括抗gpI抗体在内的PRV抗体，与塑料板孔上的抗原反应。

PCV3和PCV2双重PCR鉴别诊断方法的建立及应用

PCV3和PCV2双重PCR鉴别诊断方法的建立及应用杨克礼;焦祖武;郭锐;周丹娜;段正赢;田永祥【摘要】本研究根据GenBank中报道的PCV2和PCV3毒株全基因组序列,设计两对特异性引物,建立了一种多重PCR鉴别诊断方法,两种病毒的预期扩增片段分别大小分别为1007 bp和505 bp.通过对扩增条件的优化,获得最佳的反应体系为25μL体系,最佳退火温度为56℃.该鉴别方法可以同时扩增PCV3和PCV2的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒的基因组及阴性对照均未扩增出任何条带.该方法对PCV3和PCV2的最低检出量均为10 ng/μL.对采自湖北省内规模化猪场的260份淋巴结样品检测.结果显示,PCV3阳性率为16.9％(44/260),PCV2阳性率为46.5％(121/260),PCV3和PCV2混合感染率为4.6％(12/260),双重PCR检测与测序分析的符合率为100％.结果表明,本研究建立了一种简便、灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR鉴别诊断方法,可为临床样品中PCV3和PCV2的快速鉴别诊断及流行病学研究提供技术支持.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】6页(P1-6)【关键词】猪环病毒3型;猪圆环病毒2型;双重PCR;鉴别诊断;流行病学【作者】杨克礼;焦祖武;郭锐;周丹娜;段正赢;田永祥【作者单位】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064;农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室,湖北武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉 430064【正文语种】中文【中图分类】S858.8猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是已知的最小的动物病毒，其基因组大小约1.7 kb，包含两个主要的开放阅读框（open reading frames，ORFs）：ORF1和ORF2[1]。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立郑新添;杨小燕;戴爱玲;李晓华;陈星星【摘要】通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及猪轮状病毒（RV）的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。

该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明：建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。

%Three pairs of primers amplified genes of transmissible gastroenteritis virus（TGEV）,porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and porcine rotavirus（RV） respectively were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV,PEDV and RV.The established PCR can detect M gene with the length of 252bp of TGEV,N gene with the length of 540 bp of PEDV and VP7 gene with the length of 412 bp of RV.Negative results when using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 100-pg nucleotide per PCR reaction.Twenty six diarrheal fecal samples collected from viral diarrheal piglet were submitted to detect TGEV,PEDV and RV,and the result showed that this multiplex RT-PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity can be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.【期刊名称】《龙岩学院学报》【年(卷),期】2011(029)005【总页数】4页(P55-58)【关键词】猪传染性胃肠炎;猪流行性腹泻;猪轮状病毒;多重PCR;诊断【作者】郑新添;杨小燕;戴爱玲;李晓华;陈星星【作者单位】龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;龙岩学院生命科学学院;福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心,福建龙岩364012【正文语种】中文【中图分类】S858.28猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE），猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）及猪轮状病毒（Porcine rotavirus，RV）感染，是猪场常见的病毒性腹泻，此三种病毒性腹泻造成了猪场饲料报酬降低、药物和人力增加等重大损失，是危害猪场最严重的疾病之一[1-2]。

猪圆环病毒2_型和3_型检测方法建立及初步应用

·研究论文·摘要：为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）病毒。

本文研究参考GenBank 中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物，成功建立了一种双重TaqMan 荧光定量检测方法。

结果显示：该方法特异性好，可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒；PCV2最低检测下限为1.00×101 copies/µL ，PCV3最低检测下限为1.00×100 copies/µL ；重复性高，批内、批间的变异系数分别为0.01%～0.02%和0.02%～0.05%；本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份，PCV2样品符合率为97.47%，PCV3样品符合率为96.85%；测序结果显示，PCV2均为2d 亚型，PCV3均为3c 亚型。

结果表明，建立的双重TaqMan 荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确，节约成本，可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。

关键词：PCV2；PCV3；双重TaqMan qPCR 方法建立；混合感染中图分类号：S852.651 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2024）02-0151-09Establishment and preliminary application of detection methods forPCV2 and PCV3LI Tong, ZHAO Runze, LI Botian, LI Chunqi, WANG Yan, GUO Liwei, YANG Xiaolin, LIU Gouping(Y angtze University, Jingzhou 434000, China)收稿日期：2023-10-16基金项目：荆州市2022年度自然科学研究专项（202254-07CC）；石首市先行县“先进技术集成示范基地建设与定向攻关”揭榜项目（SS202311）；生猪健康养殖省部共建协同创新中心创新平台项目（2019H2209）作者简介：李桐，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：刘国平，E-mail：******************猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用李桐，赵润泽，李博天，李春琪，王妍，郭利伟，杨小林，刘国平（长江大学，荆州434000）Abstract: Rapid detection and identification of PCV2 and PCV3. In this paper, probe primers were designed with reference to highly conserved fragments of PCV2 and PCV3 in GenBank, and a dual TaqMan fluorescence quantitative detection method was successfully established. The results show that this method has good speciﬁ city and can distinguish porcine circovirus type 2 and porcine circovirus type 3 from other porcine disease viruses. The minimum detection limit of PCV2 is 1.00×101 copies/µL, and that of PCV3 is 1.00×100 copies/µL; The repeatability is high, and the coeﬃcient of variation between batches is 0.01% ~ 0.02% and 0.02% ~ 0.05%, respectively. In this study, 440 pig samples with clinical symptoms such as reproductive disorder, panting, emaciation and pallor, skin inﬂ ammation were collected from large-scale pig farms in Hubei Province, and the established method and commercial kit were used for synchronous detection. The coincidence rate of PCV2 and PCV3 were 97.47% and 96.85%, respectively. The sequencing results showed that PCV2 was subtype 2d, and PVC3 was subtype 3c. The dual TaqMan ﬂ uorescence quantitative detection method was characterized by good speciﬁ city, sensitivity, rapidity, accuracy and cost saving. It can provide technical support for monitoring and prevention of PCV2 and PCV3.Key words: PCV2; PCV3; Establishment of dual TaqMan qPCR; mixed infectionChinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2024,32(2):151-159· 152 ·中国动物传染病学报2024年4月猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCVs）是目前已知最小的动物病毒，为圆形、无包膜、单股负链DNA，属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属[1]。

《利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用》

《利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用》一、引言猪圆环病毒2型（PCV2）是一种常见的猪病病原体，能够引起猪只发生一系列的疾病症状，给养殖业带来严重的经济损失。

为了更准确地检测PCV2，本研究利用荧光定量PCR技术建立了一种新的检测方法，并通过实验验证了其可靠性和实用性。

二、材料与方法1. 材料实验所用样本为疑似感染PCV2的猪只血清样本。

荧光定量PCR试剂盒、引物和探针等均为市售产品。

2. 方法（1）DNA提取：将血清样本中的DNA提取出来，作为PCR反应的模板。

（2）引物和探针设计：根据PCV2基因序列设计特异性引物和荧光探针。

（3）荧光定量PCR反应：将提取的DNA与引物、探针等反应体系混合，进行PCR扩增反应，并实时监测荧光信号。

（4）结果分析：根据荧光信号的强度和变化情况，判断样本中PCV2的含量。

三、实验结果1. 特异性检测利用建立的荧光定量PCR方法对PCV2和其他常见病毒进行特异性检测，结果显示该方法对PCV2具有较高的特异性，对其他病毒的交叉反应较低。

2. 灵敏度检测通过逐步稀释PCV2阳性样本，检测荧光定量PCR方法的灵敏度。

结果显示，该方法能够检测到较低浓度的PCV2，具有较高的灵敏度。

3. 实际应用将建立的荧光定量PCR方法应用于实际检测中，对疑似感染PCV2的猪只血清样本进行检测。

结果显示，该方法能够快速、准确地检测出PCV2，为猪病诊断提供了可靠的依据。

四、讨论本研究利用荧光定量PCR技术建立了检测PCV2的方法，具有较高的特异性和灵敏度。

与传统的PCR方法相比，荧光定量PCR能够实时监测反应过程，提高检测的准确性和可靠性。

此外，该方法还能够快速、简便地检测出PCV2，为猪病诊断提供了新的手段。

在实际应用中，该方法有望为猪病防控和疫情监测提供有力的支持。

五、结论本研究建立了利用荧光定量PCR检测PCV2的方法，并经过实验验证了其可靠性和实用性。

该方法具有较高的特异性和灵敏度，能够快速、准确地检测出PCV2，为猪病诊断提供了新的手段。

H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV_和EU-PRRSV_多重PCR_检测方法的建立及应用

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）感染肺泡巨噬细胞，严重损害免疫系统，导致与其他病毒共感染现象，其中猪流感病毒（SIV ）也是病原之一。

为了快速检测和区分PRRSV 基因型与SIV 亚型，本研究针对H1、H3亚型SIV 的HA 基因和美洲型、欧洲型PRRSV 的N 、M 基因的保守序列，分别设计了4对特异性扩增引物，在引物浓度、退火温度等反应条件的系统优化下，分别对其特异性和敏感性进行验证，建立了能够快速检测以上4种病原的多重PCR 方法，并对155份临床样品进行了检测。

结果显示，该检测方法特异性好、灵敏度高，对H1-SIV 、H3-SIV 、NA-PRRSV 和EU-PRRSV 的最低检出量均低至9.86×100 copies/μL 。

以单一PCR 方法对所有临床样品进行检测后发现，检测结果与多重PCR 检测结果一致，证明这种多重PCR 方法可以用于这4种病毒的快速检测与分型鉴定。

关键词：猪流感病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；多重PCR 中图分类号：S858.28文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0135-07Development and Application of a Multiple PCR Detection Method for H1-SIV ,H3-SIV , NA-PRRSV , EU-PRRSVXU Yi §, YU Liangzheng §, LIN Shuang §, REN Tongwei, WANG Hao, ZENG Hao, GUO Jianing, GUO Jinfan, HUANG Chongqiang, OUYANG Kang, HUANG Weijian, WEI Zuzhang, CHEN Ying(Laboratory of Animal Infectious Diseases and Molecular Immunology, College of Animal Science and Technology, Guangxi University,Nanning 530004, China)收稿日期：2021-11-05基金项目：广西创新驱动发展专项资金项目（桂科AA17204057-1）作者简介：徐毅，硕士，主要从事动物流感病毒分子生物学研究；余良政，硕士研究生，主要从事动物流感病毒分子生物学研究；林霜，本科，主要从事动物流感病毒分子生物学研究；共为第一作者通信作者：陈樱，E-mali：****************.cn H1-SIV 、H3-SIV 、NA-PRRSV 和EU-PRRSV 多重PCR 检测方法的建立及应用徐毅§，余良政§，林霜§，任同伟，王豪，曾昊，郭嘉宁，郭金凡，黄崇强，欧阳康，黄伟坚，韦祖樟，陈樱（广西大学动物传染病与分子免疫学实验室广西大学动物科学技术学院，南宁 530004）2024,32(1):135-141Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infects alveolar macrophages, seriously damaging the immune system, leading to co-infection with other viruses, among which swine influenza virus (SIV) is also one of the pathogens. In order to rapidly detect and distinguish PRRSV genotypes and SIV subtypes, four pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of HA genes of H1 and H3 subtype SIV and N and M genes of the American and European PRRSVs. The primers were optimized for their concentrations and annealing temperatures and the speciﬁ city and sensitivity of this multiplex PCR method were also demonstrated for rapidly detecting these four pathogens. The detection limit of H1-SIV , H3-SIV , NA-PRRSV and EU-PRRSV was as low as 9.86×100 copies/μL. A total of 155 clinical samples were then tested using this multiplex PCR method and single PCR methods. The results were consistent among these PCR methods, indicating that this multiplex PCR method could be used for rapid detection and type identiﬁ cation of these four viruses.Key words: Swine inﬂuenza virus; Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; multiplex PCR· 136 ·中国动物传染病学报2024年2月规模化养殖模式下，猪群间导致多种呼吸道疾病的病毒传播能力显著增强，混合感染的现象频频发生，猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）混合感染的现象在全国范围内都非常普遍，对多地区猪群的调查显示SIV和PRRSV之间以及不同亚型SIV和不同基因型PRRSV之间的混合感染情况日渐严峻。

PRRSV,PCV2和SS2多重PCR检测方法的建立及初步应用的开题报告

PRRSV,PCV2和SS2多重PCR检测方法的建立及初步应用的开题报告1. 研究背景和意义猪繁殖障碍与免疫缺陷综合征 (porcine reproductive and respiratory syndrome and immune deficiency syndrome, PRRS)是猪场中常见的一种疾病，由猪繁殖障碍病毒 (PRRSV) 引起。

此外，猪圆环病毒 (PCV2) 也是猪场中常见的病毒，可以导致多种疾病，如猪圆环病、沙眼性皮肤病和肾脏病等。

还有一种病毒叫做猪链球菌 (SS2) 可能会导致猪场中的疾病，在猪圈中引起大量猪只的死亡。

因此，有效地检测和诊断这些病毒对于猪场的健康管理至关重要。

传统的检测方法包括病毒分离、病毒血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验等，但这些方法难以准确、高效地检测不同类型的病毒。

因此，研发一种快速、准确、高效的多重PCR检测方法对于猪场中的病毒检测和诊断至关重要。

2. 研究目的和内容本研究旨在建立一种基于多重PCR的病毒检测方法，可以同时检测PRRSV、PCV2和SS2三种病毒。

通过优化PCR反应条件、选择合适的引物和探针，来提高检测的灵敏度和特异性。

同时，对该方法进行初步应用，检测各种可能出现的病毒样本，以评估其应用价值。

具体的研究内容包括：(1) DNA提取和纯化方法，提取和纯化出需要检测的病毒DNA；(2) 多重PCR反应体系和条件的优化，筛选最适合的引物和探针；(3) 建立基于多重PCR的检测方法，并对其进行验证；(4) 对不同来源的样本进行初步的多重PCR检测。

3. 研究方法(1) 样本的收集和处理：收集猪场中可能感染PRRSV、PCV2和SS2的各种病毒样本，如血样和组织样本等，并进行处理和保存；(2) DNA提取和纯化：使用商用试剂盒进行病毒DNA的提取和纯化，检验提取得到的DNA的完整性和质量；(3) 多重PCR反应条件的优化：通过不断尝试调节反应体系等参数，优化多重PCR反应条件，提高检测准确性；(4) 建立检测方法：根据优化后的多重PCR反应条件，建立基于多重PCR的检测方法，并对其进行验证；(5) 样本检测并初步应用：对不同来源的样本进行多重PCR检测，并对检测结果进行统计和分析，以获得初步的有效性评估，了解该方法是否可靠和适用。

SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测.doc

SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测概述：核心摘要:流感(Swineinfluenza，SI)是由流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)引起的一种急性呼吸道传染病，多发生于冬季、早春等气温骤变天气，其特征为突然发热、咳嗽、呼吸困难，鼻中流出分泌物，不分年龄、品种和性别均能感染。

目前已遍布美洲、...流感(Swineinfluenza，SI)是由流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)引起的一种急性呼吸道传染病，多发生于冬季、早春等气温骤变天气，其特征为突然发热、咳嗽、呼吸困难，鼻中流出分泌物，不分年龄、品种和性别均能感染。

目前已遍布美洲、亚洲、欧洲和非洲等世界各地，已成为规模化场的常发传染病。

单纯发流感，发病率高而死亡率较低，只表现为健康状态不佳和生长性能下降，但SIV常与其他病原体的继发或混合感染，使疫情复杂，病情加重，死亡率增高[3]。

SIV 还是呼吸道疾病综合征的主要病原体之一，感染后常发生肺炎，怀孕母感染SIV时，可引起繁殖障碍[4]。

为了解SIV与其他病原体混合感染的情况，在初步诊断的基础上，采用RT-PCR方法，对37份疑似SIV感染样品进行检测，同时还运用RT-PCR和PCR方法，对SIV 阳性样品进行繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、瘟病毒(CSFV)、圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)特异的目的基因片段扩增。

讨论广西南宁市、柳州市、玉林市和海南省的4个流感发病场的发病时间均为2005年3月份，天气骤变，发病突然，病体温升高，食欲下降或废绝，精神[CM21－22]委靡，呼吸急促，呈明显的腹式呼吸或张口呼吸，阵发性咳嗽或打喷嚏，鼻中流出清亮的液体或浓稠的分泌物。

场未接种过SIV、PRRSV和PCV-2。

经剖检，病理变化主要为鼻、喉、气管和支气管黏膜充血，表面有泡沫状黏液；气管内有泡沫；有的心包积液并有出血点；肺部病变不一，有的表现为肺炎、水肿和局部出血，有的出现肉变和坏死灶；淋巴结肿胀；有的肾脏表面有出血点，脾脏边缘有梗死灶。

同时检测CSFV、PRRSV、PRV及PCV2多重荧光定量PCR方法的建立

同时检测CSFV、PRRSV、PRV及PCV2多重荧光定量PCR方法的建立何世成;周其伟;张浩旭;王卫国;鲁信花;唐小明;周玲玲【摘要】为建立可以同时检测猪瘟病毒-(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒-(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的快速、敏感的检测方法,本研究根据GenBank中登录的CSFV、PRRSV、PRV和PCV2 4种病毒的基因序列设计引物和探针,建立了一种能够用于同时检测这4种病毒的多重荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化.结果显示,4种病毒的标准曲线相关系数均达到0.98以上,具有良好的线性关系.对CSFV、PRRSV、PRV和PCV2以外的其他病毒株核酸扩增均呈阴性,具有较强的特异性.灵敏度试验结果显示,该方法对这4种病毒的最低检测量均能达到10拷贝/μL.此外,该检测方法的批内和批间重复性试验变异系数均小于5％,表明所建立的方法具有很好的重复性.利用建立的方法对59例疑似猪繁殖障碍疾病样本进行检测,结果显示,单一病毒感染样本7例,阳性率为11.86％;2种或3种病毒混合感染阳性率为44.07％(26/59);无4种病毒同时感染的样本.以上结果表明所建立的检测方法具有快速、准确、特异性好、灵敏度高等特点,能够对CSFV、PRRSV、PRV和PCV2病毒同时进行检测,可以用于相关疫情的监测及防控.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2015(037)011【总页数】6页(P850-855)【关键词】CSFV;PRRSV;PRV;PCV2;荧光定量PCR【作者】何世成;周其伟;张浩旭;王卫国;鲁信花;唐小明;周玲玲【作者单位】湖南省动物疾病预防控制中心,湖南长沙410007;中山大学达安基因股份有限公司,广东广州510665;中山大学达安基因股份有限公司,广东广州510665;湖南省动物疾病预防控制中心,湖南长沙410007;湖南省动物疾病预防控制中心,湖南长沙410007;湖南省动物疾病预防控制中心,湖南长沙410007;广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司,广东广州510330【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)和猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是4 种主要的引起猪繁殖障碍的传染病病原。

3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用

3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用冯洁;谢建云;胡建华;高诚【摘要】本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56～59℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg2+浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)006【总页数】7页(P1389-1395)【关键词】三重PCR;金黄色葡萄球菌;绿脓杆菌;肺炎克雷伯杆菌【作者】冯洁;谢建云;胡建华;高诚【作者单位】上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203【正文语种】中文【中图分类】Q78实验动物微生物质量控制是评价实验动物质量的重要指标之一，中国实验动物微生物等级及监测标准GB／T14922.2—2011 中明确规定，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae）是无特定病原体级（specific pathogen free，SPF）实验大、小鼠必须检测和排除的项目。

猪伪狂犬病毒、经典型猪瘟、猪流行性腹泻病毒三重PCR 检测方法的建立

试验研究20225246猪伪狂犬病毒、经典型猪瘟、猪流行性腹泻病毒三重PCR 检测方法的建立王颖旺1，陈燕凌2，田志革3，胡晓亮3#（1.宜宾市翠屏区农业农村局，四川宜宾 644000；2.宜宾市动物疫病预防控制中心，四川宜宾 644000；3.宜宾学院农林与食品工程学部/动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室，四川宜宾 644000）摘要：本研究根据GenBank 中的PRV UL27基因、CSFV ORF1基因和PEDV N 基因的保守序列设计1对特异性引物，通过对三重PCR 反应条件的优化，建立快速检测PRV、CSFV 和PEDV 的三重PCR 方法，并对该方法的特异性和敏感性进行验证。

结果表明：引物对PRV、CSFV、PEDV 能进行特异性扩增，目的片段大小分别为401bp、213bp、518bp，三重PCR 方法特异性好，对PRV、CSFV、PEDV 的检测限分别为12pg、0.05pg 、3.5pg。

建立的三重PCR 方法具有特异性强、敏感性较好、快速简便等特点，可用于这三种病毒的同时检测和鉴别诊断。

关键词：猪伪狂犬病毒；经典型猪瘟；猪流行性腹泻病毒；三重PCR中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1003-8655（2022）05-0005-03猪流行性腹泻病毒（PEDV）在小肠上皮细胞中几乎完全复制，导致绒毛萎缩、吸收不良和严重腹泻，引起传染性肠道疾病（呕吐、腹泻和脱水），造成猪严重的精神、食欲状况下降，引起仔猪的高死亡率，成年猪的生长缓慢，并且各种年龄的猪均易感染。

2010年，由PEDV 变种引起的PED 大规模爆发在中国发生，造成了巨大的经济损失[1]。

伪狂犬病病毒（PRV）主要侵害猪的神经系统、呼吸系统和生殖系统，并且破坏猪的免疫系统，导致猪的多重感染，增加其死亡率。

猪是PRV 的天然宿主和重要感染源，可通过猪配种进行生殖系统感染，当妊娠母猪感染后，又通过胎盘进行垂直感染胎儿，严重会造成流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等。