第十三章 基因工程与基因组学

基因组学研究的最终目标


获得生物体全部基因组序列 鉴定所有基因的功能 明确基因之间的相互作用关系 阐明基因组的进化规律
基因组学研究内容 结构基因组学(structural genomics) 功能基因组学(functional genomics) 比较基因组学(comparative genomics)

（二）、外源DNA片段与载体的切割和连接
通过用相同 的限制性核 酸内切酶切 割，连接形 成一个重组 DNA分子
（三）、重组DNA转入宿主细胞
1.重组DNA转入原核细胞


热激转化法 电穿孔转化法 农杆菌转化法
2.重组DNA转入真核细胞

（1）热激转化法
重组DNA
感受态细胞
吸附DNA
冰浴混合、静置
以已知核苷酸序列的DNA片断（序列标签 位点, STS）为“路标”，以碱基对作为基本 测量单位（图距）的基因组图。 用分子生物学的方法直接检测DNA标记在 染色体上的实际位置 DNA上两点的实际距离，即确定基因在染色 体上的实际排列顺序，从而对基因定位。
•限制酶作图 •依靠克隆的基因组作图 •荧光原位杂交 •序列标签位点作图
第13章 基因工程与基因组学概述
第一节 基因工程
一、基因工程概述 二、基因工程工具酶 三、基因工程的流程及相关技术 四、基因工程的发展应用
一、基因工程概述
遗传工程（genetic engineering），也称生 物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生 物体，使其产生新的性状或产品，从而改良 生物体的一种遗传学手段。 核心是利用重组DNA技术，在分子水平上 操作修饰改变生物体遗传结构。 基因工程（gene engineering）：利用人工 的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、 拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿 主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰 或改变的过程。
包括研究基因的表达及其调控模式。
• 基因的识别、鉴定、克隆
•
•
基因结构、功能及其相互关系
基因表达调控的研究
主要具体内容包括以下方面:
（一）鉴定DNA序列中的基因 ORF （二）同源搜索设计基因功能
（三）实验性设计基因功能
clon,knock-out,knock-in,反义RNA,RNAi
（四）描述基因表达模式
2.差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）
差别显示分析基本流程
3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因
（1）套式PCR （2）反向PCR （3）不对称PCR （4）锚定PCR （5）长程PCR （6）反转录PCR
4、 人工合成基因

根据已知的基因序列，或根据氨基酸序 列推测DNA序列 将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成 DNA的方法结合起来，可以很快地人工合 成基因。
结构基因组学（structural genomics）
基因定位
基因组作图 测定核苷酸序列
二、基因组图谱的构建
基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱
• • • •
遗传图（连锁图） 物理图 转录图 序列图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.遗传图
连锁图(linkage map)，采用遗传分析的方法 将基因/DNA标定在染色体上。即指基因标记在
功能基因组学研究策略及主要内容
1、计算机预测基因功能----同源性比较（种间、种内） 2、实验确认基因功能---基因克隆 // 基因敲除（knock-out）// 基因的超 表达 // 反义RNA技术 // RNAi // 转座子插入突变
外源DNA片段与载体连接（接）
重组DNA分子转入宿主细胞（转） 重组子的筛选与鉴定（筛）
目的基因的确认与分析
（一）外源DNA片段的分离方法
链式反因组全部遗传信息储存 于一个片段 •将所有片段分别连接到载体 上，构成一个重组DNA群体 •这个群体包含全基因组的遗 传信息。保存、筛选
第二节
基因组学
一、基因组学概述 二、基因组图谱的构建 三、基因组图谱的应用 四、后基因组学
一、基因组学概念及范畴
基因组(genome)
泛指一个有生命体 、病毒
或细胞器的全部遗传物质；在 真核生物，基因组是指一套染 色体（单倍体）DNA。
基因组学(genomics)
就是发展和应用DNA制图、
测序新技术以及计算机程序， 分析生命体（包括人类）全部 基因组结构及功能。
这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。
鸟枪法（shotgun sequencing）
克隆重叠群法（clone contig）
将基因组DNA切割长度为0.1Mb－1Mb的 大片段，克隆到YAC或BAC载体上 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克 隆的序列 再装配、连接成连续的DNA分子。 这是一种自上而下（up to down）的测 序策略 clone-by-clone method
2000年是基因组之年，完成了人类基 因组的工作框架图，完成了一系列模式生 物和微生物的基因组序列分析。
2000 年 12 月美、英等国 科学家宣布绘出拟南芥基因组的 完整图谱，这是人类首次全部破 译出一种植物的基因序列。
三、后基因组学（postgenomics)
完成一个生物体全部基因组测序后即进入功 能基因组学阶段，也称后基因组阶段——详 尽分析序列，描述基因组所有基因的功能，
染色体上的遗传距离，即确定各基因在基因组
中的相对位置和排列顺序。 遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交 换过程中分离的频率厘摩（cM）来表示。
遗传标记（Genetic marker）指可识别的等位基因。 它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生
物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
摄入DNA 42º C 热激
扩培
转化液涂含抗 菌素的平板
加入培养基
（2）电穿孔转化法
感受态细胞
电转仪调为
质粒DNA
混合
2.5kV 25F
脉冲控制器
200-400
加入培养液
涂板
37 ℃中速震荡
2.重组DNA转入植物细胞
农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
（四）重组子的筛选与鉴定
1.插入抗性失活 2.蓝白斑筛选 3.核酸杂交 4.PCR检测 5.测序 6.生物学活性检测
二、基因工程的工具酶



内切核酸酶(endonuclease) DNA连接酶(ligase) DNA聚合酶（DNA polymerase） RNA聚合酶（RNA polymerase） 反转录酶（reverse transcriptase）
最重要的工具酶是限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease），也称限制性酶 (restriction enzyme), 能识别双链DNA分子中一 段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA 分子切断。
1.抗性插入失活筛选法
蓝白斑筛选重组质粒
无插入片段的载体和受 体菌α -互补产生LacZ， IPTG诱导下，生色底物 X-Gal产生蓝色菌落； 当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，导致不 能α -互补，使带有重组 质粒的细菌形成白色菌 落。
四、基因工程的发展应用
1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段
（ 一 ） 限 制 性 核 酸 内 切 酶
Eco R Ⅰ
属名 种名 菌株名 序号
常 见 内 切 酶
（二） DNA连接酶
连接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二 酯键，封闭DNA双链上的缺刻。 如： E· coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶

载体(vector)
将外源DNA片段运送进宿主细胞(host
国际人类基因组测序协作组（公共计划组） 由6个国家、20个研究中心的2000多位科学工 作者组成。
国家
美国
英国 日本 法国 德国
承担的测序任务
54%
33% 7% 2.8% 2.2%
中国
1%
1999年9月 中国获准加入人类基因组 计划，负责测定人类基因组全部序列的1%， 负责第3号染色体3千万核苷酸的序列测定 工作。中国是继美、英、日、德、法之后 第6个国际人类基因组计划参与者，也是参 与这一计划的唯一发展中国家。
①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我 复制，而且能带动外源DNA一起复制。 ②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源 DNA 片段。 ③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限 制酶来说只能有一个。 ④具有一个选择标记基因。
三、基因工程的流程及相关技术
获得外源DNA片段（分） 限制性内切酶切割外源DNA片段与载体（切）
2、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并 在生产上应用 3、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药 物
4、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递 提供了可能。 转基因动植物--“生物工厂” 5、疾病诊断与基因治疗 6、环境保护
4. 利用基因工程改良动物
推荐几本参考书：
1、《基因工程原理与方法》，孙树汉编， 人民军医出版社 2、《基因工程原理》，吴乃虎编，科学出 版社（侧重原理） 3、《现代基因工程技术导论》，陈章良编， 科学出版社（侧重应用） 4、《分子克隆》(第三版)，J. Sambrook et al. 科学出版社（具体的实验方法，分 子生物学研究的圣经）
cell)进行扩增或表达的运载工具称 为载体。

载体也是DNA分子。


常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。
经改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid) 都要经过人工改造。

细菌人工染色体（BAC）、酵母菌人工染 色体（YAC）和人类人工染色体（HAC）
λ噬菌体 载体
YAC（1Mb）
载体的基本条件