最新分子生物讲义：第四章 基因克隆-药学医学精品资料
合集下载
4.第四章 基因克隆
—扩增——保存
筛选方法： PCR扩增 原位杂交
免疫组化
PCR筛选
1,2,8交筛选
杂 交纤 维 素 膜克隆转 膜 挑克隆免 疫 检 测
免疫检测挑选
2.利用基因组信息进行基因克隆
（1）信息分析
ggcgacttca actcgctcac gacagggtcg gtcaccagag cagcgggcgg gactggctgg gcgggggcgc atgggcagcg gaccccgcca ctggtggtgc cccgtggacc gcggggggca atccccgatt caccgaaggt ttcatttaga ccccactacc aagaaaaaca ccctaagcgc acttcatgac gtcac，目的是获 得染色体DNA序列。克隆成。用于克隆cDNA,cDNA序列没有内含子，没 有调控NA—— 酶切——重组——转化——扩增——保存
第四章 基因克隆
基因工程就是利用基因，进行重组，导 入新的宿主细胞进行表达。那么，基因工 程的基础是获得基因，没有基因，基因工 程就无从谈起。所以，克隆基因是基因工 程最基本的，也是最重要的技术。 这里所介绍的克隆仅仅是获得基因全长 序列。有时只是指的编码序列。当然有时 将克隆过程与表达体系构建过程结合起来 一并进行。
PCR扩增时，如果序列在3Kb以下， 可直接PCR扩增全长，如果序列长于 3Kb，就需要分几段，分别扩增以后， 用酶切的方法连接起来。或用PCR的方 法连接。 重组：可直接利用PCR产物直接克 隆到T-vector上，也可以用酶切连接。 酶切连接必须在两端加上接头。
筛选：筛选到有插入子的序列就成功
了。筛选出需要的序列后要进行序列分析， 最终确定是所需要的基因序列。重组克隆筛选二、未知 Nhomakorabea因的克隆
筛选方法： PCR扩增 原位杂交
免疫组化
PCR筛选
1,2,8交筛选
杂 交纤 维 素 膜克隆转 膜 挑克隆免 疫 检 测
免疫检测挑选
2.利用基因组信息进行基因克隆
（1）信息分析
ggcgacttca actcgctcac gacagggtcg gtcaccagag cagcgggcgg gactggctgg gcgggggcgc atgggcagcg gaccccgcca ctggtggtgc cccgtggacc gcggggggca atccccgatt caccgaaggt ttcatttaga ccccactacc aagaaaaaca ccctaagcgc acttcatgac gtcac，目的是获 得染色体DNA序列。克隆成。用于克隆cDNA,cDNA序列没有内含子，没 有调控NA—— 酶切——重组——转化——扩增——保存
第四章 基因克隆
基因工程就是利用基因，进行重组，导 入新的宿主细胞进行表达。那么，基因工 程的基础是获得基因，没有基因，基因工 程就无从谈起。所以，克隆基因是基因工 程最基本的，也是最重要的技术。 这里所介绍的克隆仅仅是获得基因全长 序列。有时只是指的编码序列。当然有时 将克隆过程与表达体系构建过程结合起来 一并进行。
PCR扩增时，如果序列在3Kb以下， 可直接PCR扩增全长，如果序列长于 3Kb，就需要分几段，分别扩增以后， 用酶切的方法连接起来。或用PCR的方 法连接。 重组：可直接利用PCR产物直接克 隆到T-vector上，也可以用酶切连接。 酶切连接必须在两端加上接头。
筛选：筛选到有插入子的序列就成功
了。筛选出需要的序列后要进行序列分析， 最终确定是所需要的基因序列。重组克隆筛选二、未知 Nhomakorabea因的克隆
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因克隆PPT课件
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
分子生物学 基因克隆
LOGO
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口 （blunt end）
G +GATCC
CCTAG
G
黏端切口 （sticky end）LOGO
粘性末端又可分为两种：
1）5-端突出
5 ………GAATTC………3 3 …… CTTAAG……… 5
EcoRI
5………GOH
5- AATTC……. 3
3………CTTAA -5
LOGO
用带有标记的、已知序列的核酸片段 (单链 RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA
样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中 是否有与探针序列同源的目标序列，以及目 标序列的量。
LOGO
转膜、 变性、 封闭、 加入变性的探针、 杂交、 洗涤、 检测杂交体。
LOGO
如何实现特异性的获得目的基因？
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从5’到3’方向的核苷酸序列完全一致
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端
HindⅡ
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口 （blunt end）
G +GATCC
CCTAG
G
黏端切口 （sticky end）LOGO
粘性末端又可分为两种：
1）5-端突出
5 ………GAATTC………3 3 …… CTTAAG……… 5
EcoRI
5………GOH
5- AATTC……. 3
3………CTTAA -5
LOGO
用带有标记的、已知序列的核酸片段 (单链 RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA
样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中 是否有与探针序列同源的目标序列，以及目 标序列的量。
LOGO
转膜、 变性、 封闭、 加入变性的探针、 杂交、 洗涤、 检测杂交体。
LOGO
如何实现特异性的获得目的基因？
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从5’到3’方向的核苷酸序列完全一致
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端
HindⅡ
4.基因克隆200809
随机引物引导的cDNA合成： 采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段 作为合成第一链cDNA的引物。 cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生。 对于特长的mRNA分子中靠近5’-端的序列， 应用此方法较为容易得到克隆。
合成第二链cDNA
双链 cDNA 克隆进载体
基因芯片相关技术
硬件：
序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预 合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相 应设备（作光引导原位合成）。 激光共聚焦显微扫描设备：激光共聚焦显微镜 或相应设备，以采集高密度点阵杂交信号的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体 载体并导入宿主中繁殖。
细胞总RNA的分离
mRNA分子3’末端均含有一段polyA尾巴 一段oligo(dT)能够同惰性物质如纤维素或 琼脂糖结合。当细胞总RNA制剂通过已用 oligo(dT)处理过的纤维素柱时，mRNA分子 的poly A尾巴便会同oligo(dT)序列杂交而 粘附到柱子上。 用不同离子浓度的缓冲液进行洗脱，即可 分离得到mRNA。
分子克隆
Molecular Cloning
分子克隆
基本概念:
DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作， 因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因 克隆。 基本概念: 分子克隆：是在体外对 DNA 分子按照既定的目的和 方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体 细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得 DNA 分 子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过 程
稀少mRNA的cDNA克隆
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
分子生物学第四章复制精选文档
由于复制时产生的滚环结 构形状象σ，又称σ复制
病毒、细菌因子
第三节 DNA复制的酶学 (Enzymology of DNA Replication)
一、DNA聚合反应和聚合酶
1957 Arthur Kornberg 首次发现 DNApolⅠ
DNApol Ⅱ
DNApol Ⅲ
（E.coli）
聚合反应： 底物－－dNTP
（1） 从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式 （ replication fork ）
比较形象的－－θ 复制 双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像 希腊字母θ，因而叫….
A replication eye forms a theta structure in circular DNA.
1958 Meselson-stahl 设计的CsCl超离心试验证实了 DNA复制的这一特性
15N 标记 DNA
N
15
标 记 实 验
CsCL密度梯度离心 浮力密度
N15－DNA
1.742g/ml
N15－N14－DNA 1.717g/ml
N14－DNA
1.710g/ml
·细胞生长在15N 标记培养基中 · 转入正常N源培养基中 · 分离各代DNA · 分析各代DNA的浮力密度
分子生物学第四章复制
第一节 基本概念 第二节 复制概况 第三节 DNA复制的酶学 第四节 DNA复制的半不连续性 第五节 原核生物DNA复制（E.coli） 第六节 真核生物DNA复制
第一节 基 本 概 念 ( Basic Concept )
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以 各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完 全相同的子代DNA分子的过程。
病毒、细菌因子
第三节 DNA复制的酶学 (Enzymology of DNA Replication)
一、DNA聚合反应和聚合酶
1957 Arthur Kornberg 首次发现 DNApolⅠ
DNApol Ⅱ
DNApol Ⅲ
（E.coli）
聚合反应： 底物－－dNTP
（1） 从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式 （ replication fork ）
比较形象的－－θ 复制 双链环状DNA的复制眼可以形成一种θ结构，形状像 希腊字母θ，因而叫….
A replication eye forms a theta structure in circular DNA.
1958 Meselson-stahl 设计的CsCl超离心试验证实了 DNA复制的这一特性
15N 标记 DNA
N
15
标 记 实 验
CsCL密度梯度离心 浮力密度
N15－DNA
1.742g/ml
N15－N14－DNA 1.717g/ml
N14－DNA
1.710g/ml
·细胞生长在15N 标记培养基中 · 转入正常N源培养基中 · 分离各代DNA · 分析各代DNA的浮力密度
分子生物学第四章复制
第一节 基本概念 第二节 复制概况 第三节 DNA复制的酶学 第四节 DNA复制的半不连续性 第五节 原核生物DNA复制（E.coli） 第六节 真核生物DNA复制
第一节 基 本 概 念 ( Basic Concept )
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以 各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完 全相同的子代DNA分子的过程。
基因工程第四章 目的基因的克隆
重组表达质粒
• 比起其它公司的原核表达系列来说Invitrogen有个非常突出的地方就是它 的重组克隆技术。像之前Novagen大部分载体都是用传统的酶切、链接 方式做重组质粒，但是Invitrogen的表达系统大量运用了它的TOPO技术和 Gateway技术。
• 定向TOPO克隆完全不需要酶切和传统连接反应，五分钟就可以做出一个 克隆。以前，用T载最苦恼的问题就是无法定向将PCR片断插入到载体中， 现在Invitrogen已经克服了这个问题。在载体上多加四个碱基GTGG，就 是这四个碱基使它可以与PCR产物定向连接。
平头末端直接与载体连接 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组
分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口
cDNA法分离目的基因的基本程序
完备分离程序
提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找 到目的重组子。
筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表 达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选
目的基因
5‘ 5‘
变性
加热
5‘
退火
5‘
5‘ 聚合
5‘ 5‘
变性
5‘
引物
5‘
5‘
底物
5‘
5‘
‘
5‘
退火 引物
5‘
5‘ 5‘
聚合
5‘
5‘ 退火
5‘
5‘
变性
5‘
5‘
聚合
5‘
5‘
5‘ 5‘
底物
5‘
5‘
引物
5‘
5‘
加热
5‘ 5‘
底物
5‘
4目的基因的克隆2
得较好的效果。பைடு நூலகம்
（2）引物
a．引物设计的一般原则：
PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16bp以上，一般以20—30个bp 为宜。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列。 引物中GC含量应占到45％一55％左右。 应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3'端不应有互 补结构。 引物3'端应与目的片段完全配匹，而其5'端碱基可不与模板完全 配匹，故可在引物5，端引入限制酶切位点。
L Tris-HCl(pH8.3室温下)，1.5 mmol／L MgCl2。
缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，其中Mg2+优于Mn2+，而Ca2+ 则无效，Mg2+的浓度对反应的特异性和PCR产率影响最大，其最佳 作用浓度1.5mmol／L。因此，所制备的模板DNA中不应含有高浓度 的螯合剂，如EDTA，也不应有高浓度的负电荷离DNA（comp成cDNA，与载 体连接并转化大肠杆菌的过程。 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种 类不同（即基因pp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTTp 5’ Klenow dNTPs
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
四、常用的标准cDNA克隆构建操作：
℃ ，3—10min；循环过程中变性
在适宜退火温度下，退火时间30s已足以使引物与模板之间的结
合。 在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可提高PCR反应的特异
性。
延伸的时间和温度：
PCR反应的延伸一般在70～75℃之间进行，在此温度范围内耐热的 DNA聚合酶处于最高的活力状态；在72℃时，DNA聚合酶的反应速率
生物ppt课件克隆
克隆技术的实现需要深入理解 细胞分裂、胚胎发育和核质互 作等生物学过程，以及掌握相 关的实验技术。
03
CHAPTER
克隆技术的生物学意义
对生物多样性的影响
生物多样性是地球上生命经过亿万年进化的结果，包含了物 种内、物种间以及生态系统的多样性。克隆技术可能会导致 生物多样性的减少，因为它可能导致物种的基因库单一化， 降低物种的遗传多样性。
克隆技术可以用于保护和恢复濒危物种，通过克隆技术可以 保存和繁殖具有重要价值的基因库，从而保护生物多样性。
对生物进化的影响
生物进化是物种在适应环境变化的过程中不断演变的过程 ，而克隆技术可能会对生物进化产生影响。由于克隆技术 可以快速繁殖具有优良性状的个体，这可能会导致某些物 种的进化速度减缓甚至停滞。
克隆植物
快速繁殖
通过克隆技术，可以快速繁殖出 大量植物，用于园艺、林业和农 业等领域，提高植物资源的利用
效率。
遗传改良
克隆植物可用于遗传改良，通过 基因编辑等技术，培育出具有优
良性状的植物新品种。
生态恢复
克隆技术可用于生态恢复工程， 快速繁殖出濒危植物和受损生态 系统所需的植物种类，促进生态
系统的恢复和重建。
育成为成熟的个体。
克隆动物的出生通常需要采用胚 胎移植技术，将人工胚胎转移到 代孕母体中，使其完成妊娠过程
。
克隆技术的科学原理
克隆技术的科学原理基于细胞 的全能性，即一个细胞具有发 育成完整个体的全部遗传信息 。
通过将供体细胞的细胞核移植 到受体细胞中，科学家可以重 新编程受体细胞，使其发育成 一个全新的个体。
克隆技术的潜在风险与挑战
伦理道德问题
克隆技术涉及到人类生命 的起源和尊严，引发了伦 理道德方面的争议和挑战 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（1） 反应
活性
反应
模板/引物或底物
Mg2+
DNAOH + ndNTP
DNA-(pdN)n + nPPi
5’→3’ 聚合酶
例：
单链模板； dATP 带3’-OH的引物5…’ pC-pC-pG
+ dCTP
… Gp-Gp-Cp-Tp-Ap-Tp-Cp-Gp-Ap dGTP
TTP Mg2+
5…’ pC-pC-pG-pA-pT-pA-pG-pC-pT … 3’ 3’… Gp-Gp-Cp-Tp-Ap-Tp-Cp-Gp-Ap … 5’
EcoRⅠ* N A A T T N N T TAA N
（五）. 用途与注意事项
（1） 用途
① 制作 DNA 物理图谱 ② DNA 限制性酶切片段长度多态性
（RFLP)分析 ③ 基因克隆及亚克隆 ④ DNA 杂交与序列分析 ⑤ 基因同源性研究 ⑥ 其它
（2） 注意事项
① －20 0C保存，取出后仅短时间置冰浴中。 ② 含Mg2+的 Tris-HCl 缓冲体系，含二硫苏糖醇
BamHⅠ
Escheria Coli R Y13
GAATTC G
大肠杆菌 EcoRⅠ CTTAAG CTTAA-5’
Haemophilus influenzae Rf
AAGCTT A
流感嗜血杆菌 Hind Ⅲ TTCGAA TTCGA-5’ HsuⅠ
Haemophilus influenzae Rf
GANTC G
流感嗜血杆菌 HinfⅠ CTNAG CTNA-5’ FnuAⅠ
Providencia stuartii 164
CTGCAG CTGCA-3’
普罗威奇登菌 PstⅠ GACGTC G
Sal pⅠ
Streptomyces albus G
GTCGAC G
白色链霉菌 Sal Ⅰ CAGCTG CAGCT-3’
部分限制性内切酶特性
微生物名称 酶名称 识别序列 产生的末端 同裂酶 同尾酶
Bacillus amyloliquefaciens H
GGATCC G
BglⅡMboⅠ
解淀粉芽孢杆菌 BamHⅠCCTAGG CCTAG-5’ BstⅠ Sau3A XhoⅡ
Bacillus globigil
球芽孢杆菌
AGATCT A BglⅡ TCTAGA TCTAG-5’
（2） 同尾酶
此类酶来源不同，但识别序列与切割顺序具有相 关性，一些酶的识别顺序包含在另一些酶识别顺序之中， 它们作用后能产生相同或相似的粘性末端。
GATC MboⅠ C T A G
G GAT C Sam 3A C C T A G
G GAT C C BamHⅠ C C T A G G
BglⅡ
AGATCT TCTAGA
SalⅠ
G C
T A
C G
G C
A T
C G
XboⅠ C T C G A G GAGCTC
-G -C A G C T
T C G A GC-
连接酶
-G T C G A G-C A G C T C-
（3） 远距离裂解酶
酶识别序列与切割位点不一致，但其切割距离 是一定的。
MboⅡ
GAAGA C T TCT
或巯基乙醇。 高盐（含 100 mmol/L NaCl ) 中盐（含 50 mmol/L NaCl ) 低盐（含 0~10 mmol/L NaCl )
③ DNA 溶液不能含有酚、氯仿、乙醚、过量的 EDTA 、SDS等。
④ 通常加入5~10倍过量的酶。 ⑤ 酶的活性单位为：1小时内在50ul容积中使
3’
3’
3’
dATP
5’
dCTP 大肠杆菌DNA聚
dGTP 合酶Ⅰ（全酶）
［α- 32P］dTTP
5’
*T *T
3’
3’
5’
5’
*T *T
*T *T 3’
3’
5’
2. Klenow
枯草杆菌蛋白酶 DNA聚合酶 Ⅰ
N 端小片段 具5’→3’外切酶活性 M=36,000
C 端大片段（Klenow） 保留 5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 M=76,000
3’→5’ 核酸酶
dsDNA ssDNA
AuaⅠXhoⅡ
（四） 特殊性质的限制性核酸内切酶
（1）同裂酶（异源同工酶）
来源于不同的微生物，具有相同识别顺序但切割 位点可以相同，也可以不同的限制性核酸内切酶。
HpaⅡ及 MspⅠ C C G G GGCC
SmaⅠ C C C G G G GGGCCC
XmaⅠ C C C G G G GGGCCC
最新分子生物讲义：第四章 基 因克隆-药学医学精品资料
基本概念
克隆:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 DNA克隆:
– 应用酶学的方法 – 体外进行 – 目的基因(各种来源的遗传物质)与载体DNA结合 – 将结合体转化/转染宿主细胞，筛选出含有目的基
因的细胞
– 扩增阳性转化细胞，提取目的基因，获取目的基 因的大量拷贝
基因工程
• 实现基因克隆所采用的方法及相关的 工作
第一节 基因克隆中常用的工具酶
⑵ 切口特征
切口为平端 如 Alu Ⅰ
AGCT TCGA
5’突出的粘端 如 BamH Ⅰ
G GAT C C C C TAG G
3’突出的粘端 如 Sac Ⅰ
GAGCTC CTCGAG
⑶ 酶解后
5’-末端带磷酸基团 3’-末端带羟基
1ugλDNA降解的酶量
二. DNA聚合酶
DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Klenow
Tag DNA聚合酶
1. DNA聚合酶Ⅰ
（1）活性
5’ 3’DNA聚合酶活性 3’ 5’外切酶活性 5’ 3’外切酶活性
（2）用途：经缺口平移标记DNA探针
5’
3’
Mg2+ DNA酶Ⅰ
5’
3’ 5’
5’
双链DNA
5’-G G A T C C -3’ BamH Ⅰ 5’-G
＋ pGATCC-3’
3’-C C T A G G -5’
3’-CCTAGp
G-5’
⑷ 酶切割机率 若DNA链碱基呈随机分布,则：
识别4bp序列的酶 44=265 bp 识别6bp序列的酶 46=4096 bp 识别8bp序列的酶 48=65536 bp
切点在下游 8 bp 处
（4） 可变酶
酶的识别序列一般大于 6 bp ,其中有一个或几个 核苷酸是可变的。
Dra Ⅲ
CAC NNN GTG GTG NNN CAC
（5） 星号活力
限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，酶可 切割一些与其特异识别序列类似的序列，以*号表示。
EcoRⅠ G A A T T C C T TAA G