一步法MGB荧光定量RT_PCR_省略_毒扎伊尔亚型和苏丹亚型方法的建立_刘阳

２０１２，２８（４）中国人兽共患病学报Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｏｏｎｏｓｅｓ文章编号：１００２－２６９４（２０１２）０４－０３４３－０４一步法ＭＧＢ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测埃博拉病毒扎伊尔亚型和苏丹亚型方法的建立＊刘　阳１，２，史子学１，王水明３，刘学辉３，马玉堃２，马志永１摘　要：目的　为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒（ＥＢＯＶ）亚型的方法。

方法　本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的ＥＢＯＶ　ＮＰ基因序列，设计引物和ＭＧＢ探针，通过优化反应条件，建立了一种检测ＥＢＯＶ扎伊尔亚型和苏丹亚型的一步法ＭＧＢ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法。

结果　以体外转录的ＥＢＯＶ　ＲＮＡ为模板进行试验，该方法检测的灵敏度可以达到１．０×１０３个拷贝／μＬ，检测范围达到８个数量级为１０３～１０１０。

建立的方法对马尔堡病毒（ＭＡＲＶ）、登革病毒（ＤＥＮＶ）、新疆出血热病毒（ＸＨＦＶ）、乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）、流感病毒（Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２）和猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｅ基因组ＲＮＡ无非特异性扩增。

结论　本文将荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技术用于埃博拉病毒的定量检测中，并且建立了ＥＢＯＶ扎伊尔亚型和苏丹亚型荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，具有一定的创新性。

该方法的建立对加快我国ＥＢＯＶ诊断技术的研究具有重要推动作用。

关键词：埃博拉病毒；荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ；ＭＧＢ探针；检测 中图分类号：Ｓ８５５．３　文献标识码：Ａ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｎｅ　ｓｔｅｐ　ＭＧＢ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｂｏｌａ　ｖｉｒｕｓ　Ｚａｉｒｅ　ａｎｄ　Ｓｕｄａｎ　ｓｕｂｔｙｐｅｓＬＩＵ　Ｙａｎｇ，ＳＨＩ　Ｚｉ－ｘｕｅ，ＷＡＮＧ　Ｓｈｕｉ－ｍｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｘｕｅ－ｈｕｉ，ＭＡ　Ｙｕ－ｋｕｎ，ＭＡ　Ｚｈｉ－ｙｏｎｇ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４１，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｂｏｌａ　ｖｉｒｕｓ（ＥＢＯＶ）ｓｕｂｔｙｐｅｓ，ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓａｎｄ　ＭＧＢ　ｐｒｏｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＭＧＢ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＥＢＯＶ　ＮＰ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ．Ｏｎｅ　ｓｔｅｐ　ＭＧＢ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｔｈａｔ　ｄｅｔｅｃｔｓ　Ｚａｉｒｅ　ａｎｄ　Ｓｕｄａｎ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＥＢＯＶ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ＴｈｅＥＢＯＶ　ＲＮＡ　ｔｈａｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｒｅａｃｈ　１．０×１０３ｃｏｐｉｅｓ／μＬ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ　ｗａｓ　１０３－１０１０．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　ＲＮＡ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｍａｒｂｕｒｇ　ｖｉｒｕｓ（ＭＡＲＶ），Ｄｅｎｇｕｅ　ｖｉｒｕｓ（ＤＥＮＶ），Ｘｉｎｊｉａｎｇ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ（ＸＨＦＶ），Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ（ＪＥＶ），Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ（Ｈ１Ｎ１ａｎｄ　Ｈ３Ｎ２）ａｎｄ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｖｉｒｕｓ　Ｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ．Ｉｔ　ｈａｓ　ｓｏｍｅ　ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ＥＢＯＶ　ｗｉｔｈ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　Ｏｎｅ　ｓｔｅｐ　ＭＧＢ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ　Ｚａｉｒｅ　ａｎｄ　Ｓｕｄａｎ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＢＯＶ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ． ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｅｂｏｌａ　ｖｉｒｕｓ；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ；ＭＧＢ　ｐｒｏｂｅ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ＊江苏出入境检验检疫局科研项目（２０１１ＫＪ０３）通讯作者：马志永，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｙｏｎｇｍａ＠ｓｈｖｒｉ．ａｃ．ｃｎ作者单位：１．中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生研究室，上海　２００２４１；２．黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨　１５００８０；３．南京出入境检验检疫局，南京　２１１１３６ 埃博拉出血热（Ｅｂｏｌａ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｆｅｖｅｒ，ＥＨＦ）是由埃博拉病毒Ｅｂｏｌａ　ｖｉｒｕｓ（ＥＢＯＶ）引起的主要以人和非人类灵长类动物为易感动物的急性出血性传染病。

该病１９７６年首次发生于埃博拉河流域的刚果民主共和国（前扎伊尔）［１］，因感染者全身呈出血症状，故命名为埃博拉出血热。

据推测最初人类感染ＥＢＯＶ主要是因为人类接触感染了病毒的动物宿主，而人与人之间传播主要通过直接接触［１－３］。

ＥＢＯＶ的潜伏期为２～２１ｄ，病毒感染者会出现发热症状。

ＥＨＦ的主要特征是迅速发热，寒冷，头痛和肌肉疼痛，之后会产生咽喉肿痛，恶心，呕吐，腹泻以及腹痛［１－２，４］。

大约一半的病人会出现出血症状，例如鼻孔出血，出现血尿或者是胃肠出血和阴道出血［４－５］。

ＥＨＦ目前主要呈现地方性流行，绝３４３中国人兽共患病学报２０１２，２８（４）大部分集中于非洲。

非洲以外地区偶有病例报道，均属于输入性或实验室意外感染，未发现有ＥＨＦ流行。

ＥＢＯＶ已经被证实是通过体液传播的，如口腔和结膜接触传播，这在非人灵长类动物试验已确证。

自然界的动物各种行为和其它因素都有可能造成ＥＢＯＶ的爆发［６］。

我国目前尚未有ＥＢＯＶ，为了防止ＥＢＯＶ进入我国，急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。

ＥＨＦ的病原是ＥＢＯＶ，属于丝状病毒科（Ｆｉｌｏｖ－ｉｒｉｄａｅ）丝状病毒属（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）成员，是非分节段的单股负链ＲＮＡ病毒［１］。

目前已鉴定的埃博拉病毒有５种亚型，分别是：ＥＢＯＶ－扎伊尔型（Ｅｂｏｌａ－Ｚａｉｒｅ，简称ＥＢＯＶ－Ｚ），ＥＢＯＶ－苏丹型（Ｅｂｏｌａ－Ｓｕｄａｎ，简称ＥＢＯＶ－Ｓ），ＥＢＯＶ－本迪布焦型（Ｅｂｏｌａ－Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ，简称ＥＢＯＶ－Ｂ），ＥＢＯＶ－科特迪瓦型（Ｅｂｏｌａ－ＩｖｏｒｙＣｏａｓｔ，简称ＥＢＯＶ－Ｃ），ＥＢＯＶ－莱斯顿型（Ｅｂｏｌａ－Ｒｅ－ｓｔｏｎ，简称ＥＢＯＶ－Ｒ）［２］。

感染ＥＢＯＶ－Ｚ，ＥＢＯＶ－Ｓ和ＥＢＯＶ－Ｂ的致死率大约在２５％～９０％［７］。

目前，ＥＨＦ大爆发几乎都是由ＥＢＯＶ－Ｚ和ＥＢＯＶ－Ｓ引起的。

这两种亚型所造成的死亡人数占由ＥＢＯＶ所造成的死亡人数９８％以上，所以对Ｚ／Ｓ两种亚型的检测方法建立成为ＥＢＯＶ防控的重点。

目前国外已经建立了多种ＥＢＯＶ的检测方法，比如ＩｇＧ－捕获ＥＬＩＳＡ和ＩｇＭ－捕获ＥＬＩＳＡ是ＥＢ－ＯＶ流行病学调查的常用方法［８］，而我国尚没有建立检测ＥＢＯＶ的方法。

荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ具有快速、敏感和高通量的特点，已作为多种病毒的检测方法，建立一种敏感、特异的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＥＢＯＶ的防控具有重要的实践意义。

因此，我们将荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技术用于埃博拉病毒的定量检测中，研究建立了敏感、特异的ＥＢＯＶ病毒Ｚ／Ｓ亚型荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法检测方法。

１　材料与方法１．１　材料１．１．１　病毒ＮＰ基因的合成　ＥＢＯＶ　５种亚型ｃＤ－ＮＡ，ＭＡＲＶ、ＤＥＮＶ、ＸＨＦＶ　ｃＤＮＡ由金思特科技（南京）有限公司合成。

１．１．２　主要仪器和试剂　荧光定量ＰＣＲ仪是Ｍａｃｔｅｒｃｙｃｌｅｒ　ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｒｅａｌｐｌｅｘ　４。

常规分子生物学试剂均购自宝生物（大连）工程有限公司。

１．２　方法１．２．１　引物和探针合成　参考ＧｅｎＢａｎｋ上已公布的２０条ＥＢＯＶ　ＮＰ基因序列，用Ｐｒｉｍｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ２．０设计合成了两对引物和两条探针序列，这些序列能特异性和ＥＢＯＶ－Ｓ和ＥＢＯＶ－Ｚ相应序列结合，而与ＭＡＲＶ　ＮＰ基因序列同源性低于５０％。

１．２．２　体外转录制备病毒基因ＲＮＡ　分别合成扩增ＥＢＯＶ五种亚型、ＭＡＲＶ、ＤＥＮＶ、ＸＨＦＶ的特异性引物，引物５’端加入Ｔ７启动子，扩增区域为超过荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ扩增片段。

利用Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｔ７ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ系统转录，经ＤＮＡ酶消化得到病毒单链基因组ＲＮＡ。

ＲＮＡ产物经纯化、浓度测定，根据转录ＲＮＡ分子量计算拷贝数后分装，－８０℃保存。

１．２．３　体系和反应条件优化　分别对荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的Ｍｇ２＋、引物和探针浓度、反应退火温度进行优化，根据反应扩增曲线和Ｃｔ值的大小确定最佳退火温度。

１．２．４　敏感性试验　用建立好的一步法ＭＧＢ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＥＢＯＶ－Ｓ和ＥＢＯＶ－Ｚ进行敏感性试验。

用ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄＨ２Ｏ对一步法ＭＧＢ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ标准模板进行１０×系列稀释，分别用建立好的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测。

同时以ＥＢＯＶ套式ＲＴ－ＰＣＲ方法进行验证，引物序列分别为：外套（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＡＴＧＣＣＢＧＡＡＧＡＧ－ＧＡＧＡＣＡＡＣ－３’，Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ；Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＧＡＡＲＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＧＴＧＴＣＣ－３’，Ｒ＝Ａ／Ｇ），内套（Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＭＴＴＴＧＣ－３’，Ｍ＝Ａ／Ｃ；Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＷＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴＧ－３’，Ｗ＝Ａ／Ｔ）。

外套扩增产物１９６ｂｐ，内套扩增产物１３９ｂｐ。

１．２．５　特异性试验　用建立的一步法ＭＧＢ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法对（ＥＢＯＶＢ／Ｃ／Ｒ亚型、ＭＡＲＶ、ＤＥＮＶ、ＸＨＦＶ）病毒体外转录ＲＮＡ，细胞毒（ＪＥＶＳＡ１４－１４－２、ＰＲＲＳＶ　ＪＸ１４３、Ｈ１Ｎ１（ＰＲ８）和Ｈ３Ｎ２Ｈｅｎａｎ／Ｓ４／０１）进行检测，验证是否有非特异性扩增。