聚合酶链式反应技术及应用
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
PCR技术的过程和意义
PCR技术的过程和意义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种用于扩增DNA序列的方法，广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪学和古生物学等领域。
它被称为生物技术领域的“革命性技术”，因为它能以非常快的速度在体外扩增目标DNA序列，从而大大提高了检测效率和灵敏度。
第一步是变性，通过升温将DNA样本中的双链DNA分离成单链DNA。
正常情况下，双链DNA是稳定的，但当温度升高至95℃时，DNA的氢键会断裂，使双链DNA变为两条单链DNA。
第二步是退火，通过降温使引物与目标序列结合。
在PCR反应中，引物是特异性结合到目标DNA序列的短链DNA片段，可以通过计算机设计。
当温度降至50-65℃时，引物与目标序列的互补碱基序列结合形成稳定的引物-模板复合物。
第三步是延伸，通过DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
在引物的引导下，DNA聚合酶能够以DNA模板为蓝图在原始DNA链的3'端合成新的DNA链。
这个过程需要适当的酶和核苷酸供应。
上述步骤会以连续的循环进行，每个循环大约需要几十秒到几分钟时间。
这种连续的循环使得DNA序列以指数级别增加，通常可以在几个小时内扩增到大约一亿倍。
1.DNA检测和分析：PCR可以扩增极低浓度的DNA片段，从而使得一些原本难以检测的DNA变得可见。
它在疾病的早期诊断、遗传学研究和基因突变的检测等方面有着广泛的应用，对于疾病预防和治疗提供了有力的支持。
2.基因工程：PCR技术可以用来构建基因重组体和进行基因修饰。
通过PCR扩增目标DNA片段，可以将其插入到表达载体中，进而用于蛋白质的过表达和功能研究。
3.古生物学研究：PCR技术可以通过扩增化石中保存的DNA片段，从而帮助揭示古生物的遗传信息。
这项技术在恐龙研究和人类进化研究等方面有着重要的应用。
4.基因指纹鉴定：PCR技术可以扩增DNA中的不同位点，从而获得个体之间的DNA指纹。
PCR 技术及应用
PCR条件的选择
• DNA聚合酶
• 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含12.5U(比活性为20U/pmol)Taq DNA聚合酶为佳。 然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物 而变化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积 中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果 浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩 增带；过低时，则靶序列产量很低。
引物及dNTP的优化
酶及溴酚蓝的优化
PCR反应的最佳模式（CT为例）
• • • • • • • • • CT DNA PCR最佳反应体系： 反应混合物 终浓度 20×反应缓冲液 1× dNTP混合物 200M 引物Ⅰ 15pmol 引物Ⅱ 15pmol MgCl2溶液 2.0mM 无菌去离子水至 26l/反应管 取26l反应混合物，加入已经分装的Taq DNA聚合酶1u （固定化的酶）的离心管中， 加入2l待测DNA模板，混匀，铺上石蜡，37℃保温10分钟，然后进行PCR循环： 94℃ 300秒 – 94℃ 45秒 – 55℃ 45秒 35次循环 – 72℃ 45秒 – 72℃ 300秒
PCR反应基本原理
Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温 度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的 Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进 行DNA变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一 次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年， Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR 后，PCR技术的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司 推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中 的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的 种类已超过100多种。
PCR技术原理、实验步骤和应用
一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。
这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。
它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。
参与复制的有多种因素。
PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
聚合酶链式反应(PCR)技术
实验十聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是美国Cetus公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis于1985年发明的一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。
该技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。
使用PCR扩增技术，可以将极微量的靶DNA片段特异地扩增上百万倍，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。
PCR技术具有敏感度高、特异性强、快速简便等优点，在医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。
一、实验目的了解PCR技术的原理，学习建立PCR反应体系的原则以及掌握PCR操作的方法。
二、实验原理PCR技术模拟DNA的天然复制过程，在体外对DNA的特异序列进行扩增，从而获得大量的同一序列。
与扩增的特异性密切相关的因素是与待扩增的特异序列两端互补的两个寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。
在含有模板、引物、聚合酶以及其他成分的反应体系中进行以下反应：变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
退火：使溶液温度降至50℃-60℃，模板DNA与引物按碱基互补配对原则结合。
延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，催化反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）按5′→3′方向和成互补DNA。
上述3步为一个循环，经历高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
每经过一个循环，样本中的DNA量增加一倍；新一轮循环以新形成的链和原模板链作为模板，经过25-30个循环后DNA可扩增倍106-109。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、4种dNTP 混合物、MgCl2、引物、耐热Taq DNA聚合酶。
三、实验试剂及仪器1. 10×PCR buffer2. 引物3. DNA模板4. MgCl25. 4种dNTP混合物6. Taq DNA聚合酶7. PCR仪、凝胶成像系统、电泳系统四、实验方法1.2.反应体系混匀，离心；3.PCR扩增94℃变性1分钟36℃退火1分钟72℃延伸1分钟35-40 cycles4.72℃延伸反应5分钟。
pcr的临床意义及应用
pcr的临床意义及应用
PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，其在医学
领域中有着广泛应用。
本文将从PCR的临床意义和应用两个方面展开
探讨。
首先，PCR在临床上有着极为重要的意义。
通过PCR技术，医生
们可以快速、准确地检测出一系列疾病。
例如，在感染性疾病的诊断中，PCR可以检测出病原体（如病毒、细菌等）的存在，有利于早期
发现和治疗。
此外，PCR还可以用于遗传病的基因检测，帮助人们了
解自己的基因情况，预防患病。
因此，PCR在临床诊断中具有不可替
代的地位。
其次，PCR技术在临床应用上也非常广泛。
在疾病预防和控制方面，PCR可以用于流行病学调查、疫情监测等工作。
同时，在肿瘤的诊断
和治疗中，PCR也扮演着重要的角色。
通过检测肿瘤细胞的特定基因
突变，可以帮助医生选择最佳的治疗方案，提高治疗效果。
此外，
PCR还可以用于药物敏感性检测、免疫学研究等多个领域，为医学研
究和临床实践提供强大支持。
综上所述，PCR的临床意义和应用远不止以上所述，随着科学技术
的不断进步，PCR技术在医学领域的应用前景将会更加广阔。
PCR的
发展使得疾病的诊断和治疗变得更加精准和高效，极大地提高了人们
的生活质量，为医学事业的发展贡献力量。
PCR技术的不断完善和创新，将为医学领域带来更多惊喜和突破，值得期待。
PCR(聚合酶链式反应)技术与应用
PCR（聚合酶链式反应）技术与应用一．PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，是极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。
其反应原理与细胞内DNA复制相似，但PCR反应体系要简单得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶及适合的缓冲体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。
PCR包括下列三步反应：（1）变性（denaturation）：将反应体系混合物加热到94℃维持较短时间（大约15~30s），是目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
（2）退火（annealing）：将反应体系冷却至特定温度（引物的T m值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板-引物复合物。
必须精确的计算退火的温度以保证引物只与相对应的序列结合。
由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
（3）延伸（elongation）：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，合成新的DNA链。
因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。
以上三步作为一个循环重复进行，每一个循环的产物作为下一循环的模板。
因此，在第二轮循环中进行变性、退火、延伸这三步反应。
如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。
而所有上述过程将在1~2h内完成。
经过扩增后的DNA产物为大多介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进行稀释至可以忽略的程度。
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
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转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
聚合酶链式反应 实验报告
聚合酶链式反应实验报告《聚合酶链式反应实验报告》摘要：本实验旨在利用聚合酶链式反应（PCR）技术，对特定DNA片段进行扩增，以验证PCR技术在分子生物学研究中的应用。
实验结果表明，PCR技术能够快速、准确地扩增特定DNA片段，为分子生物学研究提供了重要的技术支持。
引言：PCR技术是一种能够在体外扩增特定DNA片段的技术，它的应用领域非常广泛，包括基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等。
PCR技术的核心是聚合酶链式反应，通过该反应可以在短时间内扩增目标DNA片段，为分子生物学研究提供了重要的技术手段。
材料与方法：1. 实验材料：PCR试剂盒、目标DNA模板、引物、Taq聚合酶等。
2. PCR反应条件：预变性步骤（95°C，5分钟），30个循环（95°C，30秒；55°C，30秒；72°C，1分钟），最终延伸步骤（72°C，10分钟）。
3. PCR产物分析：利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。
结果：经过PCR反应，我们成功地扩增出了目标DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，在PCR反应后，出现了明显的目标DNA条带，证明了PCR技术的有效性和准确性。
讨论：本实验结果表明，PCR技术能够快速、准确地扩增特定DNA片段，为分子生物学研究提供了重要的技术支持。
通过PCR技术，我们可以在短时间内获得大量目标DNA片段，为基因克隆、基因检测等研究提供了便利。
同时，PCR技术还可以用于DNA指纹分析、疾病诊断等领域，具有广阔的应用前景。
结论：本实验验证了PCR技术在分子生物学研究中的重要应用，为进一步深入研究基因克隆、基因检测等领域提供了重要的技术支持。
PCR技术的快速、准确和高效特点，使其成为分子生物学研究中不可或缺的技术手段。
希望通过本实验的结果，能够更好地推动PCR技术在生物学领域的应用和发展。
PCR技术及应用
聚合酶链式反应
——PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA 作为引物，通过加温变性－退火－延伸（DNA合成） 这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。 由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25~30 个循环后，扩增倍数可达106。
中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普 利等）
耐高温DNA聚合酶的种类
Taq
DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶
Tfl
(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)
目前，TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动
物和植物的位点特异性基因打靶，与锌指核酸 酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问 题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN 与基因 组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关 等。
3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
CRISPR (Clustered regularly interspaced short
充满梦想却幻灭的ZFN：
难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重 • 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”。
•
2. TALEN 基因组编辑技术
PCR不只是一个方法改进
Mullis的上司有句“名言”，“我们
要扩增这么多DNA样品有什么用”。 到了1991，Cetus公司以3亿美元的 转让费将PCR相关专利转让给瑞士 Hoffman LaRoche公司，并在此后 的经营中又获得了数亿美元的分红。 Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖， PCR和DNA重组技术一样意义深远。
反转录聚合酶链式反应
反转录聚合酶链式反应
反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称 RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于将RNA模板转录为相应的DNA片段，并进行扩增。
RT-PCR的基本步骤如下：
1. 提取RNA样品：从感兴趣的细胞或组织中提取RNA，并通过RNAase酶阻断其降解。
2. 反转录：使用反转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA模板转录为相应的cDNA。
反转录酶利用RNA作为模板，合成一条与模板RNA相互互补的DNA链。
3. 片段扩增：将反转录产生的cDNA作为模板，使用DNA聚合酶进行PCR扩增。
PCR反应包括一系列的循环，每个循环分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在每个循环中，DNA双链解旋，引物与目标序列的两个末端连接，然后DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
4. 结果分析：扩增产物可通过凝胶电泳、实时荧光PCR或其他方法检测和分析。
RT-PCR在研究基因表达调控、检测RNA病毒（如HIV）等方面具有重要应用价值。
由于RNA容易降解和稀少，RT-PCR技术成为研究RNA的有效工具。
rt-pcr的基本原理及应用
RT-PCR的基本原理及应用1. 介绍逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术方法。
它结合了逆转录和聚合酶链式反应（PCR）两种关键技术，能够在研究中快速、高效地扩增目标DNA片段。
本文将介绍RT-PCR的基本原理及其在生物学、医学和遗传学等领域中的应用。
2. RT-PCR的基本原理RT-PCR主要包含以下步骤： - 逆转录：使用反转录酶将RNA转录为互补的DNA模板。
反转录酶在逆转录过程中合成互补的DNA链，使得RNA转变为DNA 模板。
- 聚合酶链式反应：使用DNA聚合酶通过不断的复制和扩增DNA模板来合成目标DNA片段。
聚合酶链式反应通过两个引物将目标序列夹在中间，然后利用DNA聚合酶将这两个引物的序列逐渐复制扩增，产生大量的目标DNA片段。
3. RT-PCR的应用场景RT-PCR在科学研究和医学诊断中有着广泛的应用，以下是一些常见的应用场景：3.1 基因表达分析RT-PCR可以用来检测和分析基因的表达水平，通过测量特定基因的mRNA水平来了解该基因在细胞或组织中的表达情况。
这种方法可以帮助研究人员深入了解细胞信号传导、疾病发展以及药物治疗的效果等。
3.2 病原体检测RT-PCR在病原体检测中具有高度的敏感性和特异性，可以用于快速准确地检测病原体的存在。
例如，在流行病学研究中，RT-PCR可以用来检测病毒、细菌或真菌感染，从而帮助医生选择最佳的治疗方法。
3.3 遗传疾病筛查许多遗传性疾病可以通过RT-PCR来进行筛查和诊断。
通过检测具有特定基因突变的人体细胞中的mRNA，医生可以确定是否存在特定遗传突变，从而帮助确定疾病的风险和预后。
3.4 癌症诊断和监测癌症细胞通常会表达特定的基因表达模式，这些模式可以通过RT-PCR来检测和分析。
通过分析癌细胞中特定基因的表达水平，医生可以帮助诊断和监测癌症的类型、进展和治疗效果。
4. RT-PCR的优势和局限性4.1 优势•高灵敏度：RT-PCR可以检测到非常低浓度的目标DNA或RNA，具有高度的灵敏度。
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
检测电泳结果
观察电泳结果，通过染色或荧光染料标记的方法检测PCR产物的位 置和大小，判断是否成功扩增出目标片段。
04
结果分析
电泳结果解读
01
电泳条带的亮度与产物量
电泳条带的亮度通常与产物量成正比。如果观察到某一泳道的条带亮度
显著高于或低于其他泳道，可能表明该泳道的PCR产物量存在异常。
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THANKS
例混合，配置成PCR反应液。
设定PCR程序
根据所使用的DNA聚合酶和PCR 仪器的要求，设定PCR扩增程序， 包括变性、退火、延伸等温度设置 以及循环次数等。
进行PCR扩增
将PCR反应液放入PCR仪器中，按 照设定的程序进行扩增反应。
电泳检测
配置电泳液
选择适当的电泳缓冲液和染料，配置成电泳液。
进行电泳
移液器
精确移取一定量的溶液，进行 实验操作。
电泳仪和电泳槽
用于检测PCR产物，通过电泳 观察扩增结果。
实验试剂准备
01
02
03
缓冲液
提供PCR反应所需的缓冲 环境，维持反应体系的酸 碱度和离子浓度。
去离子水
稀释和配制溶液所需的水 源。
染料
用于电泳时染色DNA片段， 便于观察和检测。
03
实验步骤
模板DNA的制备
定量分析
通过测量PCR产物在特定波长下的吸光度，可以定量分析 产物量。常用的定量方法包括终点法、动力学法和标准曲 线法。
重复性评估
为了确保实验结果的可靠性，需要评估不同实验条件下 （如不同PCR循环数）的重复性。这可以通过计算重复实 验之间的变异系数来实现。
分子生物诺贝尔奖-聚合酶链式反应
分子生物诺贝尔奖-聚合酶链式反应摘要：聚合酶链式反应（PCR）是一种基于体外扩增DNA片段的技术，它被广泛用于分子生物学和遗传学领域。
本文将探讨PCR的工作原理、发展历史以及在分子生物学上的应用。
聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，可以通过模拟自然界的DNA复制过程，通过使用聚合酶，在体外扩增DNA序列。
PCR技术的发明具有革命性的意义，因为它使得研究人员可以在实验室中快速、准确地扩增DNA片段，而无需使用其他复杂的技术，如细胞培养和重组DNA技术。
自从PCR被发明以来，该技术已经被广泛用于科学研究、医学诊断和法医学鉴定等领域。
本文将重点讨论PCR的工作原理、发展历史和在分子生物学上的应用，并且对其未来的前景做出展望。
关键词：聚合酶链式反应；DNA；PCR；分子生物学；扩增0 引言聚合酶链式反应（PCR）是一种在分子生物学和遗传学领域中使用最广泛的技术之一，它可以通过体外扩增DNA片段，使得研究人员能够轻松地进行基因分析、基因修饰和细胞工程等方面的研究。
本文将探讨PCR技术的工作原理、发展历史以及在分子生物学上的应用，并对其未来的前景做出展望。
一、聚合酶链式反应（PCR）的工作原理PCR是一种利用聚合酶催化复制DNA的技术，主要由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
每个步骤都需要特定的温度和时间来实现。
PCR的工作原理如下：1.1 变性在PCR开始之前，DNA双链被加热至95℃以上，从而使其分离成两条单链。
这个过程称为变性。
高温可以破坏氢键，从而使DNA双链断裂。
这样，DNA 就可以为后续的反应做好准备。
1.2 退火随着温度的降低，引物会与模板DNA结合，形成一个稳定的DNA双链。
引物由聚合酶复制时所需的核苷酸序列确定。
退火的温度通常在50-60℃之间，这样引物可以与模板DNA特异地结合。
1.3 延伸一旦引物与模板DNA结合，聚合酶就开始将缺失的碱基填充到引物结合位点上，并延伸引物以产生新的DNA分子。
分子生物学中的PCR技术原理
分子生物学中的PCR技术原理PCR技术，全称聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种体外DNA复制技术，是分子生物学中最重要的工具之一。
PCR技术的应用范围非常广泛，包括：基因检测、药物开发、鉴定DNA指纹、疾病诊断、显微技术等。
本文将从PCR技术的原理、步骤、应用以及优缺点等方面进行探讨。
PCR技术的原理PCR技术的原理基于DNA复制的自然过程，通过人工合成起始端（引物），使DNA的复制进程在离子和热的条件下进行。
PCR技术是一种特异性和灵敏性很高的方法，可以在几小时内将目标DNA扩增数百万倍，非常适合于对微量DNA进行检测和定量分析。
PCR技术的步骤PCR技术的具体步骤如下：1. 取一段DNA，并根据目的插入适当的载体。
2. 选择合适的引物，将其加入到PCR反应中。
3. 将PCR反应混合物置于PCR仪中。
4. 先将混合物加热至90-95℃，使DNA变性并断裂，成为两条基因组。
5. 降温至50-60℃，让引物与DNA分子互相结合形成复合物。
6. 提高温度至72℃，加入热稳定DNA酶。
7. 循环反复进行以上过程，最终得到数以百万计的DNA复本，从而实现DNA扩增。
PCR技术的应用PCR技术在医学、生物学、农业、环境保护和法医学等领域中得到了广泛的应用。
1. 基因检测：PCR技术能够快速检测DNA中的某些基因突变，从而实现基因定位和疾病诊断。
2. 药物开发：PCR技术能够快速为药物开发寻找新的药物靶标，并检测药物是否对靶标的活性造成了影响。
3. 鉴定DNA指纹：PCR技术能够快速鉴定DNA指纹，从而实现个体鉴定或确定亲缘关系。
4. 疾病诊断：PCR技术能够帮助医生进行早期诊断、筛查、预测和监测某些疾病的发生和发展。
5. 显微技术：PCR技术能够加强显微技术的应用，从而扩大显微结果的范围。
PCR技术的优缺点PCR技术的技术优点主要包括：1. 具有高度特异性，能够扩增任何目标DNA序列；2. 灵敏度高，可以检测到微量的DNA样品；3. 可重复性高，结果可靠稳定；4. 快速，可以迅速产生大量的DNA片段。
PCR原理和应用
PCR 反应五要素：
● 模板DNA： 50-200ng，高纯度，增加反应特异性 ● PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约
20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在40-70％之间； 内部不能有回文序列；３’端不能互补。
● PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95℃ ● PCR用Buffer ：Mg2+是辅基（2.0mM）。浓度太
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2）循环参数
(1)变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒
引物延伸(extension) 70-72℃左右，为Taq酶最适反应温度。
PCR法的操作过程
Step 1: DNA热变性
Step 2: 引物退火 Step 3: 引物延伸
经典循环参数（500bp以内）
94℃ 94℃ 50 ℃ 5min 30s 45s
×30次
72 ℃
72℃ 4℃
1min
10 min forever
RNA严重降解
RNA质量较好
RT-PCR注意事项
应常规消化痕量的gDNA Total RNA 或mRNA反转录不宜过量，通常 20ul体系为1μg Total RNA或mRNA PCR扩增产物片段不宜过长，200-500bp为 宜 扩增循环数为25-28cycle为宜，不宜超过 30cycle
绝对定量与相对定量的定义
绝对定量通过标准品定量
聚合酶链式反应技术及其应用
聚合酶链式反应技术及其应用在生物科技领域，聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种非常重要的技术手段，它可以快速、准确地扩增DNA，应用广泛。
下面，我将详细介绍PCR技术的原理、操作方法以及应用。
一、PCR技术的原理PCR技术的核心是DNA扩增，扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR反应具体流程如下：1. 变性：将DNA分子的双链分离成单链，这是PCR反应最重要的一步，因为只有在单链DNA的状态下，才可以实现DNA扩增。
变性时，将样品加热至95℃左右，使DNA分子双链断裂，形成单链状态。
2. 退火：将引物与模板DNA配对结合。
在引物含量过高的情况下，引物与DNA模板发生杂交，此时引物为20个碱基左右的短链DNA。
3. 延伸：在真核生物中，PCR反应中含有酶——聚合酶，它是从热温泉海洋微生物中提取的。
模板的DNA片段会在此时开始合成，固定引物会拓展其3’端，引物和模板组成的DNA模板将聚合物质合成DNA分子。
以上流程反复反应，就可快速扩增出含有想要的DNA碱基序列的DNA分子。
其中，引物的设计相当关键，因为只有用恰当的引物才能选择性地扩增出目标片段。
二、PCR技术的操作方法PCR反应仪是PCR技术的关键设备，这种设备非常专业，主要用于DNA扩增，一般比较昂贵，属于生物化学实验室的常备设备。
下面我将简单介绍PCR技术的操作步骤：1. 选择DNA模板：DNA模板通常来自于细胞、组织、疾病病源体等。
需要注意的是，DNA模板存在于原始样本细胞中，如果样品纯度不够高，浓度也不够，就不能很好地进行PCR反应，因此提取出DNA模板非常重要。
2. 设计引物：引物在PCR反应过程中发挥重要的作用，选择与预期扩增DNA片段保持完美匹配的引物非常关键。
引物设计时需要考虑引物长度、熔点、GC含量、引物特定性、杂交温度等因素，设计优秀的引物有助于提高PCR反应的特异性和灵敏度。
pcr技术在分子生物学中的应用
pcr技术在分子生物学中的应用PCR技术在分子生物学中的应用引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它可以快速、准确地扩增DNA片段。
PCR技术因其高效、灵敏和可靠的特点，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
本文将深入探讨PCR技术在分子生物学中的应用。
一、基因检测PCR技术在基因检测中有着重要的应用。
通过PCR扩增特定基因片段，可以检测个体是否携带某种基因突变或遗传病。
例如，PCR技术可以用于检测乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的突变，帮助判断个体是否具有遗传乳腺癌的风险。
此外，PCR技术还可以用于检测病原体的基因，例如新冠病毒的核酸检测就是基于PCR原理。
二、疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要的应用价值。
通过PCR扩增患者体液中特定病原体的DNA或RNA片段，可以快速准确地检测出病原体的存在，从而帮助医生进行疾病的诊断。
例如，PCR技术可以用于检测艾滋病病毒的存在，帮助医生判断患者是否感染了艾滋病。
此外，PCR技术还可以用于检测细菌感染，例如通过检测脑脊液中的细菌DNA片段来诊断脑膜炎。
三、基因工程PCR技术在基因工程领域有着广泛的应用。
通过PCR扩增目标基因片段，可以快速获得大量的目标DNA。
这样就可以进行基因克隆、基因插入等操作。
例如，PCR技术可以用于构建重组质粒，将目标基因插入到质粒中，从而实现基因的表达和研究。
此外，PCR技术还可以用于基因突变的引入，通过引入特定突变的PCR产物，可以实现特定基因的突变。
四、法医学PCR技术在法医学中有着重要的应用。
通过PCR扩增样本中特定基因片段的DNA，可以对犯罪现场的DNA进行检测和鉴定。
例如，在刑事案件中，通过PCR技术可以检测凶手遗留在现场的DNA，从而确定凶手的身份。
此外，PCR技术还可以用于亲子鉴定，通过比对父母和子女的DNA片段，确定亲子关系。
总结：PCR技术作为一种高效、灵敏和可靠的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
PCR技术在药物研发中的应用
PCR技术在药物研发中的应用PCR(聚合酶链式反应)技术是一种典型的分子生物学实验技术，该技术被广泛应用于医疗、农业、环境等领域。
在药物研发中，PCR技术也是不可或缺的。
1. PCR技术简介PCR技术是一种通过“复制”DNA分子的方法，通过酶的作用，将DNA分子复制成数以百万计的递增分子，从而取得对一种特定DNA序列的大量复制。
PCR技术的基本步骤包括：DNA分子的解离，引物的合成，聚合酶的选取和反应条件的优化。
2. PCR在药物研发中的应用PCR技术在药物研发中的应用主要包括以下几个方面：2.1. 药物靶标鉴定PCR技术可以通过检测靶点基因的表达，对潜在的药物作用靶标进行筛选。
例如，对某种疾病相关的基因进行PCR扩增，检测其表达水平，确定该基因是否为药物助剂靶点。
2.2. 药物剂型设计PCR技术可用于药物剂型的改良和设计。
例如，对某种基因进行RNA干扰，确定其在药物治疗中的应用前景和药物剂量。
2.3. 药物代谢动力学研究PCR技术在研究人体药物代谢动力学方面也有着广泛应用。
例如，可以通过检测药物代谢相关基因的表达量，确定某些基因是否参与药物代谢，并确定药物在人体体内代谢的过程和代谢产物的性质。
2.4. 药物剂量优化PCR技术在药物剂量优化中也有着不可替代的作用。
例如，可以通过检测药物代谢相关基因的表达水平，确定药物的最佳用药剂量和方案，避免剂量过大或剂量不足的问题。
2.5. 药物致病机理研究PCR技术还可用于研究药物致病机理。
例如，通过检测药物代谢相关基因的表达量，确定药物对人体细胞的影响和对人体影响产生多大的影响。
3. PCR技术的应用案例目前，PCR技术在药物研发领域已经具有广泛的应用。
例如，珂珂西辅酮（Carotid）药物是一种针对乙肝治疗的药物。
在研发过程中，研究发现，珂珂西辅酮的作用机制是通过抑制乙肝编码核糖核酸（HBV-DNA）的合成。
在研发中，研究人员通过PCR 测定乙肝相关基因的表达水平，确定该基因是否对珂珂西辅酮的治疗有影响，并确定珂珂西辅酮在体内的最佳使用剂量和药物用药方案，使珂珂西辅酮成为治疗乙肝的一线药物。
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操 作 简 便 等 优 点 使 其 在 短 短 的 数 年 时 间 即 被 广 泛 应 用 于 各 大 领 域 。 介 绍 了 ＰＣＲ 反 应 的 原 理 以 及 常 用 的
ＰＣＲ反 应 技 术 ，探 讨 了该 技 术在 医学 、食 品 工 业 、环 境 监 测 、农 业 ｑ－的 运 用 ，以 期 提 供 参 考 。
关 键 词 ：聚 合 酶链 式 反 应 ；技 术 ；应 用
中 图 分 类 号 ：ＴＳ２０７
文 献 标 识 码 ：Ａ
文章 编 号 ：１６７４—９９４４（２０１８）８－０２３０—０２
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ１ 引 言
２Ｏ世 纪 ８０年 代 中 期 ，Ｍｕｌｌｉｓ发 明 了体 外 核 酸 扩 增 技 术 —— 聚 合 酶 链 式 反 应 ，又 称 ＰＣＲ （Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反 应 。ＰＣＲ反 应 是 一 种 在 生 物 体 外 模 拟 生 物 体 内 复 制 进 行 特 定 的 ＤＮＡ 片 段 的 放 大 扩 增 的 分 子 生 物 学 技 术 。ＰＣＲ 反 应 具 有 特 异 性 强 、灵 敏 度 高 、 易 重 复 、简 便 、快 速 等 突 出优 点 使 其 在 短 短 的 数 年 时 间 即被 广 泛 应 用 于各 大 领 域 如 医 学 诊 断 、环 境 监 测 、食 品 行 业 、农 业 、基 因 工 程 等 。笔 者 将 从 ＰＣＲ 反 应 的 原 理 、 技 术 及 应 用 方 面进 行 综 述 。
ＲＴ— ＰＣＲ 技 术 ，将 ＲＮＡ 的 逆 转 录 （ＲＴ）和 ｃＤＮＡ 的 聚合 酶 链 式 扩 增 反 应 （ＰＣＲ）二 者 相 结 合 在 一 起 。 以 ＲＮＡ 为 模 板 ，经 逆 转 录 酶 的 催 化 合 成 ｃＤＮＡ，再 以 ｃＤＮＡ 为 模 板 进 行 ＰＣＲ 反 应 。ＲＴ— ＰＣＲ 技 术 灵 敏 而 且 用途 广 泛 ，可用 于 克 隆 ｍＲＮＡ 的 ３’和 ５’的 末 端 序 列 获 得 基 因 的全 场 序 列 、检 测 细 胞 或 者 组 织 中基 因表 达 水 平 、测 定 细 胞 中 ＲＮＡ 病 毒 的 含 量 和 直 接 克 隆 特 定 基 因 的 ｃＤＮＡ序 列 等 。 ３．３ 巢 式 ＰＣＲ 技 术
３ 常用 的 ＰＣＲ反 应 技 术
３．１ 定 量 ＰＣＲ 技 术 定 量 ＰＣＲ技 术 是 指 以 外 参 或 内 参 为 标 准 ，通 过 对
ＰＣＲ终 产 物 的 分 析 或 ＰＣＲ过 程 的监 测 ，进 行 ＰＣＲ 起 始
模 板 量 的 定 量 。 目前 ，采 用 定 量 ＰＣＲ 方 法 主 要 包 括 半 定 量 ＰＣＲ、荧 光 定 量 ＰＣＲ、定 时 定 量 ＰＣＲ 等 。 比 如 ， 可 以借 助 半 定 量 ＰＣＲ技 术 分 析 目的基 因在 植 物 或 者 动 物 的不 同 组 织 和 发 育 不 同时 期 的表 达 情 况 ，判 断该 基 因 是 组 织 特 异 性 基 因还 是 组 成 型 基 因 ，为 基 因功 能 的 预 测 提 供 一 定 的基 础 。 ３．２ 逆 转 录 ＰＣＲ（ＲＴ— ＰＣＲ）技 术
２０１８年 ４月
绿 色斜 技
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
第 ８期
聚合酶链式 反应技术及应用
东 锐
（武威 职 业 学院 ，甘 肃 武威 ７３３０００）
摘 要 ：指 出 了聚 合 酶 链 式 反 应 是 目前 的 一 种 最 基 本 也 是 应 用 最 广 泛 的 技 术 。 由 于 ＰＣＲ 反 应 的 快 速 、灵 敏 、
２ ＰＣＲ 反 应 的 原 理
ＤＮＡ 的半 保 留 复 制 ，具 有 高 度 的保 真 性 ，保 证 亲 代 ＤＮＡ 和子 代 ＤＮＡ 具 有 相 同 的 遗 传 信 息 ，为 维 持 物 种 的稳 定 性 和 连续 性 起 着 非 常 重 要 的 作 用 。ＰｃＲ 反 应 的 基 本 原 理 就 是 模 拟 ＤＮＡ 的体 内复 制 过 程 进 行 ＤＮＡ 的 体 外 扩 增 ，通 过 设 计 特 异 性 引 物 快 速 扩 增 所 需 的 目的 ＤＮＡ序 列 。该 技 术 是 在 模 板 ＤＮＡ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、特 异 性 引物 、耐 热 的 ＤＮＡ 聚 合 酶 （Ｔａｑ酶 ）和 含 Ｍｇ。 的 缓 冲 液 存 在 下 的 酶 促 反 应 ，反 应 需 在 ＰＣＲ 仪 中 完 成 。ＰＣＲ 反 应 通 常 由 变 性 、退 火 、延 伸 ３个 阶 段 构 成 ：① 变 性 。 酶 促 反 应 体 系 的 温 度 加 热 至 ９Ｏ～ ９５℃ ，模 板 ＤＮＡ 双 链 变 性 解 离 成 单 链 ＤＮＡ；② 退 火 。 温 度 降 至 ５ｏ～ ５５ ℃ ，引 物 与单 链 ＤＮＡ 结 合 ，形 成 局 部 双 链 ；③ 延 伸 。反 应 体 系 的 温 度 升 高 至 ７２ ℃ ，以 ｄＮＴＰ 为 原 料 ，经 热 稳 定 的 Ｔａｑ酶 的催 化 ，合 成 一 条 与 模 板 链 互 补 的 新 ＤＮＡ 链 。 变 性 、退 火 、延 伸 这 ３个 步 骤 就 构 成 了 ＰＣＲ 的 一 个 循 环 ，经 过 大 概 ３０个 循 坏 ，就 可 以将 待 扩 增 目的基 因 扩 增 数 百 万 倍 以上 。
巢 式 ＰＣＲ 是 一 种 变 异 的 聚 合 酶 链 反 应 （ＰＣＲ），区 别 于 一 般 的 ＰＣＲ 反 应 。它 使 用 两 对 ＰＣＲ 引 物 通 过 两 轮 ＰＣＲ 反 应 （Ｏｕｔｅｒ ＰＣＲ 和 Ｉｎｎｅｒ ＰＣＲ）扩 增 特 异 性 的 ＤＮＡ 片 段 。其 中 ，第 一 对 引 物 扩 增 片 段 和 普 通 ＰＣＲ 相 似 ，其 扩 增 的产 物 为 第 二 轮 Ｉｎｎｅｒ ＰＣＲ 的 模 板 。第 二 对 引 物 为 巢 式 引 物 ，结 合 在 第 一 轮 ＰＣＲ产 物 内部 ，使 得 第 二 轮 Ｉｎｎｅｒ ＰＣＲ扩 增 片段 小 于第 一 次 扩 增 。例 如 ，利 用 巢 式 ＰＣＲ技 术 可 以 快 速 检 测 到 病 料 中 的 猪 瘟 病 毒 ，在 猪 瘟 的早 期 检 测 及 预 防 、控 制 上 起 到重 要 的作 用 。 ３．４ 原 位 ＰＣＲ技 术