2.菌种选育、菌种保藏

6.7～7.5之间。
分离嗜酸放线菌，宜 pH 4.5～5.0。
有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌，不能
在<pH6.1～6.8下生长。估计嗜碱性放线菌也可能存在于其
他碱性环境中。
3、加入选择性抑制剂
筛选放线菌时，可加入抗真菌抗生素，但不能用抗细
菌抗生素，因放线菌对它敏感。 如分离种类较广的放线菌，在分离培养基中加抗细菌 抗生素时会使得放线菌及其细菌的数量同时减少，但如果 分离的种类不那么广，可加入放线菌能耐受的抗生素，如
从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工
业目的的优良菌株 ；

从已知菌种和大自然中分离新菌株 • 寻找新的发酵产品的产生菌； • 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
选择性
灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
一、
生物物质产生菌的筛选
（一） 微生物是生物产物的主要来源之一
菌种是发酵工业的基础，是发酵工业的关键。
获得微生物和新产物，关键是：
①、选择合适的微生物源； ②、建立科学的筛选方案(检测系统)。 要求：选择性强、灵敏度高。
合适的微生物源
微生物是各种活性产物的源泉，资源丰富。 医药50％的化合物与天然产物有关。 微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。
A
μ
B
S0
基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
连续富集培养技术分离菌株的优点

分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
B. 固体培养技术

常用于分离某些酶产生菌
③、离心法：处理放线菌繁殖体含量很低的海水，可 先将样品离心后再过滤。
④、搅动释放孢子法：收集腐烂稻草和其他植物材料 中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行。并可用一风筒 或一简单的沉淀室收集孢子。然后，用取样器将空气撞击
在含培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的细菌数
目。
（2）化学法 在分离前加一些固体基质(把几种基质加在土壤中) 或洒些可溶性养分来强化培养基。
个平板上铺上一种试验菌。
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术

技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株
生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件

培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛 选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等 问题
连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
样品采集
→样品的预处理→目的菌富集培养
→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定 →菌种保藏。
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（查阅资料） 试验方案设计 样品采集（所需微生物？） 样品预处理（目的微生物） 菌种分离
根据目的菌株及其产物特点
菌种纯化 复筛
初 筛
菌种纯化 初步工艺条件摸索， 生产性能测试
• 复印平板法
• 显微镜观察分离
不易区分同一属的不同种。
• 铺菌法
会使所需菌落污染，并且只能每平板一种试 验菌
• 复印平板法 对不生长孢子的链霉菌则不能使用，也不适 用于游动细菌的筛选。
放线菌常用筛选方法：

铺菌法
于平板上铺一层试验菌，观察抑菌圈大小， 可测定抗生素生产能力。
缺点：所需要的菌落易污染，且只能在每
选择压力：在选择培养基中加入所需酶的
基质
随机分离原理与技术

从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专 一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出目的菌。

技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方
法的确定。 随机分离技术举例 • 抗生素产生菌的筛选 • 药理活性化合物产生菌的筛选 • 生长因子产生菌的筛选 • 多糖产生菌的筛选
二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求
（二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
1. 菌种选择的总趋势

野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
2. 菌种选择的要求

能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目 的产物产量高、易于回收；


生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；
培养条件易于控制；
抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和 毒素。
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
抗生素产生菌的筛选

筛选模型：试验菌 筛选方法：
固体培养基
液体培养筛选
铺菌法 复印平板法
抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β -内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制
水解酶
（1）抗生素产生菌筛选 在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培
2. 样品的预处理

目的：提高分离效率

方法：
• 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法
• 化学方法
• 诱饵法
材料的预处理
（1）、物理法 ①、热处理：可减少材料中的细菌数。因许多放线菌 比细菌细胞耐热。 ②、膜过滤：样品中细胞数较少时(如水)，可采用膜
滤法浓缩。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响。
养基中，检测抗菌活性。
采用联合试验菌。 举例：枯草杆菌和绿色产色链霉菌可以分离出对枯 草杆菌抗菌活性低、对绿色产色链霉菌活性高的新抗生素。 黄色霉素族的抗生素便是用这类方法找到的。
试验菌 金黄色葡萄球菌
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
枯草杆菌 大肠杆菌 分枝杆菌 白色念珠菌 青霉菌
革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌 结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌

高产培养基设计的几个原则
•
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
•
•
使用一聚合或复合形式的生长限制养分；
避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏；
• • •
确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
3、利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类 的菌株。 例如：酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的 中性圈的放线菌类群有很大不同。
4、自然环境的菌群可因人类的活动而改变。
例如：于土壤中加入去莠津会导致放线菌菌群数 量的增加。如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂 中。 5、更新的生态环境仍有待开发。 例如，从Componia的根瘤中分离出一株放线菌； 从白蚁肠子里分离出一株类似放线菌的细菌。
1. 筛选的两种指导思想

先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。

分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面

从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；
生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；

采样时应注意的问题: • 土壤微生物的分布 • 采土深度
• 土壤植被情况
• 采样季节
• 土壤的酸碱度
含微生物材料的选择
菌种来源选择标准：
1、土壤来源广泛：天然材料（土壤等）来源越广泛，含有
目的菌的可能性越大，获得新菌种的可能性越高； 2、在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种。 例：从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌，从盐场分 离出嗜盐链霉菌。
培养基中加入新生霉素(25µ g/mL)和亚胺环己酮(50 µ g/mL)
能分离出普通高温放线菌。
菌种的培养
温度和时间两方面，主要变量为时间。
培养温度：放线菌25～30oC，嗜热菌45～55oC，嗜冷 菌4～10oC。 培养时间： 是培养的主要变量，嗜温菌（链霉菌和 小单孢菌）7～14d；嗜热菌（高温放线菌）1～2d。
②、淀粉-酪素培养基： 长出的放线菌种类与几丁质培养基上生长的相似，但 其菌落的密度更大、色素更多，同时细菌也容易生长。 这种培养基中加入4.6％(m/m)的NaCl，有利于链霉 菌生长，但不是所有的链霉菌都能耐受这一浓度的NaCl。
2、选择合适的pH
大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH通常在
一、工业生产常用的微生物及要求
（一）微生物的特点 微生物指是指那些 个体微小，结构简 单，必须借助显微 镜的帮助才能看清 它们外形的一群微 小生物。
1、种类多，分布广 2、高面积-体积比，代谢能力强
3、生长迅速，繁殖快
4、适应性强，容易培养
5、易变异
最常用的工业微生物

细菌
• 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌
加几丁质或碳酸钙、提高pH
（3）诱饵技术 将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成 后再铺平板。 如：花粉、蛇皮、ห้องสมุดไป่ตู้的头发、涂石蜡的棒 ①、广泛使用石蜡棒技术来分离诺卡氏菌； ②、从土壤中分离耐酸放线菌。
③、有人用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌， 其中有些是新种或亚种。
分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法