HRE增强HSV-TKGCV对乏氧环境Ewing肉瘤细胞杀伤作用的探究

第三军医大学硕士学位论文HRE增强HSV-TK/GCV对乏氧环境Ewing肉瘤细胞杀伤作用的研究姓名：司英健申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：光丽霞20040601ｙ６４６５５３第三军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。

论文作者签名：司芪逮日期：）。

ｖ．６、ｇ第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。

本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。

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论文作者签名：指导教师签名：司璃垃日期：兰竺竺：ｉ：蓝第三军医大学硕士学位论文英文缩写Ａｍｐｂｐ／ｋｂＣＩＡＰｄＮＴＰｄｄＨ２０ＤＭＳＯＥＢＥＤｌｌＡＥＧＦＰＥＰＯＦＢＳＦＯＤＧＣＶｈＨＩＦＨＲＥⅡｔＥＳＫａｎａＬＢｍｌｎＭＴＴＯＤＰＣＲＲＮａｓｅＡＳＤＳｓｅｃＨＳｖ－ＴＫＴＢＥＶＥＧＦ英文缩略语表英文名称ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｂａｓｅｐａｉｒ／ｋｉｌｏｂａｓｅｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＨＰ、ｄＴＴＰｄｉｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｄｉｍａｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅｅｔｈｉｄｕｍｂｒｏｍｉｄｅｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ－ａｃｅｆｉｃａｃｉｄｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒｈｏｕｒｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ，ｈｙｐｏｘｉａｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍａｌｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓｋａｎａｍｙｃｉｎｌｕｒｉａ．ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍｍｉｎｕｔｅｍｅｔｈｏｄｏｆｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｆｉｂｏｎｕｅｌｅａｓｅＡｓｏｄｉｕｍｄｅｄｅｌｙｌｓｕｌｆａｔｅｓｅｃｏｎｄｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｔｒｉｓ—ｂｏｍｔｅ／ＥＤＴＡｂｕｆｆｅｒｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ中文名称氨苄青霉素碱基对／千碱基牛小肠碱性磷酸酶四种脱氧核苷三磷酸双蒸水二甲基亚砜溴化乙锭乙二胺四乙酸增强型绿色荧光蛋白促红细胞生成素胎牛血清荧光光密度丙氧鸟苷小时缺氧诱导因子缺氧反应元件核糖体内部切入位点卡那霉素ＬＢ培养基分四唑盐法光密度聚合酶链反应ＲＮＡ酶Ａ十二烷基磺酸钠秒单纯疱疹病毒胸苷激酶ｔｒｉｓ．硼酸盐缓冲液血管内皮生长因子ＨＲＥｅｎｈａｎｃｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶｔｏＥｗｉｎｇＳａｒｃｏｍａＣｅｌｌｓｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｅｔＯｂｉｅｃｔｉｖｅ：Ｔｈｅｈｙｐｏｘｉｃｃｅｌｌｓｉｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｎｔｒｓｗｅｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｂｏｔｈｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｔｏｔｈｅｓｅｔｎｍｏｕｒｓ，ａｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ—ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ＨｓＶ＿ＴＫ）ｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＲＥ）ｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａＷａＳｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＨＲＥｅｎｈａｎｃｉｎｇｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆＨＳＶ－ＴＫ／ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）ｔＯＥｗｉｎｇｓａｒｃｏｍａｃｅｉｌｌｉｎｅＳＫ－ＥＳ一１ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａＣＯｎｄｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＨＲＥｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｌｉｔｅｒａｔｕｒｅａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｎｈａｎｃｅｒｓｉｔｅｏｆｐｌＲＥＳ２－ＥＧＦＰｖｅｃｔｏｒｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｐＨＲＥｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ．ＴｈｅＨＳＶ－ＴＫｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅＭｕｔｉｐｌｅＣｌｏｎｅＳｉｔｅｏｆｐｌＲＥＳ２－ＥＧＦＰａｎｄｐＨＲＥｔＯｏｂｔａｉｎｐＴＫａｎｄｐＨＲＥ—ＴＫｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ．ＴｈｅｈｕｍａｎＥｗｉｎｇｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＳＫ－ＥＳ—１ｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｐＴＫｏｒｐＨＲＥ－ＴＫｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗｉｔｈｌｉｐｏｓｏｍｅａｎｄｔｈｅｎＷａＳｅｘｐｏｓｅｄｔｏｎｏｒｍｏｘｉａ（２１％ｏｘｙｇｅｎ）ｏｒｈｙｐｏｘｉａ（３％ｏｘｙｇｅｎ）ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）ｗａｓｍｏｎｉｔｏｒｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｈｕｍａｎＥｗｉｎｇｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＳＫ－・ＥＳ‘・１ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｔｏｔｈｅｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）ｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈｐＴＫｏｒｐＨＲＥ—ＴＫｍｅｔｈｏｄｏｆｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｆＭＴＴ）ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉ也ＧＣＶｆｏｒｆｉｖｅｄａｙｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：１．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＨＲＥｃｏｎｔａｉｎｅｄＨＲＥ，ａｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＴＫａｎｄｐＨＲＥ－ＴＫｃｏｎｔａｉｎｅｄＨＳＶ－ＴＫｇｅｎｅｉｎｔｈｅｓｅｎｓｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．２．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇｓｔｕｄｙｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ（ＦＯＤ）ｓｈｏｗｅｄ：①．ＴｈｅＥＧＦＰＦＯＤｖａｌｕｅｏｆｐＨＲＥａｎｄｐＨＲＥ．ＴＫｇｒｏｕｐｃｅｉｌｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏｈｙｐｏｘｉａｗａｓｓｉｇｎｉｆｌｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏｎｏｒｍｏｘｉａ，ｐ＜Ｏ．０１．②．Ｗｈｅｎｅｘｐｏｓｅｄｔｏｈｙｐｏｘｉａ，ｔｈｅＥＧＦＰＦＯＤｖａｌｕｅｏｆａｎｄｐＨＲＥ。

ＴＫｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｐＴＫａｎｄｅｍｐｔｙｐＨＲＥｖｅｃｔｏｒｇｒｏｕｐ，ｐ＜０．０１．③．ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｔａｎｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｔｈｅｆｏｕｒｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｗｈｅｎｅｘｐｏｓｅｄｔＯｎｏｒｍｏｘｉａ．３．ＣｏｍｐａｒｉｎｇｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｔｏＧＣＶｓｈｏｗｅｄ：①．ＴｈｅｐＨＲＥ－ＴＫａｎｄｐＴＫｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍｕｃｈｍｏｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＧＣＶｔｈａｎｐＨＲＥｇｒｏｕｐｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｐ＜０．０１．ＴｈｅｈｉｇｈｅｒｔｈｅＧＣＶｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｍｏｒｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ～②．ＴｈｅｐＨＲＥ－ＴＫｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍｏｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＧＣＶｔｈａｎｐＴＫｇｒｏｕｐｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｐ＜０．０１，ｂｕｔｗｅｒｅａｌｍｏｓｔｓａｍｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｕｎｄｅｒｎｏｒｍｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．⑧．ＴｈｅｐＨＲＥ—ＴＫｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｈａｄｍｏｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏＧＣＶｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａｔｈａｎｎｏｒｍｏｘｉａ，ｐ＜０．０１．ＴｈｅｐＴＫｇｒｏｕｐｃｅｌｌｓｈａｄａｌｍｏｓｔｓｏ＿ｒｉｌｅｓｅｎｓＲｉｖｉｔｙｔｏＧＣＶｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａａｎｄｎｏｒｍｏｘｉａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：１．ＴｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨＳＶ－ＴＫｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙＩ－ＩＲＥｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａＷＩｔＳｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．２．ＨＲＥｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶｔｏｈｕｍａｎＥｗｉｎｇｓａｒｃｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａＣＯｎｄｉｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｙｐｏｘｉａｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ；ＨＳＶ－ＴＫ；ＥｗｉｎｇＳａｒｃｏｍａＣｅｌｌｓＨＲＥ增强ＨＳＶ—ＴＫ／ＧＣＶ对乏氧环境Ｅｗｉｎｇ肉瘤细胞杀伤作用的研究摘要目的恶性实体肿瘤中心乏氧区肿瘤细胞对放疗、化疗的耐受性是导致治疗失败的重要原因之一。

本研究拟构建一种由缺氧反应元件（ｈｙｐｏ）【ｉａｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＨＲＥ）调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ—ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＨＳＶ－ＴＫ）基因的真核表达载体，观察ＨＲＥ能否增强ＨＳＶ－ＴＫ／丙氧鸟苷（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）系统对乏氧环境中的人Ｅｗｉｎｇ肉瘤细胞系（ＳＫ．ＥＳ．１细胞）的杀伤作用，为弥补放、化疗的不足探索有效的治疗方法。

方法１将化学法合成的ＨＲＥ片断，插入到空载体（ｐＩＰＥＳ２．ＥＧＦＰ）的双顺反子荧光蛋白报告基因的真核启动子的增强子部位，按插入片段上下游载体序列合成引物１、２，以ＰＣＲ方法筛选含ＨＲＥ片断的阳性克隆，测序鉴定，获得重组质粒ｐＨＲＥ；用引物３、４，以ＰＣＲ法扩增ＴＫ基因片断，将其克隆到ｐＩＲＥＳ２．ＥＧＦＰ及ｐＨＲＥ的双顺反子荧光蛋白报告基因上游的多克隆位点，用ＰＣＲ筛选含单拷贝正向插入ＴＫ片段的阳性克隆，测序鉴定，获得重组质粒ｐＴＫ及ｐＨＲＥ－ＴＫ。

２用阳离子脂质体将ｐＨＲＥ—ＴＫ、ｐＨＲＥ、ｐＴＫ及ｐｌＲＥＳ２一ＥＧＦＰ导入ＳＫ—ＥＳ一１细胞，分别在乏氧（０２浓度为３％）和富氧（０２浓度为２１％）环境中培养１６小时，荧光显微镜观察报告基因增强型绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）表达变化，进行荧光光密度分析：再予以ＧＣＶ处理上述质粒转染细胞５天后，用四唑盐法（ＭＴＴ法）检测ＧＣＶ对ＳＫ－ＥＳ．１细胞的杀伤效果。