PTSD大鼠杏仁核神经元凋亡及TMP酶变化的研究

PTSD大鼠杏仁核神经元凋亡及TMP酶变化的研究1丁金兰，韩芳，石玉秀*中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳 (110001)E-mail: shiyuxiu@摘要：目的：研究创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD）大鼠杏仁核神经元细胞凋亡及三偏磷酸酶（Thiamine Monophosphatase TMP）活性的变化。

方法：成年健康雄性Wister大鼠50只，随机分为SPS模型的1d、4d、7d、14d组及正常对照组。

应用Annexin V-FITC/ PI双标记流式细胞技术分析PTSD大鼠杏仁核神经元细胞凋亡及定量检测；利用透射电镜观察杏仁核神经元超微结构改变；利用酶组织化学方法检测杏仁核神经元TMP酶活性的表达变化。

结果：SPS刺激后：杏仁核神经元细胞凋亡率显著增加，TMP酶活性明显比正常对照组增强，均于第4d达高峰。

7d和14d凋亡细胞逐渐减少、TMP酶活性减弱。

结论：PTSD杏仁核神经元发生细胞凋亡，凋亡率增加的同时TMP酶活性相应增强，提示 TMP 酶参与PTSD大鼠杏仁核神经元凋亡产物的吞噬。

关键词：PTSD；杏仁核；细胞凋亡；流式细胞术；TMP酶中图分类号：R322．811. 引言创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）是对创伤等严重应激因素的一种异常精神反应，是应激疾病中最为典型的一种[1]，于严重创伤应激急性期,在中枢神经系统（CNS)皮质边缘区,特别是杏仁核、海马和下丘脑等处短期内神经可塑性改变, 提示这些脑区可能为CNS 应激应答敏感区。

研究已表明，PTSD大鼠海马萎缩[2]，海马神经元发生凋亡[3]，那么杏仁核作为边缘系统中重要的皮质下核团，主司恐惧和焦虑，发生PTSD时杏仁核是否也发生细胞凋亡呢？并且杏仁核TMP酶活性的表达及其改变可能影响其功能状态。

因此本实验从这两方面切入，采用流式细胞仪、透射电镜检测PTSD大鼠杏仁核神经元是否出现神经细胞凋亡；酶组织化学技术观察PTSD杏仁核神经元TMP酶的相应变化，有望进一步揭示PTSD发病机理。

2. 材料和方法2.1 实验动物及分组成年健康雄性Wistar大鼠50只（中国医科大学实验动物中心提供），体重150-180g，常规饲养于环境温度22℃和8：00～2O：00定时光照的房间，食物和水可自由摄取。

随机分为5组，即SPS的1d、4d、7d、14d组及正常对照组，每组10只。

2.2 PTSD样大鼠模型的建立采用日本文部省召开的“PTSD的基础和临床的研究进展”会议确定的PTSD模型—SPS 刺激。

SPS刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理：大鼠禁锢2小时后，立即强迫游泳20min（水深40cm，水温25℃）。

经过15min的恢复，乙醚麻醉至意识丧失，在笼子中不再经任何刺激正常饲养分别于1d、4d、7d、14d取材。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡1本课题得到国家自然科学基金项目（30600341）、辽宁省教育厅科技攻关项目（05L491）的资助。

*通信联系人。

分别取正常及经过SPS刺激后1d、4d、7d、14d各组大鼠断头，开颅取出杏仁核，置于冰冻PBS中，用小剪刀剪成小碎块，0.25%胰酶0.3ml置于37℃恒温水浴消化30min，加入DMEM(含10%小牛血清)3ml终止消化。

经200目筛网过滤转入离心管中，800rpm,离心8min，弃上清，加入PBS液3ml,摇匀，再次800rpm,离心8min，弃上清，加入PBS液2ml,摇匀。

将上述置备好的单细胞悬液调整浓度为5×105～1×106个／ml，取1ml细胞，1000rpm，4ºC离心10分钟，弃上清，加入1ml冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，如此重复共离心三次，弃上清。

将细胞重悬于200µl Binding Buffer液中，加入10µl Annexin V-FITC和5µlPropidium Iodide，轻轻混匀，避光室温反应15分钟。

加入300µl Binding Buffer液，在1h内上机检测, 激发波长为488nm，流式细胞仪为美国BECTON DICKLNSON公司生产。

2.4 杏仁核神经元细胞的透射电镜制样大鼠经2.5%的戊巴比妥钠麻醉后，用含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸缓冲液的混合液灌流固定，取大鼠杏仁核组织，常规透射电镜制样，倒扣包埋、聚合、半薄切片定位，AO超薄切片机试行超薄切片，透射电镜（JEM 1200EX ）80KV下观察。

2.5 TMP酶组织细胞化学染色2.5.1灌流取材分别对SPS 1d、4d、7d、14d组及正常对照组进行常规灌流固定、Holt”S液中浸透至沉底，于恒冷箱切片机（型号Leica CM1900）中行冠状切片，片厚10µm，实验前，切片用梯度递减蔗糖缓冲液脱糖。

2.5.2孵育液的配置三偏磷酸钠 9mg、0.1mol/L醋酸2.25ml、醋酸铅75mg（5ml DH2O现配制）、蔗糖2.5g、DH2O 25ml，PH值调至3.9，总量加至50ml。

若出现微浊，用双重微孔滤纸（孔径0.2µm）过滤，备用。

2.5.3 酶组织化学染色将切片置于上述孵育液中37℃孵育30分钟，双蒸水漂洗2-3次，充分洗净后进行呈色反应，1%硫化胺染色1分钟，再次洗净，甘油明胶封片，OLYMUPS光镜下镜检。

2.6 酶活性图像分析及统计学分析使用LUZEXF 计算机图像分析仪(日本) 测酶的活性 , 进行定量分析。

每组随机抽取切片 8 张 , 每张切片测 3 个视野,测TMP酶反应强度的平均光密度值。

将流式细胞仪检测结果和酶图像分析所得数据均应用SPSS13.0软件包处理，进行单因素方差分析（ANOV A）检验，以P﹤0.05为有统计学意义。

3. 结果3.1 细胞凋亡的流式细胞仪检测结果从流式细胞仪分析的图中可见，左上象限为坏死细胞，左下象限为正常细胞，右上象限为早期凋亡细胞，右下象限为晚期凋亡细胞。

检测结果如表1、图1、所示，SPS各组的细胞凋亡率均高于正常对照组，且SPS 4d组凋亡率最高，随时间延长细胞凋亡率降低，差异具有统计学意义。

表1 Annexin/PI双参数法测定的PTSD大鼠杏仁核神经元不同时间段细胞凋亡率的比较Table 1 Annexin V-FITC/ PI two-parameter method flow cytometry detects the apoptotic rat at different timeperiods in PTSDrats’amygdala.时间（Time）凋亡率（The apoptosis rate）（%）正常组SPS1d组 12.67±2.16﹡SPS4d组 18.38±2.64﹡SPS7d组 15.64±2.39﹡SPS14d组 14.60±3.17﹡﹡P﹤0.05 vs normal control group图1. Annexin/PI双参数法PTSD大鼠杏仁核神经元凋亡细胞流式细胞仪测定图1A Annexin/PI双参数法正常对照组大鼠杏仁核神经元凋亡细胞流式细胞仪测定图1B Annexin/PI双参数法1d组大鼠杏仁核神经元凋亡细胞流式细胞仪测定图1C Annexin/PI双参数法4d组大鼠杏仁核神经元凋亡细胞流式细胞仪测定图1D Annexin/PI双参数法7d组大鼠杏仁核神经元凋亡细胞流式细胞仪测定图Fig.1 Annexin/PI two-parameter method flow cytometry detects the neuronal apoptosis in amygdala of PTSD 1A Annexin/PI two-parameter method flow cytometry detects the neuronal apoptosis in normal group 1B Annexin/PI two-parameter method flow cytometry detects the neuronal apoptosis in SPS 1d group 1C Annexin/PI two-parameter method flow cytometry detects the neuronal apoptosis in SPS 4d group 1D Annexin/PI two-parameter method flow cytometry detects the neuronal apoptosis in SPS 7d group3.2 杏仁核神经元细胞的透射电镜结果电镜下可见，杏仁核神经元细胞核缩小，核内染色质浓缩边集，有者可见新月状，核中心区可见染色质溶解。

胞质内有者溶解，线粒体结构模糊，内质网断裂(图2A)。

细胞核内染色质几乎全部溶解，核膜下只见少量边集的染色质，核膜下陷，核皱缩。

胞质内大部分细胞质溶解，偶见粗面内质网的不完整结构的残留，线粒体呈现噬缺，出现凋亡的部分结构改变（图2B）。

图2. PTSD大鼠杏仁核神经元凋亡透射电镜图2A 细胞核内染色质边集，形成新月状，2B 细胞核内染色质溶解，核膜下陷，细胞呈现凋亡的部分结构改变Fig.2 The neuronal apoptosis in SPS rat’s amygdala observed by transmission electron microscopy.2A Chromatin-set，showing crescent formation in nucleus2B Nucleus chromatin dissolved, nuclear subsidence, the cells showed some structural changes in apoptosis3.3 杏仁核神经元TMP酶组化的光镜变化正常组大鼠杏仁核神经元TMP酶呈阳性反应，产物呈均匀一致的棕褐色硫化铅颗粒，分布在细胞质周部，延伸到突起，细胞核呈阴性反应（图3A）。

SPS后实验组与对照组相比TMP酶活性均增强（P﹤0.05），其中于4天达高峰，呈强阳性反应（图3B），7天组和14天组酶活性趋向恢复。

表2杏仁核TMP酶表达的平均光密度值（OD）分析结果（⎯x±S）Table 2 The average of optical density (OD) analysis of TMPase expression in amygdala组别平均光密度（OD）正常组130.31±7.9411.38﹡SPS1d组 149.43±SPS4d组 184.56±10.27﹡SPS7d组 166.28±8.64﹡SPS14d组 158.79±9.52﹡﹡P﹤0.05 vs normal control group图3 PTSD大鼠杏仁核神经元TMP酶组化反应图3A 正常对照组TMP酶组化反应阳性细胞 ×4003B SPS 4d 组TMP酶组化反应阳性细胞×4003C SPS 14d 组TMP酶组化反应阳性细胞 ×400Fig.3 TMP enzyme histochemistry in SPS rats’ amygdala3A TMP positive neurons in amygdala in control group. ×4003B TMP positive neurons in amygdala in SPS 4d group. ×4003C TMP positive neurons in amygdala in SPS 14d group. ×4004. 讨论创伤后应激障碍(PTSD)是指由于灾害﹑战争﹑恐怖事件﹑交通意外﹑虐待等引起的巨大痛苦或受惊吓﹑遭受悲剧导致的精神﹑身心症状的持续状态或焦虑综合症[4] 。