Caspase-2在神经细胞凋亡中的作用
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ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａ ｔ３ ４２ ｆｏｒ ２４ｈ
Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗ！ｔｈ Ｈｏｃｈｅｓｔ
华东师范大学 硕士学位论文 Caspase-2在神经细胞凋亡中的作 姓名：秦真侠 申请学位级别：硕士 专业：生理学 指导教师：胡应和;林龙年
20050501
答辩委员会成员名单
蠢真箧硕士学位论文答辩委员会成员名单
姓名
职称
单位
备注
袁崇刚 教授
华东师范大学生命科学学院
主席
钱昱 教授
华东师范大学生命科学学院
Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｉｓ ｏｎｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅｓ ｆａｍｉｌｙ。Ｉｔ ｓｈｏｗｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ｂｏｔｈ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｃａｓｐａｓｅｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃａｓｐａｓｅｓ．Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｓ
关键词：神经细胞凋亡：Ｃａｓｐｓｅ一２；Ｃａｓｐａｓｅ－３：Ｂ淀粉样肽
２
华东师范大学硕士学位论文
脑功能基因组学研究所
Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｔｓｉｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｓ ａ ｇｅｎｅｔｉｅａｉｌｙ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｈａｔ ｅｘｉｓｔｓ ｉｎ ａｌｌ
吴自荣 教授
华东师范大学生命科学学院
章平 副教授 华东师范大学脑功能基因组学研究所 答辩秘书
学位论文独创性声明
独创性声明
本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。
ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｔｓ ｍａｊｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｂｙ
ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｍａｇｅｄ ｏｒ ｓｕｐｅｒｆｌｕｏｕｓ ｃｅｉｌｓ．Ｃｙｃｔｅｉｎｙｌ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｋｎｏｗｎ ａｓ Ｃａｓｐａｓｅｓ，ａｒｅ ｂｅｌｉｅｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｘｅｃｕｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｃａｓｐａｓｅ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｉｍｐｌｉｃａｔｄ ａｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｎｙ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂ—ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙ ｅｘｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ａｓ ｔｏ ｗｈａｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ．
本文采用ＰＣＲ技术从大鼠的大脑中克隆出ｃａｓｐ踞ｅ．２全长ｅＤＮＡ，然后克 隆入载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），构建ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃａｓｐ酗ｅ－２真核表达载体。将 ｐｃＤＮＡ３．１，Ｃ船ｐａｓｅ一２载体转染入ＳＨ．Ｓｙ５Ｙ细胞。使ＣａｓｐａＳｅ一２在ｓＨ－ＳｙＳＹ细胞 中过量表达。实时荧光定量ＰＣＲ检测Ｃ船ｐ船ｅ．２和Ｃａｓｐａｓｅ一３的基因表达水平、 蛋白酶活力检测法检测Ｃ粥ｐａｓｃ．２和ＣａｓｐａＳｅ．３的活力。Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２染色及 Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ．ｂｉｏｔｉｎ检测细胞调亡。结果显示，Ｃａｓｐａｓｅ一２基因过表达可诱导ＳＨ．Ｓｙ５Ｙ 细胞凋亡，同时Ｃａｓｐ粥ｅ一３ ｍＲＮＡ表达及蛋白酶活力水平上升。 ２．１３．淀粉样蛋白诱导ｓＨ～ｓｙ５Ｙ细胞凋亡
３
英文摘要
ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａ ０ ４２．Ｗｅ ｈａｖｅ
ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ Ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ Ｃａｓｐａｓｅｓ．
ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｎｅｘｉｎ
３３３４２ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｒｍｅｘｉｎ ｖ－ｂｉｏｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ＰＣＲ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐｅｒｆｏｍｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｒａｔ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｃＤＮＡ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ
ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅ． Ｔｈｅ ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｖｅｃｔｏｒ Ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｉｎｔｏ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ一３ Ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｒｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｌｌａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆＣａｓｐａｓｅ－２．
Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｈａｖｅ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｎ
本实验在ｓＨ．Ｓｙ５Ｙ细胞中过表达Ｃａｓｐａｓｅ一２，考察其对Ａ Ｂ ４２诱导的神经细 胞凋亡的影响。用Ａ Ｂ ４２处理已经过量表达ＣａＳｐａＳｅ－２的ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ细胞，Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ．ｂｉｏｔｉｎ早期凋亡检测方法检测细胞凋亡；实时荧光定量ＰＣＲ检测ｃａｓｐａＳｅ一２表
中文摘要
达水平；蛋白酶活力检测法检测Ｃａｓｐａｓｅ·３蛋白酶活力以及免疫印迹技术分析 Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达。结果显示过表达Ｃａｓｐａｓｅ－２的细胞被Ａ Ｂ ４２处理２４ｈ后，其 细胞凋亡率没有显著变化，同时Ｃａｓｐａｓｅ一２的过表达被抑制；同时Ａ １３ ４２下调 Ｃａｓｐａｓｅ一３的表达并抑制其活力。
作者签名：
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行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在
Ａ Ｂ ４２ ＯＮ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ、ｖｉⅡ１ Ｈｏｃｈｅｓｔ ３３３４２ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ａｎｄ Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ－ｂｉｏｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ Ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ
解密后适用本规定。
日期：塑』：￡纠
学位论文作者签名：亲真侠
导师签名：≮Ⅳ 日期：兰竖』：１２ 钟龟‘辱
Ｃ
华东师范大学硕士学位论文
脑功能基因组学研究所
Ｃａｓｐａｓｅ－２在神经细胞凋亡中的作用
摘要
细胞凋亡是多细胞组织中的一种程序性死亡。它的主要功能是清除机体内损 坏或过多的细胞，从而有助于机体的存活。ｃａｓｐａｓｅ，天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶（ｃｙｃｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｃａｓｐａｓｅ）是细胞凋亡途径中的关键酶。 Ｃａｓｐａｓｅ参与多种类型的神经细胞凋亡，其中包括昌淀粉样肽诱导的细胞死亡。 但是其具体作用机制还有争议。
Ｃａｓｐａｓｅ．２是ＣａＳｐａＳｅ家族中的一个特殊成员，具有类似于启始Ｃａｓｐａｓｅｓ与 效应Ｃａｓｐａｓｅｓ的结构与功能特征。ｃ鹊ｐａｓｅ．２参与神经细胞凋亡过程，但是其功 能及参与的信号通路还值得进一步研究。
本文利用过量表达ｃ嬲ｐａｓｅ一２的神经瘤母细胞ＳＨ．Ｓｙ５Ｙ研究了在神经细胞凋 亡中ｃａｓｐａｓｅ．２的作用，以及Ｃａｓｐａｓｅ．２过表达对Ｂ淀粉样肽诱导的神经细胞凋 亡的影响。 １．Ｃａｓｐａｓｅ－２基因诱导ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ细胞凋亡
ｖ－ｂｉｏｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｂｏｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｗｅｒｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ－２． ２．Ｂ－ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－３．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ·３ Ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｅ ｈａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｉｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｃｓｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｃｓｓｉｏｎ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂ—ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ． １．Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
用不同浓度的Ａ １３ ４２处理ＳＨ．ＳｙＳＹ细胞２４ｈ，ＭＴＴ法检测细胞的活力； Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２染色法及Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ．ｂｉｏｔｉｎ早期凋亡检测方法检测细胞凋亡：实时 荧光定量ＰＣＲ检测ｃａｓｐ觞昏２表达水平；蛋白酶活力检测法检测Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白 酶活力。结果显示，Ａ １３ ４２能够使细胞活力显著下降，＿并诱导ＳＨ－－Ｓｙ５Ｙ细胞凋 亡：同时Ｃａｓｐａｓｅ．２ ｍＰ，ＮＡ表达水平显著升高，而Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白酶活力显著下 降。 ３．Ｃａｓｐａｓｅ－２过表达对Ａ１３ ４２诱导的神经细胞凋亡的影响
Ｓｕｒｐｒｉｓｅｌｙ，Ｃａｓｐａｓｅ一３ ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ Ａ １３ ４２ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
３．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａ ０ ４２ ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗ！ｔｈ Ｈｏｃｈｅｓｔ
华东师范大学 硕士学位论文 Caspase-2在神经细胞凋亡中的作 姓名：秦真侠 申请学位级别：硕士 专业：生理学 指导教师：胡应和;林龙年
20050501
答辩委员会成员名单
蠢真箧硕士学位论文答辩委员会成员名单
姓名
职称
单位
备注
袁崇刚 教授
华东师范大学生命科学学院
主席
钱昱 教授
华东师范大学生命科学学院
Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｉｓ ｏｎｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅｓ ｆａｍｉｌｙ。Ｉｔ ｓｈｏｗｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ｂｏｔｈ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｃａｓｐａｓｅｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃａｓｐａｓｅｓ．Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｓ
关键词：神经细胞凋亡：Ｃａｓｐｓｅ一２；Ｃａｓｐａｓｅ－３：Ｂ淀粉样肽
２
华东师范大学硕士学位论文
脑功能基因组学研究所
Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｔｓｉｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｓ ａ ｇｅｎｅｔｉｅａｉｌｙ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｈａｔ ｅｘｉｓｔｓ ｉｎ ａｌｌ
吴自荣 教授
华东师范大学生命科学学院
章平 副教授 华东师范大学脑功能基因组学研究所 答辩秘书
学位论文独创性声明
独创性声明
本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。
ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｔｓ ｍａｊｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｂｙ
ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｍａｇｅｄ ｏｒ ｓｕｐｅｒｆｌｕｏｕｓ ｃｅｉｌｓ．Ｃｙｃｔｅｉｎｙｌ ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｋｎｏｗｎ ａｓ Ｃａｓｐａｓｅｓ，ａｒｅ ｂｅｌｉｅｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｘｅｃｕｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｃａｓｐａｓｅ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｉｍｐｌｉｃａｔｄ ａｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｎｙ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂ—ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙ ｅｘｉｓｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ａｓ ｔｏ ｗｈａｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ．
本文采用ＰＣＲ技术从大鼠的大脑中克隆出ｃａｓｐ踞ｅ．２全长ｅＤＮＡ，然后克 隆入载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），构建ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃａｓｐ酗ｅ－２真核表达载体。将 ｐｃＤＮＡ３．１，Ｃ船ｐａｓｅ一２载体转染入ＳＨ．Ｓｙ５Ｙ细胞。使ＣａｓｐａＳｅ一２在ｓＨ－ＳｙＳＹ细胞 中过量表达。实时荧光定量ＰＣＲ检测Ｃ船ｐ船ｅ．２和Ｃａｓｐａｓｅ一３的基因表达水平、 蛋白酶活力检测法检测Ｃ粥ｐａｓｃ．２和ＣａｓｐａＳｅ．３的活力。Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２染色及 Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ．ｂｉｏｔｉｎ检测细胞调亡。结果显示，Ｃａｓｐａｓｅ一２基因过表达可诱导ＳＨ．Ｓｙ５Ｙ 细胞凋亡，同时Ｃａｓｐ粥ｅ一３ ｍＲＮＡ表达及蛋白酶活力水平上升。 ２．１３．淀粉样蛋白诱导ｓＨ～ｓｙ５Ｙ细胞凋亡
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英文摘要
ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａ ０ ４２．Ｗｅ ｈａｖｅ
ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｍＲＮＡ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ Ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ Ｃａｓｐａｓｅｓ．
ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｎｅｘｉｎ
３３３４２ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｒｍｅｘｉｎ ｖ－ｂｉｏｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ＰＣＲ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐｅｒｆｏｍｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｒａｔ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｃＤＮＡ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ
ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅ． Ｔｈｅ ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｖｅｃｔｏｒ Ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｉｎｔｏ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ一３ Ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｒｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｌｌａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆＣａｓｐａｓｅ－２．
Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｈａｖｅ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｎ
本实验在ｓＨ．Ｓｙ５Ｙ细胞中过表达Ｃａｓｐａｓｅ一２，考察其对Ａ Ｂ ４２诱导的神经细 胞凋亡的影响。用Ａ Ｂ ４２处理已经过量表达ＣａＳｐａＳｅ－２的ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ细胞，Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ．ｂｉｏｔｉｎ早期凋亡检测方法检测细胞凋亡；实时荧光定量ＰＣＲ检测ｃａｓｐａＳｅ一２表
中文摘要
达水平；蛋白酶活力检测法检测Ｃａｓｐａｓｅ·３蛋白酶活力以及免疫印迹技术分析 Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达。结果显示过表达Ｃａｓｐａｓｅ－２的细胞被Ａ Ｂ ４２处理２４ｈ后，其 细胞凋亡率没有显著变化，同时Ｃａｓｐａｓｅ一２的过表达被抑制；同时Ａ １３ ４２下调 Ｃａｓｐａｓｅ一３的表达并抑制其活力。
作者签名：
学位论文授权使用声明
本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学
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文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进
行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在
Ａ Ｂ ４２ ＯＮ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ、ｖｉⅡ１ Ｈｏｃｈｅｓｔ ３３３４２ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ａｎｄ Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ－ｂｉｏｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一２ Ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ
解密后适用本规定。
日期：塑』：￡纠
学位论文作者签名：亲真侠
导师签名：≮Ⅳ 日期：兰竖』：１２ 钟龟‘辱
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华东师范大学硕士学位论文
脑功能基因组学研究所
Ｃａｓｐａｓｅ－２在神经细胞凋亡中的作用
摘要
细胞凋亡是多细胞组织中的一种程序性死亡。它的主要功能是清除机体内损 坏或过多的细胞，从而有助于机体的存活。ｃａｓｐａｓｅ，天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶（ｃｙｃｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｃａｓｐａｓｅ）是细胞凋亡途径中的关键酶。 Ｃａｓｐａｓｅ参与多种类型的神经细胞凋亡，其中包括昌淀粉样肽诱导的细胞死亡。 但是其具体作用机制还有争议。
Ｃａｓｐａｓｅ．２是ＣａＳｐａＳｅ家族中的一个特殊成员，具有类似于启始Ｃａｓｐａｓｅｓ与 效应Ｃａｓｐａｓｅｓ的结构与功能特征。ｃ鹊ｐａｓｅ．２参与神经细胞凋亡过程，但是其功 能及参与的信号通路还值得进一步研究。
本文利用过量表达ｃ嬲ｐａｓｅ一２的神经瘤母细胞ＳＨ．Ｓｙ５Ｙ研究了在神经细胞凋 亡中ｃａｓｐａｓｅ．２的作用，以及Ｃａｓｐａｓｅ．２过表达对Ｂ淀粉样肽诱导的神经细胞凋 亡的影响。 １．Ｃａｓｐａｓｅ－２基因诱导ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ细胞凋亡
ｖ－ｂｉｏｔｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｂｏｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｗｅｒｅ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ－２． ２．Ｂ－ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－３．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ·３ Ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｅ ｈａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＳＨ—Ｓｙ５Ｙ ｃｅｉｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｃｓｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｃｓｓｉｏｎ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂ—ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ． １．Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｉｎｄｕｃｅｄ ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
用不同浓度的Ａ １３ ４２处理ＳＨ．ＳｙＳＹ细胞２４ｈ，ＭＴＴ法检测细胞的活力； Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２染色法及Ａｎｎｅｘｉｎ ｖ．ｂｉｏｔｉｎ早期凋亡检测方法检测细胞凋亡：实时 荧光定量ＰＣＲ检测ｃａｓｐ觞昏２表达水平；蛋白酶活力检测法检测Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白 酶活力。结果显示，Ａ １３ ４２能够使细胞活力显著下降，＿并诱导ＳＨ－－Ｓｙ５Ｙ细胞凋 亡：同时Ｃａｓｐａｓｅ．２ ｍＰ，ＮＡ表达水平显著升高，而Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白酶活力显著下 降。 ３．Ｃａｓｐａｓｅ－２过表达对Ａ１３ ４２诱导的神经细胞凋亡的影响
Ｓｕｒｐｒｉｓｅｌｙ，Ｃａｓｐａｓｅ一３ ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ Ａ １３ ４２ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
３．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａ ０ ４２ ＳＨ－Ｓｙ５Ｙ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ一２ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ