人脂联素真核表达载体的构建及其表达

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人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。

刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。

方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。

结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。

ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。

结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。

关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅＬ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ・ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。

人cbl基因真核表达载体的构建及表达

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达【Abstract】AIM： To construct the eukaryotic expressing vector of human cbl and test its expression in African green monkey kidney cell line COS7. METHODS: Human cbl gene tagged with flag was amplified from pEFHAcbl plasmid by PCR. The product was cloned into pGEMT easy, sequenced and then subcloned into eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(+). The recombined vector was then transfected into COS7 cells with lipofectin and the expression of cbl gene was detected by Western blot. RESULTS: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl was successfully constructed and its expression in COS7 cells could be detected. CONCLUSION: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl is constructed and it expresses flagcbl fused protein correctly in COS-7 cells.【Keywords】 cbl; polymerase chain reaction; cloning, molecular; gene expression【摘要】目的：构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表达.方法：以含有人全长cbl cDNA 的质粒pEFHAcbl 为模板，采用PCR方法扩增cbl基因，并在其N末端带上含24 bp的flag标签，克隆到pGEMT easy载体并测序，再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+)，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS7细胞，Western blot检测flagcbl在细胞中的表达. 结果：测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确；重组质粒pcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段；脂质体法转染COS7后检测到预期目的蛋白的表达.结论：成功构建了N末端带flag标签的cbl真核表达载体，并使其在真核细胞COS7中表达.【关键词】 cbl; 聚合酶链反应; 克隆，分子; 基因表达0引言Cbl (casitas Blineage lymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白，在哺乳类中有Cbl、Cblb和Cbl3 3种.Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时该分子中的RING结构域能够与泛素结合酶E2结合,作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化－蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1］.近年来的研究表明，突变的Cbl可成为癌基因［2］；而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子（如受体型蛋白酪氨酸激酶，RTK）发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.我们成功构建了N－末端融合有flag标签的cbl 基因的真核表达载体，并采用脂质体法转染培养的COS7细胞，检测其是否正确表达，为进一步研究cbl 对肿瘤细胞生长的影响奠定基础.1材料和方法11材料大肠杆菌菌株DH5α、pcDNA31(+)真核表达载体、COS7细胞由本室保存；含人全长cbl cDNA的质粒由美国La Jolla变态反应与免疫学研究所保存；pGEMT easy购自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA Marker购自Takara公司；1640培养基购自Gibico 公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；抗flag M2 mAb和抗ACTIN抗体、HRP标记的羊抗鼠、兔第二抗体分别购自Sigma公司和博士德公司；Western blot 所用发光底物为pierce公司产品；用于PCR 反应的引物由上海生物工程公司合成；质粒提取和DNA 回收试剂盒由杭州维特洁公司提供.12方法121引物设计上游引物序列： 5′GGT ACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCC GGC AAC GTG AAG AAG AGC3′，其中GGT ACC为KpnI酶切位点.下划线部分为编码flag标签的核苷酸序列；下游引物序列： 5′ CTC GAG CTA GGT AGC TAC ATG GGC AGG AGA AGA AAT GG 3′，其中CTC GAG为XhoI酶切位点.122PCR扩增flagcbl基因及产物修饰在25反应体系中加入25 μL 10×反应缓冲液，20 μL dNTP，pEFHAcbl 质粒模板10 μL，上下游引物各10 μL，pyrobest高保真酶025 μL，补水至25 μL.扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，35 cycles.扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离；回收后溶于35 μL去离子水中，并进行加“A”反应： 50 μL 反应体系中加入5 μL 10×反应缓冲液，4 μL dATP，3 μL MgCl2，扩增产物30 μL，rTaq 酶05 μL，补水至50 μL，72℃ 40 min.123PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pGEMT easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定及测序.124pcDNA31(+)flagcbl真核表达载体的构建用BglI先将pGEMT easy酶切成小片段，因flagcbl内部无BglI酶切位点，故包含在酶切后产生的最大片段内，将该片段回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体中，构建出重组表达载体pcDNA31(+)flagcbl.125基因转染COS7细胞在含100 mL/L新生小牛血清的1640 培养基中，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度下培养，80%汇合时按照LipofectamineTM2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染. 126Western blot检测转染后细胞中转入基因的表达分别于转染后24，48 h收细胞并裂解细胞内总蛋白，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳并电转移至NC膜，5 g/L脱脂奶封闭1 h，分别与适当稀释后的一抗孵育1 h、PBST洗膜，然后与1∶4000二抗孵育1 h，PBST洗膜后加入发光底物孵育1 min，暗室中用X光片曝光，显影，定影.2结果21人cbl基因的克隆及序列测定用PCR技术以pEFHAcbl 质粒为模板扩增得到2737 bp片段（Fig 1），加“A”后克隆到pGEMT easy 载体中，EcoRI/XhoI酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示切出大小为450、1190和3000 bp的几种片段（Fig 2），表明系阳性克隆，测序结果表明，所克隆的人cbl基因序列以及flagcbl融合基因的读框完全正确.22真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl的构建利用酶切后产生的载体和片段之间互补的黏性末端进行亚克隆.构建成功的pGEMT easy flagcbl先用BglⅠ将pGEMT easy酶切成小片段，而flagcbl 内部无BglⅠ酶切位点，包含在最大片段内，将该片段回收后再用KpnI/XhoⅠ双酶切将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体.KpnⅠ/XhoⅠ双酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定均表明pcDNA31(+)flagcbl表达载体构建成功（Fig 3）.23真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl在COS7细胞中的表达构建成功的pcDNA31(+)flagcbl和空质粒pcDNA31(+)分别瞬时转染COS7细胞，转染后24 h和48 h antiflag抗体均检测到flagcbl在蛋白水平的表达，Mr约为120×103；而对照的空质粒转染后则没有相应的条带（Fig 4）.表明所构建的真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl 可以在真核细胞内正确表达.3讨论Cbl家族蛋白属于泛素连接酶E3家族的一大类，这类分子中具有RING结构域，又称为RING型E3 .遗传和进化研究显示，Cbl家族蛋白是一类保守的蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路的负调控因素.这一现象最早是在对C. elegans研究中发现的，功能缺失的Cbl同源分子Sli1可以恢复EGFR同源分子Let23的信号转导，而增加Sli1基因的拷贝数则可抑制此通路［4］；对Drosphila的研究也发现DCbl 同样可负调控EGFR介导的信号通路［5］.此后，越来越多的研究表明，CCbl可以促进多种受体型蛋白酪氨酸激酶（RTK）如EGFR、PDGFRα、β［6］、CSF1R［7］等发生配体诱导的泛素化和随后的蛋白酶体降解.Cbl的这种负调控RTK作用对于维持正常细胞内稳机制具有重要意义.而上述分子很多在肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用，有些是癌基因的产物；并且许多肿瘤细胞内与增殖有关的RTK发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.这就提示，加强Cbl分子的负调控作用机制，下调某些肿瘤细胞内过度活化或发生突变的RTK可能会抑制相应肿瘤的恶性增殖.已有研究表明CCbl不仅可以使细胞表面的Neu迅速泛素化、下调，并抑制其下游信号通路，而且可以抑制转染了Neu的神经母细胞瘤在小鼠体内的生长［8］.与此相一致，Klapper等认为HER2单抗Heceptin的抗癌机制与Cbl结合并促使HER2泛素化、降解有关［9］.另外，膜锚定的Cbl可以逆转由Hck导致的鼠成纤维细胞恶性转化，表现为细胞形态的改变以及锚着非依赖性生长受抑［10］.在鼠NIH3T3细胞中过表达Cbl可抑制PDGFα和PDGFβ诱导的细胞增殖及抵抗凋亡［6］.这些研究结果强烈地提示： Cbl可能能够抑制各种增殖性疾病（包括肿瘤在内）的细胞内多条信号通路，有可能将其作为与异常活化PTK相关疾病的治疗手段.我们以pEFHAcbl 质粒为模板，通过PCR法获得了N－末端融合有flag标签的人cbl基因，并构建了的flagcbl基因的真核表达载体，该表达载体在真核细胞COS7中能够正确表达.这为我们进一步研究cbl对肿瘤细胞生长的影响，探讨一种肿瘤治疗的新思路奠定了基础.【参考文献】［1］ Joazeiro C, Wing S, Huang H, et al. The tyrosine kinase negative regulator cCbl as a RINGtype, E2dependent ubiquitinprotein ligase ［J］. Science, 1999 ;286(5438):309-312.［2］ Thien CB, Langdon WY. Cbl: Many adaptations to regulate protein tyrosine kinases［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001;2(4):294-307.［3］Peschard P, Park M. Escape from Cblmediated downregulation: A recurrent theme for oncogenic deregulation of receptor tyrosine kinases［J］. Cancer Cell, 2003 ;3(6):519-523.［4］ Jongeward GD, Clandinin TR, Sternberg PW. Sli1, a negative regulator of let23mediated signaling in C. elegans ［J］. Genetics, 1995;139(4):1553-1566.［5］ Pai LM, Barcelo G, Schupbach T. Dcbl, a negative regulator of the Egfr pathway, is required for dorsoventral patterning in Drosophila oogenesis［J］. Cell, 2000;103(1):51-61.［6］ Miyake S, MullaneRobinson KP, Lill NL, et al. Cblmediated negative regulation of plateletderived growth factor receptordependent cell proliferation. A critical role for Cbl tyrosine kinasebinding domain［J］. J Biol Chem, 1999;274(23):16619-16628.［7］ Lee PS, Wang Y, Dominguez MG, et al.The Cbl protooncoprotein stimulates CSF1 receptor multiubiquitination and endocytosis, and attenuates macrophage proliferation［J］. EMBO J, 1999;18(13):3616-3628.［8］ Levkowitz G, Oved S, Klapper LN, et al. cCbl is a suppressor of the neuoncogene［J］. J Biol Chem, 2000;275(45):35532-35539.［9］Klapper LN, Waterman H, Sela M, et al. Tumorinhibitory antibodies to HER2/ErbB2 may act by recruiting cCbl and enhancing ubiquitination of HER2［J］. Cancer Res, 2000;60(13):3384-3388.［10］ Howlett CJ, Robbins SM. Membraneanchored Cblsuppresses Hck proteintyrosine kinase mediated cellular transformation［J］. Oncogene, 2002;21(11):1707-1716.。

人穿孔素真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

ｉｒｎｃｅ１Ｃ０Ｓ７ｃｌ．ｎｔａｓｔ（－ｅｌｓ
Ｋｅｒｙｗｏｄｓ：ＰｆｏｉＥｕａｖｔｘｒｓｉｎｅｒｎ；ｋｒｏｉｅｐｅｓｏｃ
关键词：穿孔素；真核表达中图分类号：Ｑ８７２文献标识码：Ａ
文章编号：１０ —１９２０）２０１－３０８８ｒｏｉｅｐｅｓｎｖｃｏｏｔｉｉｇｔｅｈｍａｅｆｒｎｇｎｎｏｓｃｉｆｔｕａｙｔｘｒｓｉｅｔｒｃｎａｎｎｕｎｐｒｏｉｅｅａｄｒｏｈｃｏｈ
冈，将所获基克隆入真核表达载体ｐＤＡ．（，ｃＮ３１＋）转染ＣＳ７细胞，ＴＰＲ检测ｐｎ基在ＣＳ７细胞中的表Ｏ一Ｒ —ＣｉＯ一达。结果：功获得人全长基闵。构建了真核表达载体。转染ＣＳ７后，测出ｐ成并Ｏ一检ｉｎ基冈的表达。结论：人ｐｎ全长基ｌ可以在转染的ＣＳ７细胞中表达。ｉ大ＪＯ一
１（＋）ｐｎｈｃｍｉａｔｌｍｄｗｓｒｎｆｔｔＣＳ７ｃｌｎｅｅｐｅｓｎｏｅｆｅｅ／ｆ．ＴｅｒｏｂｎｎｐａｉａｔｓｅｅｉｏＯ一ｅｓｄｔｘｒｓｏｆｈ－ｇｎｅｓａｅｄｎｌａｈｉｔｐ
ｃｏｅｎｎｅｅｎｏｔｅｐＤＮＡ３ｌｎｄａｄｉｓ￣ｄｉｔｈｅ．１（＋）ｖｃｏ．ＴｅｅｐｅｓｎｏｍＲＮｎｔｅｔｎｆｃｅｅｔｒｈｘｒｓｉｆｐｏＡｉｈｒｓｔｄａｅ

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｍａｒ２００６，Ｖｏｌ３４Ｎｏ３刘德敏杨莉丽孙颖张捷摘要目的：克隆人脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ蛋白进行鉴定。

方法：从人皮下脂肪组织提取总ＲＮＡ，确认其正确性后经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到全长ｃＤＮＡ片段，此片段经纯化回收后克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体，经行ＤＮＡ序列分析，进一步克隆构建到表达载体至ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２中，用ＩＰＴＧ在大肠杆菌中诱导表达。

结果：含重组ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ质粒的大肠杆菌经０．４ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ｈ后有高表达。

结论：ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。

关键词胞间信号肽类和蛋白质类克隆，分子基因表达大肠杆菌ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＣｌｏｎｅｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉＬＩＵＤｅｍｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｌｉ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｌｏｎｅｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅａｎｄａｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｌｉｇａｔｅｄｔｏｐＭＤ－１８Ｔｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｏｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｈｉｇｈｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ０．４ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＨｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅｉｎＥ．ｃｏｌｉｉｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｌｏｎｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达＊＊天津市自然科学基金资助项目（项目编号：２００３０３２５）作者单位：３０００７０天津医科大学代谢病医院新近研究表明，脂肪组织不仅是储存和释放脂肪的场所，而且是非常重要的内分泌器官，其在机体的内分泌代谢以及能量平衡中发挥重要作用。

重组人脂联素基因构建、表达、纯化及活性鉴定

关键词：脂联素；因构建；白表达；基蛋生物活性
中图分类号：８Ｑ７６
文献标识码：Ａ
文章编号：４８４９２０）１０６４０３— ７（０７０— ９— ０００
脂联素（ｉｏｅｔ，Ｐ是１９ＡｄｐｎｅｉＡＤＮ）ｎ９５年Ｓｈｒｒｃｅｅ等［发现的一种由脂肪组织分泌的细胞因子，２４１］由４
脂联素在肿瘤发生过程中所起的生理、理作用及调病控机制仍未阐明．为进一步研究脂联素的生物活性，我们利用重叠ＰＲ技术获得ＡＤＮ基因，建重组表ＣＰ构达载体ｐＴ２ｂ＋）ＡＤＮ，大肠杆菌中表达，Ｅ一２（／Ｐ在并在体外观测纯化后ＡＤＮ蛋白对内皮细胞生长的抑Ｐ
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第４卷６
第１期
厦门大学学报（自然科学版）
ＪｕｎｌｏａｎＵｎｖｒｉｙ（ｔｒｌｉｎｅｏｒａｆＸｉｍｅｉｅｓｔＮａｕａｅｃ）Ｓｃ
Ｖｏ．Ｎｏ．１１４６
根据ＧｅＢｎｎａｋ公布的人脂联素ｅＮ序列，ＤＡ去除Ｎ端信号肽序列，在５端和３－并Ｌ，端分别引入ＢｍＨ１ａ和Ｘｈｌ切位点，后按照重叠ＰＲ引物设计原ｏ酶然Ｃ则，其核苷酸序列分成９条寡核苷酸片段并分别合将
制作用．
１材料与方法

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

人脂联素基因的原核表达_纯化及活性检测

ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９人脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含子。

该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。

脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的０．０１％［１］。

目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２］。

脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。

１材料与方法１．１材料大肠杆菌ＤＨ５α及ＢＬ２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤ１８－Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。

质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。

Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｒｏｍｅｇａ产品。

兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ＩｇＧ为北京中杉公司产品。

蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。

蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｒｌｉｎｇ先生馈赠。

异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ），二硫苏糖醇（ＤＴＴ）等均为进口或国产分析纯试剂。

１．２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫瘤切除术且无代谢性疾病者，提取总ＲＮＡ。

将１μｇ总ＲＮＡ，７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５μＬ逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。

方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆入ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达脂联素融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖－６－磷酸酶转录水平的影响。

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

第２９卷第３期２１０２年６月
贵州大学学报（自然科学版）ＪｕｎｌｆｕｈｕＵｉｒｔＮｔｒｌｃｎｅ）ｏｒａｏｉｏｎｅｓｙ（ａａＳｉｃｓＧｚｖｉｕｅ
Ｖｏ．２．３１９Ｎｏ
Ｊｎ０２ｕ．２１
ｍｉｉｅｒｃｎｄｎｐｏｅｎ・ｓｏｉｔｄｐｉｉｇａ・ｄｎｔａｔｂｉｉｇｒｔｉ－ｓｃａｅｓｌｃｎｆｃ－ａ
公司，鼠二抗购自ＫＬ公司，Ｃ抗ＰＥＬ曝光底物购自
碧云天公司，曝光底片（ｕｉｌ，ＡＩ自ＳｇＦｊｆｍ）ＤＰ购ｉｉ— ｍａ公司。１２引物设计．
Ｔ４连接酶，限制性内切酶ＨｎｌｉｄＩＩ和Ｘａ，ｘａｂＩＥＴｑ
火１ｍｎ７ｉ，２℃延伸２ｍｉ，５个循环后７ｎ３２℃延伸
ＤＡ聚合酶，ｒｏ试剂盒均购自ＴＫＲｉｅＮＴｉｌｚａａａＢｏｃｔ
ｔ，ＰＦ，子量１０ｋａ与多嘧啶序列（ｏ — ｏＳ）分ｒ０Ｄ，Ｐｌｙ
ｐｒｉｉｅｔｃｂｎｉｇｐｏｅ，ＦＢ）合成为剪ｙｉｄｎａｔｉｄｎｒｔｎＦ结ｍｒｉ接复合体＿，与前体ｍＮ的剪接加工＿。１参］ＲＡ２］
摘
要：目的是构建人ＰＦ基因真核表达载体ｐＧＰＮＳ并在检测其在ＣＯ细胞株中的表ＳＥＦ —１ＰＦ，Ｈ
达情况。应用ＤＡ重组技术和ＰＲ方法从人宫颈癌Ｈｌ胞中扩增ＰＦ基因，入ｐＧＰＮＣｅａ细Ｓ插ＥＦ—

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达一、真核表达载体pPDGF-NEP的构建（一）、材料各种Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、所有DNA marker及凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连Takara公司；全血基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

质粒pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体购自大连Takara公司；真核表达质粒pEGFP-1、质粒pcDNA3.1(+)、质粒pCSC-SPPW-net由山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所保存。

（二）、方法2.1. PDGF启动子的获取用全血基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，根据Genbank上的PDGF 基因全序列（Genbank：HSN 10C 3,2782bp,该序列中含有一个EcoRⅠ酶切位点）设计多对引物，并在上下游外引物F/R上分别加入Bsp106及KpnⅠ酶切位点。

第一步先以基因组DNA 为模板，分别使用内引物F0/R1、F1/R进行分段PCR扩增，获得PCR产物1和PCR产物2。

第二步以PCR产物1和PCR产物2为模板，以外引物F/R进行PCR扩增，扩增产物即为2782bp的PDGF启动子序列。

第三步将上一步获得的PCR产物通过酶切插入至pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体中构建pSIMPLE-19-PDGF，并进行酶切、测序鉴定和扩增（实验步骤见图1）。

各引物序列：F0：5’-CTTACGGGCTGTGTGACCTT-3’；F：5’-ATCGATAGCA TGGAGAGGCTACAGGTAGAGT-3’；F1：5’-TCTCTGCCACTGTGCCACGCT-3’；R：5’-GGTACCGGCAGTCGATGGTTCGTCTTCACTC-3’；R1：5’-AGCGTGGCACAGTGGCAGAGA-3’。

图1 神经特异性启动子PDGF promoter的调取2.2. NEP基因的获取根据NCBI Genbank提供NEP、β-actin的基因序列，β-actin：F 5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3’，R 5’-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’；引物NEP：F5’-AAAGCTAAAAAGAAAACAG-3’，R 5’-CAGTGCCAACAAACAAA T-3’，扩增片段大小分别为395、575bp，引物为上海博亚公司合成。

人脂联素球型结构域原核表达重组质粒的构建及体外表达

Ｖ电泳至结束。电泳后的凝胶用考马斯亮蓝Ｒ－２５０（５０％甲醇，０．２５％考马斯亮蓝Ｒ－２５０，１０％冰醋酸，４０％水）染色２ｈ，用脱色液（４５％甲醇，４５％水，１０％冰醋酸）脱色至背景透明，观察结果。
２结果２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增人ｇＡｄ基因
两条带，分别是４１２ｂｐ和２６９２ｂｐ，一条是ｇＡｄ目的基因，一条是ｐＭＤ１８－Ｔ质粒载体。以ｇＡｄ－Ｔ质粒阳性克隆为模板，以ｇＡｄ特异性引物进行ＰＣＲ扩增，扩增出４１２ｂｐ长度的ｇＡｄ目的基因（图２）。
１实验材料和方法１．１实验材料
实验中采用的人脂肪组织来源于一个３５岁的女性慢性胆囊炎手术病人的大网膜，术前已获病人口头同意。该女性体质量指数为２１．５ｋｇ／ｍ２；血压正常；空腹及餐后血糖正常；血脂正常。既往无肥胖及吸烟史。
收稿日期：２００８－０３－１５基金项目：国家自然科学基金（３０５７０８７４）通讯作者：余叶蓉，教授，博士导师
无肥胖及糖尿病家族史。实验中总ＲＮＡ提取试剂购自于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公
司；反转录试剂盒、ＤＮＡ分子标记、限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接试剂盒、ｐＭＤ１８－Ｔ质粒均购自于大连宝生物工程有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自于ＯＭＥＧＡ公司；酵母提取物、胰化蛋白胨购自于ＯＸＩＯＤ公司；琼脂糖、琼脂粉购自于Ｓｉｇｍａ公司；质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）、大肠杆菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α及ＢＬ２１为四川大学病理生理实验室赠送；引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成。实验中所用的其他化学试剂购自于四川大学化学试剂中心，均为分析纯级。１．２实验方法１．２．１两步法反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）获取人ｇＡｄ基因首先参照总ＲＮＡ提取试剂盒说明书提取约３００ｍｇ脂肪组织的总ＲＮＡ。然后，利用反转录试剂盒将前面提取的总ＲＮＡ逆转录合成单链ｃＤＮＡ。将单链ｃＤＮＡ产物在特异引物Ｐ１和Ｐ２的作用下，通过ＰＣＲ扩增出编码人ｇＡｄ的基因。其中特异引物Ｐ１和Ｐ２分别为：Ｐ１：５＇－ＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＣＡＧＣ－３＇，序列中含有限制性内切酶ＥｃｏＲＩ的酶切位点；Ｐ２：５＇－ＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡ－３＇，其序列中含有限制性内切酶ＳａｌＩ的酶切

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

ｃＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．Ｇａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｉｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄ．
ｐｕｉｆｒｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｈｅＴＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｈａｔｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ— ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｐｕｒｉｉｆｅｄａｄｉｐｏｎｅｃｉｔｎｓｈｏｗｅｄ
维普资讯
６４４
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄＪ，Ｓｅｐ２００７，Ｖｏｌ３５Ｎｏ９
人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测
刘德敏
摘要
杨莉丽丁玉静来自孙颖于德民
目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编

人脂联素基因真核表达载体的构建及表达

ＧｌｘａｔｎＫｔ。ｅＥｔｃｏｉｒｉ）
Ｐ１：ＡＣ５ＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴｒＧ
机体能量平衡、糖脂代谢等作用。，其病理生理。但作用及其机制尚未完全明确。本研究拟通过人脂联素基因的克隆及其真核表达载体的构建来表达脂联
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安徽医科大学学报
ＡｔＵｉｒｔｉＭｅｉｎｌｎｕ２０ｃ；１５ｃｎｅｉｔｄｉｉＡｈｉ０６Ｏｔ（）ａｖｓａｓｃａｓ４
‘５５・２
人脂联素基因真核表达载体的构建及表达
成功诱导表达出融合蛋白ＧＴｈＰＳ —ＡＭ，为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组ｈＰ创造条件。ＡＭ主题词
自由词
码序列（斜体部分）同时再分别在两个酶切位点前，加上两个保护碱基。② ＰＲ反应：Ｃ以本实验室中国
１２２ｈＰ基因真核表达载体构建及鉴定．．ＡＭ
真核表达载体ＰＥ－Ｔ１约ＧＸ４一（
①
１１１质粒和菌株．．
载体ＰＥ－Ｔ１和ＰＲ纯化产物双酶切：ＧＸ４一Ｃ根据真核
１２１ｈＰ基因克隆．．ＡＭ
① 引物设计：据已报道根
的人ＡＭ（ＡＭ）ＤＡ序列设计一对引物，ＰｈＰｃＮ并分别在上下游引物前加上Ｅｏ１Ｓｉ切位点编ｃＲ、ａｌ酶

脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建

巾两医结合心脑血管病杂志２１００年３月第素球状结构域真核表达载体ｐＤＮＡ３０一ｇｃ．Ａｄ的构建Ｄ
黄敏，显久，陈王彦，杨静
摘要：目的构建脂联素球状结构域（ｌｂｌｒｄｐｎｃｉ，Ａｄ的真核表达载体，ｇｏｕａｉｏｅｔｇ）ａｎ为研究ｇＡｄ对糖尿病、脉粥样硬化等疾病动
Ｈｕｎｎ，ｅａｊｕＷａｇＹａｅｌ／ｅＦｉｓｓｉａ，ｈｎｉＭｅｉａｉｅｓｔ（ｉｕｎ０００）ａｇＭｉＣｈｎＸｉｎｉ，ｎｎ，ｔ，ＴｈｒｔＨｏｐｔｌＳａｘｄｃｌＵｎｖｒｉＴａｙａ３０１ａ／ｙＡｂｔａｔＯｊｔｖＴｏｃｎｔｕｔｔｅｅｋｒｏｉｅｐｅｓｏｌｓｄｐＤＮＡ３０一ｇｏｔｉｉｇｔｅｇｏｕａｄｐｎｃｉ．ｔ— ｓｒｃ：ｈｅｉｅｃｏｓｒｃｈｕａｙｔｘｒｓｉｎｐａｍｉｃｃ．ＡｄｃｎａｎｎｈｌｂｌｒａｉｏｅｔＭｅｈｎ
ｗｉｈＰＣＲｎｄＩＮＡｅｔａ）ｓｑｕｅｃｎｇ．ｓｔＴｈｇｈ —ｐｕｉｙｇｅｏｍｉｎｉＲｅｕｌｓｅｈｉｒｔｎｃＤＮＡａｘｔａｅｎｈｗｓｅｒｃｔｄａｄｔｅｇａｄｇｎｅｗａｍｐｉｉｄｂｅｓａｌｆｅｙＰＣＲ．Ｔｈｅ
的治疗奠定基础。方法从健康人全血中提取基因组ＤＮＡ，Ｃ法获得脂联素球状结构域基因，ＥｏＰＲ经ｃＲＩ和ＸｏＩ酶切后与ｈ

人脂联素原核表达载体PQE30ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达

天津医药２００８年１１月第３６卷第１Ｉ期人脂联素原核表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ的构建及在大肠杆菌中的表达幸史晓文刘德敏孙颖张捷８４３摘要目的：构建人脂联素重组表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白。

对表达产物进行鉴定。

方法：将构建好的人脂联素克隆载体ＰＵＣ５７／ＡＤＰＮ与原核表达载体ＰＱＥ３０通过双酶切方法位点特异地连接在一起，再转化人大肠杆菌ＪＭｌ０９感受态细胞中。

通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，并用ＩＰＴＧ在大肠杆菌Ｍ１５中诱导表达。

结果：ＰＣＲ获得长度为７５３ｂｐ目的片段，经ＰＱＥ３０原核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与Ｃ，ｅｎＢａｎｋ检索的人脂联素ｅＤＮＡ序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ一００４７９７）１００％匹配；含重组Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ质粒的大肠杆菌经０．４ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ｈ后有表达。

结论：应用并成功构建了人脂联素原核表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，且在大肠杆菌中获得有效表达。

关键词胞间信号肽类和蛋白质类基因表达大肠杆菌遗传载体脂联素ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＰＱＥ３０／ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉＳＨＩＸｉａｏｗｅｎ，ＬＩＵＤｅｔａｉｎ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｅＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅＰＱＥ３０／ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ（ＡＤＰＮ）ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ．）ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：．ｎｌｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮｇｅｎｅＷａＳｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＰＵＣ５７／ＡＤＰＮ．Ｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｔｏｄｉｇｅｓｔｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｈｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮｇｅｎｅＷ＊ｔ８ｌｉｇａｔｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＱＥ３０．Ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｔｗａ￥ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＪＭｌ０９ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｃｈｏｏｓｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒＰＱＥ３０／ＡＤＰＮｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＰＴＧ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ７５３ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｗａｇｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲｃｌｏｎｅ．Ａｆｔｅｒｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｍａｔｃｈｅｄｔｏｔｈｅｅＤＮＡｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮ，ｗｈｉｃｈａｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎＢａｎｋＷａＳＮＭＪＩ叫１７９７．ＡｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷ８８ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ０．４ｍｍｏｌ／ＬＩＰＩ．ＧｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｉｎＥｃｏｌｉＭ１５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉＰＱＥ３０／ＡＤＰＮｖｅｃｔｏｒｗａｓｆｉｒｓｔｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｌｌｇｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌｇｅｎｅｔｉｃｖｅｃｔｏｒａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ＡＤＰＮ）是脂肪细胞特异性分泌的一种血浆激素蛋白，在循环血液中大量存在，约占人体血浆总蛋白含量的０．０１％ｔ１Ｉ。

人HP1α／pEGFP-N1真核表达载体的构建及其表达和定位

关键词异染色质相关蛋白；绿色荧光蛋白；基因表达定位；ＨｅＬａ细胞
中图分类号Ｒ７８
文献标志码Ａ
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１０００ — ２６６９．２０１６．０６．０１２
泸州医学院学报
２０６年
第３９卷
第６期
５３７
ＪｏｕｎａｒｌｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＶｏ１．３９Ｎｏ．６２０１６
ＨＰ１ｏｄｐＥＧＦＰ－Ｎ１真核表达载体的构建及其表达和定位
ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｒｅｓｔｉｒｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｖｅｉｒｆｉｅｄｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｙｏｆｔｈｅｐｌａｓｍｉｄＨＰＩｏｄＥＧＦＰ— Ｎ１．Ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ。ＨＰｌｏｔｉＳｌＯＣａｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｏｆＨｅＬａｃｅｌｌｓ．
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐＥＧＦＰ－ＮＩ－ＨＰＩａｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ

人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达

人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭【期刊名称】《中国糖尿病杂志》【年(卷),期】2007(15)6【摘要】目的构建高效表达球状脂联蛋白的真核表达载体,为研究脂联素、球状脂联蛋白在2型糖尿病及动脉粥样硬化中的作用奠定基础.方法克隆人脂联素基因,构建球状脂联蛋白基因的真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),Western blot检测上清中球状脂联蛋白的表达.结果测序结果表明克隆的人脂联素基因序列正确;构建的球状脂联蛋白基因真核表达载体能有效转染HUVEC,并在上清中检测到该基因的表达.结论完成人脂联素基因克隆,成功构建了人球状脂联蛋白基因真核表达载体,并在HUVEC中获得分泌表达,为研究球状脂联蛋白对2型糖尿病的干预作用提供了可能.【总页数】3页(P367-369)【作者】李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭【作者单位】400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科【正文语种】中文【中图分类】R9【相关文献】1.人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建[J], 吉建新;廖伟娇;刘利东;卢春生;朱伯平;范婷婷2.脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建 [J], 黄敏;陈显久;王彦;杨静3.人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 周诺;黄旋平;廖妮;韦山良;梁飞新;麦华明4.绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建 [J], 刘德敏;杜春红;孙颖;张捷5.人热休克蛋白90β-cDNA基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 刘涛;赵菊梅;田聆;魏于全;梁传余因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用的开题报告

人脂联素基因的原核表达纯化、抗体制备及应用的开题报告一、项目背景人脂联素（Adiponectin）是一种由脂肪组织分泌的蛋白质，具有调节能量代谢、抗炎、抗肥胖和抗糖尿病等生物学功能。

人脂联素基因（ADPN）位于第3号染色体长臂上，由3个外显子和2个内含子组成，编码一个244个氨基酸残基的前体蛋白（pre-adiponectin），经过蛋白酶的切割后，生成28 kDa的脂联素（adiponectin）。

研究表明，脂联素在机体代谢调节过程中发挥着重要的作用，其功能异常与肥胖、糖尿病、脂肪肝等疾病的发生发展密切相关。

因此，深入研究人脂联素基因的表达和调控机制对这些疾病的预防和治疗具有重要意义。

本项目旨在构建人脂联素基因原核表达重组系统，高效表达并纯化脂联素，制备脂联素特异性抗体，并探索其在疾病诊断和治疗中的应用。

二、项目内容1.构建人脂联素基因原核表达系统采用基因克隆技术，构建人脂联素基因原核表达载体，并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。

通过SDS-PAGE和Western blot等技术鉴定表达蛋白的表达量和纯度，并优化其表达条件。

2.脂联素的纯化与结构分析采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对脂联素进行纯化，并通过质谱分析鉴定蛋白的分子量、氨基酸序列和糖基化情况等。

3.脂联素特异性抗体的制备以纯化的脂联素为免疫原，免疫小鼠、兔子等动物制备脂联素特异性抗体，并通过ELISA，Western blot和免疫组化等技术对其进行鉴定和评估。

4.探索脂联素在疾病诊断和治疗中的应用通过脂联素特异性抗体检测血清中脂联素的水平，探索其在肥胖、糖尿病、脂肪肝等疾病的诊断、预测和治疗中的应用。

三、预期成果1.成功构建人脂联素基因原核表达重组系统，并高效表达和纯化脂联素。

2.制备脂联素特异性抗体，并对其进行鉴定和评估。

3.探索脂联素在肥胖、糖尿病、脂肪肝等疾病的诊断、预测和治疗中的应用。

4.在人脂联素的表达和功能调控机制、以及脂联素在代谢性疾病中的作用等方面取得新的研究进展。

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

ＬＩＵＤｅｍｉｎ，ＤＵＣｈｕｎｈｏｎｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅ
ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｔｔｅｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ— ＧＦＰ— ＴＯＰＯ— Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ｈｅＴ
ｔｈｅｎｔｈｅｇｅｎｅＷｓａｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ－ＧＦＰ－ＴＯＰＯａｆｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏＴＯＰ１０ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｈｏｏｓｅｎｄａｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ７３６ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｏｂｔｉｎａｅｄｂｙＰＣＲｃｌｏｎｅｆｔａｅｒｂｌｏｔｉｎｇｎｄａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｍａｔｃｈｉｎｇｔｏｈｅｔｃＤＮＡｆｏｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ｗｈｉｃｈａｃｃｅｓｓｉｏｎｆｏｈｅｔｇｅｎｅｂａｎｋＷｓａＮＭ一００４７９７．

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达作者：钱进军, 程言博, 刘春风, 杨亚萍, 刘康永【摘要】目的: 构建含人野生型及致病突变A30P、 A53T SNCA基因的重组真核表达载体pEGFP C3SNCA, 并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。

方法: 通过RT PCR方法扩增SNCA基因, T A克隆后测序。

在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、 BamH I两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C（Ala30 Pro）、 G209A（Ala53Thr）的重组真核表达载体pEGFP C3SNCA, 并以PCR、双酶切、测序鉴定。

以重组质粒pEGFP C3SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞; 以G418进行筛选; 以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein的单克隆PC12细胞株, 并以稳定转染pEGFP C3的PC12细胞作为对照组细胞, 通过RT PCR、 Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。

结果: PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP C3SNCA构建成功。

RT PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。

结论: 成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP C3SNCA; 成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein的单克隆PC12细胞株。

【关键词】α synuclein（SNCA）致病突变真核表达载体pEGFP C3 稳定转染 PC12细胞[Abstract] AIM: To construct recombinant eukaryotic expression vectors pEGFP C3SNCA containing human wild type (WT) and pathogenic mutations A30P, A53T αsynuclein (SNCA), and to obtain monoclonal PC12 cell lines overexpressing human wild type and pathogenic mutations A30P, A53T αsynuclein by stable transfection. METHODS: Human wild type SNCA gene was cloned by using RT PCR. By T A extension cloning, the gene was ligated with T vector and sequenced. Based on it, the recombinant eukaryotic expression vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its G88C (Ala30Pro) and G209A (Ala53Thr) pathogenic mutation were constructed by site directed mutagensis using primer variance in mononucleotide. And different recombinant plasmids pEGFP C3SNCA were identified with PCR, restriction enzyme digestion and DNA sequencing. PC12 cells were transfected with different recombinant plasmids pEGFP C3SNCA by liposome transfection method, screened with G418, and subcloned by limited dilution method to obtain different monoclonal PC12 cell lines stablyoverexpressing human wild type, A30P or A53T αsynuclein, respectively, and PC12 cells stably transfected with pEGFPC3 were used as control group. These monoclonal PC12 cell lines were identified with RT PCR, Western blot and fluorescence microscopy. RESULTS: According to result of PCR, the double digestion and gene sequencing, it was comfirmed that recombinant eukaryotic expression vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its Ala30Pro and Ala53Thr pathogenic mutation had been constructed successfully. By means of RT PCR, Western blot and fluorescence microscope, it was comfirmed that objective gene sequences in PC12 cells were stably over expressed. CONCLUSION: The recombinant pEGFP C3SNCA vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its Ala30Pro and Ala53Thr pathogenic mutations had been constructed successfully. The transfected monoclonal PC12 cells are obtained in which three SNCA gene isoforms had stable expression.[Keywords]αsynuclein（SNCA）; pathogenic mutation; eukaryotic expression vector pEGFP C3; stable transfection; PC12 cell多巴胺能神经元中出现路易小体（Lewy body, LB）是帕金森病（Pakinson’s disease, PD）的特征性病理改变, SNCA基因编码的αsynuclein在病理状态下聚集形成不溶性纤维, 构成了LB的主要成分, 而Ala30Pro、 Ala53Thr的致病突变与家族性PD相关[1, 2]。

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文章编号:100025404(2009)1421413202技术方法人脂联素真核表达载体的构建及其表达周　静1,姜　政1,孙　伟2,陶小红1,黄爱龙3,王丕龙1 (重庆医科大学:1附属第一医院消化内科,3肝炎研究所,重庆400016;2第三军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆400038) 摘　要:目的　构建人脂联素的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞C OS27中的表达。

方法　从人脂肪组织中提取总RNA,通过RT2PCR方法获得人脂联素基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP2N1上,构建重组质粒pEGFP2 N12Adi po Q,转染至真核表达细胞C OS27中,并通过S DS2P AGE和W estern bl ot检测融合蛋白在真核细胞中的表达。

结果　通过RT2PCR方法克隆人脂联素基因744bp,测序结果显示,1个碱基发生突变,654位:A→T,突变率为0.1%,氨基酸Glu→A s p。

通过S DS2P AGE和W estern bl ot检测融合蛋白分子质量约为55×103(绿色荧光蛋白分子质量约为27×103),说明脂联素基因在真核细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合。

结论　成功的构建了真核表达载体,并在真核细胞中表达。

脂联素(adi ponectin,Adi poQ)是脂肪细胞特异性分泌的多种细胞因子之一,其生理作用机制尚未阐述清楚,但越来越多的证据显示体内脂联素水平的异常在非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAF LD)的发展过程中起着重要的作用,可能参与了胰岛素抵抗、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化的发生与发展,对NAF LD的有效防止可阻止慢性肝病进展并改善预后[1]。

本研究从人脂肪组织中提取mRNA,通过RT2PCR获取脂联素基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP2N1上,并转染到真核表达细胞COS27中,通过RT2PCR、W estern bl ot以及绿色荧光检测融合蛋白的表达,旨在为进一步研究其信号转导通路及在NAF LD中的作用奠定基础。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　组织和载体脂肪组织取自本院胃肠外科手术患者腹部皮下脂肪组织,大肠杆菌菌株J M109及真核表达载体pEGFP2N1由重庆医科大学附属第一医院向廷秀博士惠赠,细胞株COS27由重庆医科大学肝炎研究所郭辉老师惠赠。

1.1.2　主要试剂及工具酶 Trizol购自Tiangen公司,RT2 PCR试剂盒,限制性内切酶H indⅢ、SalⅠ和T4DNA L igase购自TaKaRa公司,胶回收纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司,质粒提取试剂盒购自Omega公司,L i pofecta m ine2000购自I nvitr ogen公司,S DS2P AGE凝胶配制试剂盒和兔抗GFP抗体基金项目:重庆市卫生局科研项目(06222101)Supported by the Scientific Research Pr ogra m of Chongqing Munici palHealth Bureau(06222101) 作者简介:周　静,女,四川省宜宾市人,硕士研究生,主要从事非酒精性脂肪肝病方面的研究。

E2mail:zji4321228@sina.co m 通信作者:姜　政,E2mail:jianggoooddoct or@ 收稿日期:2008209209;修回日期:2009203201购自碧云天生物技术研究所。

1.2　方法1.2.1　引物设计合成根据Gen Bank中人脂联素基因序列设计其引物,上游引物:5′2CC AAGCTT ATGCTGTTGCTGG2 G AGCT23′,其前加入H indⅢ酶切位点及其保护性碱基CC,下游引物:5′2GCGT CG ACT AGTGGTG ATC AGTTGGTG23′,其前加入SalⅠ酶切位点及其保护性碱基GC,扩增长度为744bp。

同时设计内参β2actin引物,上游引物:5′2CC ACG AAACT ACCT2 TCAACTCC23′,下游引物:5′2ACTCGTCAT ACT CCTGCTTGCT23′,扩增长度为272bp,引物由上海生工合成。

1.2.2　脂肪组织总RNA的提取取约50mg脂肪组织放入液氮预冷的碾钵中,边加液氮边碾磨,直到碾成粉末,将其转移到预先加有1m l Trizol的EP管中,按Trizol说明书操作获取脂肪组织的总RNA。

取少部分RNA测其纯度和浓度并电泳。

1.2.3　RT2PCR扩增目的基因严格按照说明书进行操作,所获PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,同时进行凝胶回收。

1.2.4　重组载体的构建分别将目的基因和质粒pEGFP2 N1进行H indⅢ和SalⅠ双酶切,并经PCR纯化试剂盒纯化;将纯化的目的基因和pEGFP2N1按4∶1(物质的量)比例,在4℃条件下连接过夜并转化感受态细菌J M109[2],通过卡那霉素(25μg/m l)抗性筛选重组载体,重组质粒命名为pEGFP2N12 Adi poQ。

1.2.5　重组载体的鉴定取1.5m l过夜菌液提取重组质粒,与空质粒pEGFP2N1一起分别进行单酶切(H indⅢ)、双酶切(H indⅢ和SalⅠ)。

而后进行1%琼脂糖凝胶电泳,重组质粒经过双酶切是否能够切出目的基因条带。

为了进一步从序列的准确性上得到验证,将SalⅠ和H indⅢ酶切后电泳出现约744bp的阳性克隆菌株送到上海生物工程有限公司测序,使用T7通用引物,并将测序结果与Gen Bank中发表的脂联素c DNA 序列进行比对。

1.2.6　绿色荧光及W estern bl ot检测重组质粒在真核细胞中的表达将重组质粒pEGFP2N12Adi poQ以脂质体介导的方法转染COS27细胞,并以pEGFP2N1和灭菌ddH2O为对照,每组转染2孔。

24h后在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。

同时收集转染48h后的细胞分别提取总RNA,行RT2PCR3141第31卷第14期2009年7月第　三　军　医　大　学　学　报ACT A　AC ADE M I A E　ME D I C I N AE　M I L I T AR I S　TERTI A EVol.31,No.14Jul.2009反应,所获PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

将上述3组转染细胞分别用P BS洗涤3次后,加入裂解液400μl和P M SF 4μl提取蛋白。

分别取50μl蛋白溶液加入5×S DS上样缓冲液,混匀,沸水浴5m in,离心取上清液上样进行聚丙烯凝胶电泳(S DS2P AGE),然后电转将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上,以兔抗GFP抗体及鼠抗β2actin为一抗,以抗兔I gG和抗鼠I gG 为二抗,DAB显色,至显色清晰后,立即置于蒸馏水中终止显色,扫描保存。

2　结果2.1　RT2PCR扩增目的基因提取脂肪总RNA,经过琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S 3个条带,分光光度计结果:D(260)/D(280)为1.88,D(260)/ D(230)为1.57,浓度约为1μg/μl,符合实验的需求。

同时进行RT2PCR扩增并1%琼脂糖凝胶上电泳,在744bp附近有特异性扩增条带,此条带电泳位置与实验设计一致,提示扩增产物为脂联素片段。

2.2　重组质粒pEGFP2N12Adi poQ鉴定将重组质粒与空质粒一起分别进行单酶切(H indⅢ)、双酶切(H indⅢ和SalⅠ),同时进行1%琼脂糖凝胶电泳,重组质粒双酶切可见2个条带,大片段与载体pEGFP2N1大小(4700bp)一致,而小片段与目的基因大小(744bp)一致,而空质粒中无目的基因,证明重组质粒构建成功。

通过测序分析,发现目的基因片段有1个碱基突变,654位:A→T,突变率为0.1%,氨基酸Glu→A s p,因同为酸性氨基酸,不影响其编码及功能。

2.3　重组质粒在真核细胞中的表达2.3.1　绿色荧光检测转染24h后在荧光显微镜下观察, pEGFP2N1转染组和重组质粒转染组可见到绿色荧光,灭菌ddH2O转染的细胞未见到荧光。

2.3.2　W estern bl ot检测在线软件预测该绿色荧光蛋白相对分子质量约为27×103,融合蛋白分子质量约为55×103。

W estern bl ot检测经DAB显色,发现重组质粒转染组在55×103左右见一特异性条带,空质粒转染组在27×103见一特异性条带,在55×103位置没有条带,灭菌ddH2O在27×103和55×103均未见条带,三者在43×103位置均见内参条带(图1)。

说明脂联素cDNA在真核细胞中表达蛋白并与绿色荧光蛋白融合。

1:ddH2O转染组;2:空质粒转染组;3:重组质粒转染组图1　W estern blot检测重组质粒在CO S27细胞中的表达3　讨论脂联素是由一种由AP M1基因编码的脂肪细胞分泌特异性的血浆蛋白[3]。

近年来发现脂肪组织不仅贮藏能量,还能分泌多种影响胰岛素敏感性的细胞因子,据研究脂联素是目前已知的唯一与肥胖呈负性相关的脂肪分泌蛋白[4]。

研究表明,血清脂联素与NAF LD的发生存在着密切的关系,其作为一个保护性因子可预防或延缓NAF LD的发生与发展[5]。

Aygun等[6]对29例证实伴有肝功能异常的NAF LD患者、20例临床诊断不伴有肝功能异常的NAF LD患者以及20例对照者进行研究,通过对脂联素、血脂和体质量指数检测,结果表明血清脂联素具有抗炎、抗糖尿病以及抗肥胖的作用;同时具有保护肝脏的作用,随着脂联素水平的下降,肝脏的炎症、坏死随之加重。

因此将脂联素c DNA导入表达载体中进行表达,补充机体脂联素的不足,是目前预防和治疗NAF LD的一个发展方向。

为了进一步研究脂联素在NAF LD的作用机制及基因治疗途径,本课题构建脂联素重组载体并在真核细胞中表达,结果显示:我们成功地构建了人脂联素重组载体,通过测序分析目的基因有1个碱基突变,654位:A→T,突变率为0.1%,氨基酸Glu→A s p。

通过S DS2P AGE和W estern bl ot检测融合蛋白相对分子质量约为55×103(绿色荧光蛋白相对分子质量约为27×103),而且能够被抗荧光蛋白抗体识别,说明脂联素c DNA能够在真核细胞中表达,为下一步治疗NALF D奠定了基础。

关键词:脂联素;基因克隆;基因治疗;转染中图法分类号:R394233 文献标识码:B参考文献:[1]Berner H S,Lyngstadaas S P,Spahr A,et al.Adi ponectin and its re2cep t ors are exp ressed in bone2f or m ing cells[J].Bone,2004,35(4): 842-849.[2]J iang Z,Hang A L,Tao X H,et al.Constructi on and characterizati onof bivalent vaccine condidate H s pA and M(r)18000OMP fr om Helico2 bacter pyl ori[J].World J Gastr oenter ol,2003,9(8):1756-1761. [3]Vasseur F,Helbecque N,D ina C,et al.Single2nucleotide poly mor2phis m hap l otypes in the both p r oxi m al p r omoter and exon3of the AP M1gene modulate adi pocyte2secreted adi ponectin hor mone levels and contribute t o the genetic risk for type2diabetes in French Cauca2 sians[J].Hum Mol Genet,2002,11(21):2607-2614.[4]Baranova A,Gowder S J,Schlauch K,et al.Gene exp ressi on of lep2tin,resistin,and adi ponectin in the white adi pose tissue of obese pa2 tients with non2alcoholic fatty liver disease and insulin resistance[J].Obes Sur,2006,16(9):1118-1125.[5]孟凡萍,杨刚毅,李　钶,等.腺病毒载体介导的si RNA对3T32L1细胞脂联素表达的影响[J].第三军医大学学报,2008,30(14): 1312-1315.[6]Aygun C,Senturk O,Hulagu S,et al.Serum levels of hepat op r otec2tive pep tide adi ponectin in non2alcoholic fatty liver disease[J].Eur J Gastr oenter ol Hepat ol,2006,18(2):175-180.(编辑　王小寒)4141 第　三　军　医　大　学　学　报第31卷。