原核表达载体的构建

二 实验步骤
1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例，双酶切体系（30μL体系）如下：
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
新城疫病毒NP、P、M、F、HN 原核表达载体的构建
一 实验所需材料
原核表达载体pET-32a（+）；
Ecoli DH5α菌株；
限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ、XhoⅠ； LB液体培养基（未加Amp+和加Amp+）； LB固体培养基（含Amp+）； 0.1mol/L CaCl2溶液； 凝胶回收试剂盒。
2、双酶切反应条件：37 ℃ 3 h。进行1％琼脂糖凝 胶电泳鉴定，然后在紫外灯下切取目的条带，用凝 胶回收试剂盒回收目的片段和原核表达载体片段。 3、目的基因片段与原核表达载体pET-32a的连接， 连接体系为10μL：
ddH2O 10×T4 Buffer 目的基因片段 载体片段 T4 DNA Ligase 2 µL 1 µL 5 µL 1 µL 1 µL 4℃连接过夜
ddH2O 10×buffer O pET-32a-NP EcoRI Sal I 15.5 µL 2 µL 1.5 µL 0.5 µL 0.5 µL 37℃酶切3h
8、酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性质 粒送去测序，序列分析正确的重组原核表达载体用 于下一步的原核表达。
注：各目的基因两端酶切位点及双酶切通用Buffer
NP基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI，通用buffer为10×buffer H P基因两端带有的酶切位点为EcoRI和HindⅢ，通用buffer为10×buffer M M基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI，通用buffer为10×buffer H F基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI，通用buffer为10×buffer H HN基因两端带有的酶切位点为SalI和XhoI，通用buffer为10×buffer H
第二组
ddH2O 10×buffer M pGEMT-P EcoRI HindⅢ 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
ddH2O 10×buffer M pET-32a EcoRI HindⅢ
第三组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-M EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
谢谢！ 谢谢！
Thanks!
第四组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-F EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
第五组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-HN Sal I Xhol I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pGEMT-HN Sal I Xhol I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
二 实验步骤
1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例，双酶切体系（30μL体系）如下：
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
EcoR Ⅰ
Sal Ⅰ
Xhol Ⅰ
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Hind Ⅲ
第一组
目的基因酶切体系
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 µL 3 µL 4 µL 1 µL 1 µL
原核表达载体酶切体系
ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 µL 3 µL 3 µL 1 µL 1 µL
4、制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰上放置4h以 上备用。 5、连接产物转化DH5α感受态细胞，将转化的细菌 涂于Amp+ LB平板，37℃倒置培养过夜待菌落长出。 6、从Amp+ LB平板上随机挑取生长的单菌落，于3mL LB液体培养基（含Amp+）中培养12-16h。
7、碱裂解法提取质粒，然后用相应的限制性内切酶 进行双酶切鉴定。以待鉴定的pET-32a-NP为例，双 酶切体系为20μL：