第2章 生产菌种的选育

(七)芳香中间体 （八）甲基
S-腺苷蛋氨酸 (S-Adenosyl-L-methionine, SAM)
次级代谢产物生物合成的基本过程
（一）构建单位的聚合
如柱晶白霉素由5个乙酰单位，1个丙酸单位， 1个丁酸单位，1个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩 合而成。
来自甲羟戊酸
H3C*
O
(CH3)
O
O
O
**
(H3C) *
代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属
或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌
选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
（三）食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国 需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微 生物能用于生产食品用酶。
（三）初级代谢与次级代谢之间的关系
1、次级代谢产物构建单位的生源说和生物合成
✓ 生源说指的是次级代谢产物分子中构建单位的各种原子 的起源—有机化学。
✓ 生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级 代谢产物的过程—生物化学。
✓ 中间产物：五碳、四碳、三碳、二碳化合物 ✓ “分叉中间体” ：某些中间产物，即可用于合成初级
NHCH3 OH
NHCH3
OH *
5
NH2 * OH
NH2
1
3
OH
OH
3
OH
OH OH
比较源自D-葡萄糖的链霉胍，2-脱氧链霉胺和
Actinamine的标记模式
(六)非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的生物合成 在次级代谢产物中出现的非核酸嘌呤碱基和嘧啶碱 基是由合成核酸用的嘌岭和嘧啶经过化学修饰而形 成的。
(1)次级代谢产物具有种特异性
分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素 如：灰色链霉菌： 链霉素----氨基环醇类 杀假丝菌素----六烯大环内酯类
不同的微生物也能产生相同的抗生素 如：头孢菌素C：顶头孢霉和克拉维链霉菌
(2)分批发酵时，产生菌生长周期三个时期
✓ 三个时期:
菌体生长期 产物合成期 菌体自溶期
红霉糖; D-脱氧氨基己糖
(4)次级代谢产物的合成受多基因控制
染色体－基因簇－结构基因； 质粒－调控基因，抗性基因 质粒：
（1）天蓝色链霉菌生物合成次甲霉素A的4个或5个 结构基因在SCPl质粒上 （2）螺旋霉素生物合成中，结构基因编码于复制子 上，而调节基因位于质粒上。
✓ 初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制， 而在许多抗生素产生茵如天蓝色链霉菌、金霉素链 霉菌、灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌 等中发现，抗生素的合成同时受到核外遗传物质--质 粒的控制，因此，有人将受到质粒控制的代谢产物 称为“质粒产物”。
链氨基酸降解等形成。
（3）丁酸单位通常由一个乙酰CoA与一个丙酰CoA缩合形成 ，还可由亮氨酸经过2-C-异 → → → →乙酰乙酸→丁酸
✓ 作为链的延长单位有丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA、
乙基丙二酰CoA等。是C2、C3和C4的供体
乙酰CoA羧化酶
（1）乙酰CoA+ATP+C02+H2O→丙二酰CoA+ADP+Pi 丙酰CoA羧化酶
细胞结构，也不是储存养料。 抗生素(antibiotic)、生物碱(alkaloid)、色素(pigment)等
1、微生物合成次级代谢产物的基本特征
(1) 次级代谢产物具有种特异性 (2) 分批发酵时，产生菌生长周期三个时期 (3) 次级代谢产物不少是结构相似的混合物 (4) 次级代谢产物的合成受多基因控制
FDA- Food and Drug Administration(美国)食品及药物管理局
GRAS：generally recognized as safe/一般认为安全
a-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、 枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
工业化菌种的要求
1. 生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好 与致病菌无关）；
霉素等)的分子中最常见的环多醇部分是由葡萄 糖衍生来的，如α-脱氧链霉胺、链霉胍都是葡萄 糖经过磷酸化、环化等反应形成环多醇，继续经 过氨基化等反应衍生来的。
* CH2OH
O
OH
OH
OH OH
NH2 OH OH
Y * OH X
OH
共同的中间体 （X, Y=H or OH）
NHR NHR
OH *
HO 5
(3) 次级代谢产物不少是结构相似的混合物
✓ 产黄青霉菌合成具有不同生物活性的青霉素(青霉素G、 V、O、F、X)，青霉素母核-6-氨基青霉烷酸（6-APA）
H ROONH
O
H S
H N
CH3 CH3
COOH
R = G-C6H5CH2-, X-HOC6H4CH2-, F-CH3(CH2)4-, V-C6H50CH2-
*
O
*
OH
NH CO
OH
(H3C)
O
OH
CO
NH2
来自谷氨酰胺
来自酪氨酸
新生霉素生源说
来自莽草酸
（ ）来自甲硫氨酸；* 来自葡萄糖
（二）次级代谢产物的最终修饰
R4 7
8
9 10
R3 R 2 R1
N(CH3) 2
6
54
OH
3
H
H OH 2
11
12 11a
12a
1
CON H2
OH O
OH O
C4氧化反应及氨化反应
HO
OdTDP
OH
脱氧酰苷-5-
二磷酸葡萄糖
NADPH
OH
O
O
OH
CH2OH
OdTDP OH
OH
OdTDP
OH OH
二氢链霉糖
HO O OH
OdTDP OH OH
L-鼠李糖
O
O
O
O
OH
dTDP P O P O O
HO
OH
HO
链霉糖的生物合成
(四)不常见的氨基酸
➢ 200余种非蛋白质氨基酸(称不常见氨基酸)，如D-氨基 酸、N-甲基氨基酸；脱氢的和b-氨基酸、稀有的二氨 基酸(如二氨基丁酸) 。
聚酮体。
➢ 经过重复脱水常得到芳香化合物(如四环类、蒽环类抗生 素)
➢ 经过环化作用形成大内酯环(大环内酯类抗生素)，如果 形成多个双键的环状化合物，就可能导致多烯大环内酯 类抗生素的合成。
(二)甲羟戊酸(3-甲基-3，5-二羟基戊酸，MVA)
O H+
乙酰乙酰-COA 硫解酶
H+ O
HMG·CoA 合成酶 H O Me OH
➢ 葡萄糖和戊糖是这些糖类和氨基糖的前体。 ➢ 葡萄糖的碳架经过异构化、氨基化、脱氧、碳原子重排、
氧化还原或脱羧等修饰后并人次级代谢产物的分子中。 ➢ 葡萄糖是合成稀有戊糖的直接前体。部分稀有戊糖是在核
苷合成之后直接对核糖部分进行修饰而形成的。
灰色链霉菌提取物
CH2OH 灰色链霉菌提取物
OH
O
NADPH
第二节 生产菌种的选育方法
一、常见的工业微生物
（一）抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
（二）氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，
四环素
四环素环－ C6羟化反应
脱氢四环素－ 土霉素
C4-NH2甲基化反应
四环素环－C7氯化反应－金霉素
二、微生物代谢的调节及控制
（一）微生物代谢的自我调节机制
酶活性的激活
1、酶活性的调节
酶活性的抑制
协同反馈抑制 累积反馈抑制
增效反馈抑制 顺序反馈抑制
2、酶合成的调节（即酶量的调节）
3、能荷调节
反馈抑制模式--协同反馈抑制
（2）丙酰CoA+ATP+CO2+H2O 甲基丙二酰 CoA+ADP+Pi
羧基转移酶
（3）丙酰CoA+草酰乙酸
甲基丙二酰CoA十丙酮酸
（4）乙酰CoA＋丙酰CoA →缩合→ 丁酸→ →乙基丙二酰CoA
➢ ß-聚酮体链－连续而完全的还原反应获得脂肪酸； ➢ 不完全的还原或还原位点的不同可获得变化范围广泛的
利福霉素A, C, D, E 利福霉素R
利福霉素G 利福霉素S 利福霉素W
利福霉素Y
利福霉素B 利福霉素O 利福霉素L
原利福霉素I
3-氨基-5-羟基苯甲酸 8 甲基丙二酸单元
2 丙二酸单元
利福平的生物合成（代谢树）
[EA]
[EA]
OD OM
3
[EB]
[EB] OM
[EB]
OD OM
4
[EB] OC
第二章 生产菌种的选育培养
Microbial breeding and cell cultivation
概述 微生物的特点
➢ 有些微生物能在厌氧的条件下生长； ➢有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长； ➢有些微生物能进行复杂的代谢； ➢有些微生物能利用较复杂的化合物； ➢有些微生物能在极端的环境下生长。
➢ D-氨基酸可能由L-氨基酸通过氨基酸消旋酶催化形成 的。
➢ 有的是由正常氨基酸生物合成途径合成的，如a-氨基 己二酸是合成头孢菌素的一个构建单位。
(五)环多醇和氨基环多醇
➢ 环多醇是带有一些羟基的环碳化合物。 ➢ 氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基被
氨基取代的衍生物。 ➢ 氨基环醇类抗生素(如链霉素、庆大霉素、卡那