菌种选育
常用菌种选育原理的种植方法
常用菌种选育原理的种植方法今天给大家介绍一下常用菌种选育原理的种植方法！一、人工选种的方法：1.自然选种：该法是通过广泛异地引种、野生采集、孢子分离等途径获得菌种，将其进行驯化移栽，使其逐渐适应当地环境条件，并从中选优汰劣，选出性状优异的菌株。
在菌种生产以及试验性栽培中，反复进行比较和选择，最终确定优良的食用菌品种。
2.杂交育种：该法是通过将不同遗传性状的亲本之间进行交配，使遗传物质重新组合配对，通过双亲性状的优势互补或借助于以一个亲本的优点去克服另一亲本的缺点，产生具有其双亲优点的育种方法。
杂交育种一般有单孢杂交、多孢杂交、单双核杂交、原生质体融合等方法，一般科研、育种上多采用单孢杂交或原生质体融合，通过这些办法处理的菌种常常可表现出较强的“杂交优势”。
3.诱变育种该法是利用物理的或化学的方法处理细胞群体，促使菌种的细胞遗传物质发生性状的改变，然后从变异的菌种中选出具有优良性状的菌种的方法。
科研上常用的主要有辐射诱变育种，如紫外线照射、X射线等高能量射线，以及用一些化学药剂进行诱变育种。
4.基因工程育种该法是在基因分子水平上的遗传工程，又称基因操作、基因克隆、脱氧核糖核酸（DNA）重组技术等，基本原理就是把我们需要的目标基因通过载体DNA与原品种的DNA结合，然后人工导入一个受体细胞内，以让外来的遗传物质在其中“着生”，进行正常的复制，从而获得预先设计的新菌种。
二、菌种分离技术方法：多孢分离：该法是利用子实体弹射许多孢子在同一培养基上，让其萌发、自由交配，从而获得纯母种的方法。
该法简便易行，在食用菌选种中应用普遍。
（1）整菇孢子弹射法：该法适用于伞菌类的孢子采集。
在无菌室（箱）中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌平皿孢子收集器里，之后使用透明玻璃钟罩将其罩住，于见光、适温下使菇自然弹射孢子。
24h后，将玻璃钟罩打开，从培养皿内获取孢子。
（2）试管插割法：在无菌箱内，迅速用无菌试管插割种菇有菌褶一侧，直至取下组织块。
菌种的选育
第一章菌种选育第一节工业常用微生物及要求一、常见微生物（一）细菌（bacteria）发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。
其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸（二）放线菌（actinomyces）属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。
）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。
链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素（三）霉菌（mould）亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。
）1.曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素米曲霉和黄曲霉均为半知菌。
2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。
3.根霉属（Rhizopus）接合菌米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis）酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。
4.红曲霉属（Monascus）淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。
可生产食用红色素。
（四）酵母（yeast）单细胞真核微生物，低等真菌。
①酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）②假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。
选育菌种的方法
选育菌种的方法一、引言菌种的选育是微生物学研究中的重要环节，它对于促进农业、食品工业、医药领域的发展具有重要意义。
本文将介绍一些常用的选育菌种的方法，包括传统的筛选方法和基于分子生物学的筛选方法。
二、传统的筛选方法1. 随机筛选法随机筛选法是最常用的菌种选育方法之一。
其步骤包括：从自然环境中收集样品，如土壤、水体等，将样品制成适宜的培养基，然后进行培养。
在培养过程中，通过观察菌落的形态、颜色、生长速度等特征，筛选出具有特殊性状或功能的菌株。
2. 生理选育法生理选育法是根据菌株的生理特性进行选育的方法。
通过调节培养条件，如温度、pH值、氧气浓度等，筛选出适应特殊环境的菌株。
例如，有些菌株能够在高温或低温环境中生长，有些菌株能够在酸性或碱性环境中生长，这些菌株可以被应用于相关领域。
3. 抗性筛选法抗性筛选法是利用抗生素或其他抑制性物质来筛选菌株的方法。
通过将菌株培养在含有抗生素或抑制性物质的培养基上，只有具有抗性的菌株才能够生长并形成菌落。
这种方法可以筛选出具有抗生素抗性、耐酸碱或耐高温的菌株。
三、基于分子生物学的筛选方法1. PCR筛选法PCR筛选法是利用聚合酶链反应(PCR)技术来筛选菌株的方法。
通过设计特异性引物，扩增目标基因片段，然后通过电泳分析扩增产物，筛选出具有特定基因的菌株。
2. 基因克隆筛选法基因克隆筛选法是将目标基因插入表达载体中，然后转化到宿主菌中，通过观察宿主菌的表型变化来筛选菌株。
例如，将具有抗性基因的载体转化到宿主菌中，只有转化成功的菌株才能够生长在含有抗生素的培养基上。
3. 荧光筛选法荧光筛选法是利用荧光蛋白标记目标基因，通过观察菌株产生的荧光信号来筛选菌株。
例如，将荧光蛋白基因与目标基因融合，将融合基因转化到宿主菌中，通过观察菌株产生的荧光信号来筛选具有目标基因的菌株。
四、总结菌种的选育是微生物学研究中不可或缺的一环。
传统的筛选方法包括随机筛选法、生理选育法和抗性筛选法，它们通过观察菌株的形态、生长特性和抗性等来筛选菌株。
选育菌种的方法
选育菌种的方法菌种的选育是微生物研究中的重要环节，合适的菌种对于实验结果的准确性和可靠性起着至关重要的作用。
本文将介绍几种常用的选育菌种的方法。
1. 采样菌种的选育首先需要进行采样，即从自然环境中获取潜在的菌种。
采样时需要选择合适的样品，如土壤、水样、植物表面等，以获取丰富的微生物资源。
采样时要注意避免污染和混杂，使用无菌工具和容器进行采样。
2. 前处理采样回来后，需要进行前处理，以去除不需要的杂质和其他微生物。
常用的前处理方法包括表面消毒、筛选、稀释等。
表面消毒可以使用酒精或含氯消毒剂对样品进行处理，以杀灭表面的细菌和真菌。
筛选可以通过过滤或离心等方法，以去除大颗粒的杂质。
稀释可以将样品进行适当的稀释，以分离出单个菌落。
3. 菌落分离菌种的选育需要从复杂的微生物群落中分离出单个菌落。
常用的方法有平板分离法和液体分离法。
平板分离法是将前处理后的样品均匀涂布在含有适宜培养基的琼脂平板上，通过菌落的形态、颜色等特征进行分离。
液体分离法是将前处理后的样品接种在含有适宜培养基的液体培养基中，通过菌落的沉降速度、浑浊度等特征进行分离。
4. 纯化与鉴定分离出的单个菌落需要进行纯化和鉴定。
纯化是指将单个菌落进行传代培养，使其形成纯种。
常用的方法有传代培养、穿刺法等。
鉴定是指对菌种进行鉴定和分类，常用的方法有形态学观察、生理生化特性检测、基因测序等。
鉴定的目的是确定菌种的物种分类、代谢特性和潜在应用价值。
5. 保存与培养选育出的菌种需要进行保存和培养，以便后续的研究和应用。
保存常用的方法有冷冻保存、干燥保存、液氮保存等。
培养则需要选择适宜的培养基和培养条件，以保证菌种的生长和繁殖。
通过以上几种方法，可以选育出适合研究和应用的菌种。
菌种的选育是微生物研究中的重要环节，只有选育出合适的菌种，才能保证实验结果的准确性和可靠性。
选育菌种需要耐心和细心，同时还需要对微生物的特性有一定的了解和认识，以便进行正确的操作和判断。
第三章 微生物菌种选育
中国病毒资源与信息中心:从事普通病毒保藏与分 中国病毒资源与信息中心 从事普通病毒保藏与分 类鉴定与研究的专业机构。。 类鉴定与研究的专业机构。。 。。 中国林业微生物菌种保藏管理中心：保藏微生物菌株 中国林业微生物菌种保藏管理中心 保藏微生物菌株10700余 保藏微生物菌株 余 株，苏云金杆菌模式菌株等细菌、食用菌等大型真菌、林 苏云金杆菌模式菌株等细菌、食用菌等大型真菌、 木病原菌、菌根菌、病虫生防菌、木腐菌、 木病原菌、菌根菌、病虫生防菌、木腐菌、病毒和植原体 类等。 类等。 中国工业微生物菌种保藏管理中心:保藏各种工业微生物菌种 中国工业微生物菌种保藏管理中心 保藏各种工业微生物菌种 资源包括：细菌、放线菌、酵母菌、 资源包括：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌和大型真菌 。/ 中国医学细菌保藏管理中心: 中国医学细菌保藏管理中心 兽医微生物菌种保藏管理中心: 兽医微生物菌种保藏管理中心
1、采样
1)样品的地点
菜园和耕作层土壤： 菜园和耕作层土壤： 果园树根土层： 果园树根土层：
第四章 方法 1、固体培养法 A、平板培养法；B、斜面培养法； 平板培养法； 斜面培养法； 2、半固体培养法 3、液体培养法 静置培养法； 摇瓶培养法； A、静置培养法； B、摇瓶培养法； 深层培养法。 C、深层培养法。
二、微生物菌种的分离方法
美国典型菌种保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC） ）
主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生 物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、 物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分 子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、 子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科 学等的研究。该中心保藏有藻类111株，细菌和放线菌 学等的研究。该中心保藏有藻类111株 111 16865株 细胞和杂合细胞4300株 丝状真菌和酵母46000株 16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株， 4300 46000 植物组织79株 种子600株 原生动物1800株 动物病毒、 植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、 79 600 1800 衣原体和病原体2189株 植物病毒1563种 另外， 衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。另外，该中心 2189 1563 还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。 还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种 可出售
五种菌种选育的方法
五种菌种选育的方法1. 筛选优良菌株：通过对菌种进行筛选，选出具有较高产量、快速生长、稳定性等良好性状的菌株。
可以通过观察菌株的形态特征、生长速度以及产物产量等指标进行初步筛选。
2. 交配选育：将具有不同有益特征的两个菌株进行交配，产生具有更优秀性状的杂种，进一步提高菌种的产量和品质。
3. 基因工程改良：通过基因工程技术对菌株的基因进行修改和调整，强化其有益性状，例如提高产量、耐逆性或产物纯度。
4. 微生物育种：利用微生物的自然变异、诱变或基因重组等方法，通过筛选和选育，培育出具有优良性状的菌株。
5. 隔离培养：从自然环境或特定寄主体内分离出有良好性状的菌株，单独培养并进行繁殖，以保持其稳定性和纯度。
6. 高通量筛选：利用高通量技术，如高通量测序、高通量筛选装置等，对大量菌株进行快速筛选和检测，以选取具有优良性状的菌株。
7. 环境适应培养：通过将菌株暴露在不同环境条件下，如不同温度、盐度、pH值等，挑选出能适应多种环境的菌株，提高其应用广泛性和稳定性。
8. 选择性培养基：根据特定的性状需求，调配选择性培养基，利用特定生理功能或代谢产物的需求，筛选出具有目标性状的菌株。
9. 抗菌素筛选：利用抗菌素对菌株进行筛选，选择出对某种特定抗菌素敏感或耐药的菌株，为后续应用提供基础。
10. 应激培养：通过暴露菌株于适宜剂量的外界应激因子，如氧化应激、低温应激等，筛选出对应激因子具有较高耐受能力的菌株。
11. 连续培养：通过在连续培养系统中进行菌株的增殖和筛选，选出适应此种培养方式的优良菌株。
12. 自动化选育：利用自动化系统对菌株进行快速筛选、监控和评价，提高选育效率和可控性。
13. 发酵条件优化：通过改变发酵条件中的温度、pH值、气体供应等参数，优化菌株的生长和产物产量，提高其应用效果。
14. 组合选育：将具有不同优势特征的菌株进行组合，形成互补优势，从而提高整体产量和产品品质。
15. 代谢工程优化：通过调整和改变菌株的代谢途径和代谢产物分布，来增强产物的产量和纯度。
菌种选育名词解释
菌种选育名词解释
菌种选育是指通过筛选和培育，从自然环境或人工选育中获得具有特定特征和性质的菌种或菌株。
菌种是指由一类具有相同或类似形态、生理和遗传特征的微生物个体所组成的集合体。
菌种选育的目的是为了获得具有高产、高效、高质的菌种，以满足工业生产、农业生产或科学研究的需要。
在菌种选育中，常用的方法包括筛选法、改良法和混合法。
筛选法通过对大量菌株进行筛选，选取具有所需特性的菌种。
改良法则通过对已有菌种进行基因工程或遗传改良，使其具有更好的特性。
混合法是将两个或多个不同菌株进行混合培养，通过互补作用和相互促进，获得具有更好性能的菌种。
菌种选育在农业领域可以用于优选具有抗病、抗逆性强、高产等特性的菌种，以提高作物产量和品质；在工业领域可用于选育具有高产酶、高产代谢产物等特性的菌种，以提高产品产量和质量；在环境保护方面可以用于选育具有降解、吸附等环境修复能力的菌种，以减少环境污染；在医药领域可以用于选育具有抗菌、抗肿瘤等特性的菌种，用于新药研发等方面。
总之，菌种选育是一种重要的菌种改良和应用技术，可以通过选择和培育获得具有理想特性的菌种，以应用于各个领域。
菌种选育
2.变异：微生物种发生频率很低的可遗传的变化，指生物体在某种外因的作用发生遗传物质结构或数量的改变
3.饰变：不涉及遗传物质结构的改变，而只发生在转录翻译水平上的表型变化，特点是整个群体发生变化，群体中几乎没有个体都发生改变
B.抗原突变型：引起抗原结构的改变
C.产量突变型：基因突变引起代谢产量升高或降低
四、基因突变的特点
1.不对应性：与基因突变的性状与引起突变的原因没有直接关系
2.自发性：指在没有明显的外界因素影响下也可发生突变
3.稀有性：发生的变异是稀有的，导致筛选非常困难
4.独立性：在某一群体中，发生的不同基因突变几率是相等的，独立的，并无联系
十五、变异菌的分离和筛选：诱变处理经过培养后得到液体培养传代，再分离，初筛，复筛
1野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株
营养缺陷型：野生型菌株经人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型
原养性：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同
D.易位：非同源染色体之间部分连接或交换
3.染色体局部座位类的变化（基因突变）
A.碱基置换：在DNA链上的碱基序列中的一个碱基被另一个碱基代替的现象
a.转换：嘌呤一嘌呤或嘧啶与嘧啶之间发生互换
b.颠换：一个嘌呤替换另一个嘧啶或一个嘧啶替换另一个嘌呤
B.移码突变：在DNA碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异，可产生回复突变（变异越小，回复突变率越多）
食品微生物学 第四章微生物遗传与菌种选育 第二节微生物的菌种选育
微生物遗传与菌种选育
4.2.2.1 诱变育种的步骤:
确定出发菌 ↓
菌种的纯化选优 ↓出发菌株性能测定
同步培养 ↓
制备单细胞（单孢子）悬液 ↓
诱变剂选择与诱变剂量的预试验 ↓
诱变处理 ↓
平板分离 ↓计形态变异菌落数、↓
重复筛选 ↓摇瓶发酵试验
选出突变株进行生产试验
如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求， 可以留之作为菌种选育的出发菌株。
微生物遗传与菌种选育
4.2.2 微生物的诱变育种
诱变育种是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群， 促进其突变率在同提高，再从中筛选出少数符合育种目的的 突变株。
诱变育种的主要手段是以合适的诱变剂处理大量而分散 的微生物细胞，在引起大部分细胞死亡的同时，使存活细胞 的突变率迅速提高，再设计既简便、快速又高效的筛选方法， 进而淘汰负突变并把正突变中效果最好的优良菌株挑选出来。
微生物遗传与菌种选育
4.2.1.4 纯种培养 经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落
形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定， 对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。 4.2.1.5 生产性能测定
从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛 选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作 为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌 种。
微生物遗传与菌种选育
4.2.2.2 营养缺陷型突变株的筛选
在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有 着十分重要的意义。营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的 缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱 基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养 物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野 生菌株。
菌种选育
（2）抗性菌株的产量试验 在选育抗噬菌体菌株时， 既要求具有抗性，同时亦要求生产能力不低于原敏感 菌株。
（3）其正抗性与溶源性的区别试验 菌株的抗噬菌体 特性具有遗传的相对稳定性。 抗性表现力多种多样，可因细胞壁结构的改变而阻 止噬菌体吸附侵入，也可因生理代谢的改变，使噬菌 体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放。这些菌株 都具有真正的抗性。溶原性菌株则因细胞中存在原噬 菌体，对同一类型噬菌体具有免疫性。表面上看来， 这种菌株具有抗性，但可采用物理、化学因素诱导不 同的敏感菌看它是否会释放噬菌体。出现噬菌斑的菌 株就是溶源菌，而不是真正抗性菌。
E N一甲基一N′硝基一N一亚硝基弧（NTG）
亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发 营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12％一80％ 的营养缺陷型菌株，故有超诱变剂之称。它在pH低 于5－5.5的条件下，形成HNO2 而引起菌种突变；在 碱性条件下以重氮甲烷的形式对DNA起烷化作用； 在pH6时，两者均不产生，此时的诱变效应可能是由 于NTG本身对核蛋白体引起的变化所致。 在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因 此用甲酰胺溶解NTG，可以提高处理浓度。通常在 浓度为300 μg／mL，温度为28℃和时间为60分钟的 条件下进行处理，容易得到高产菌株。
2.2.3.3 噬菌体的防治
不同发酵类型遭到不同种类噬菌体侵染所出现的现 象是不同的，而同一菌种被相同的噬菌体侵染，由于 侵染的时间不同，也会造成不同的后果。但都会出现 畸形菌丝，菌体迅速消失，pH上升，发酵产物停止积 累，甚至下降等现象。
噬菌体的防治是多方面的。大概可以分以下几个方 面：
（1）正确判断 （2）普及有关噬菌体的知识 （3）选育抗噬菌体菌株 （4）消灭噬菌体
E 高产菌株的获得需要筛选条件的配合
菌种选育
2.2.2.4 介绍几种物理、化学诱变剂的使用方法
A 紫外线 紫外线是一种使用时间较久、值得推广的诱变剂， 它的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，故应用 最广泛，研究得也最多。虽然紫外线的波长范围很宽， 但对诱变最有效的波长仅仅是260 nm左右（253－265） nm一般诱变时用菌（孢子）悬浮液进行处理，紫外 灯的功率为15W，距离固定在30 cm左右。 紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以 改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。
（2）诱发突变 敏感菌株先经诱变因素处理，然后将 处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培 养基上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌 株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与 正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗性菌株的 频率。
除上述方法外，还可将敏感菌孢子经诱变后接入 种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继 续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬 菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛 选抗性菌株。
2.2.2.2 诱变育种的一般步骤
• 诱变育种的一般步骤见P38，如图2－2所示 • 注意事项：选择好出发菌株；正确和灵活 使用各种诱变剂；诱变剂的选择；变异株 的筛选和筛选条件的确立；高产菌株的获 得与筛选条件的配合。 • 具体内容详见40页。
2.2.2.3 诱变育种工作中几个应注意的问题
A 选择好出发菌株 选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。 有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用 强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出 发菌株则不适宜。 用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生 理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量 高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱 变剂的使用及筛选条件。
02 菌种选育
02 菌种选育本章内容：第一节菌种的来源2.1.1 生物物质产生菌的筛选2.1.1.1 M—生物产物的来源M是各种生物活性产物的丰富资源，要获得所需生物特性的新产物，关键是：①、选择M；②、筛选方案(检测系统)。
M细胞内含物及其培养基成分极其复杂，且所需的产物可能每毫升只有微克到毫克，在选择筛选方法时必须考虑选择性和灵敏度两个方面，即需灵敏度很高的专一性检测方法。
2.1.1.2 待筛选样品的性质寻找新产物的产生菌可用固体或液体培养基筛选。
但次级代谢物的大规模生产是用沉没培养法进行的，由于在固体培养基和液体培养基中产生的次级代谢物的方式不一样，因此有些研究人员以液体培养法为惟一的筛选手段。
2.1.1.3 筛选方案的设计基本上可利用以下三种不同的筛选方法：①、整体生物；②、完整细胞；③、亚细胞制剂。
2.1.2 M选择性分离的原理和方法大多数抗生素均由放线菌产生。
下面介绍放线菌为主的分离方法原理的发展。
选择性分离方法大致可分为五个步骤：①、含M材料的选择；②、材料预处理；③、所需菌种分离；④、菌种培养；⑤、菌种选择和纯化。
以上任何一个阶段都可引人选择压力。
2.1.2.1 含M材料的选择在选择菌种来源时，存在一些选择标准。
对于天然材料，如土壤的选择，来源越是广泛的样品，含有目的类型的M的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；另一方面，可寻找已适应相当苛刻的环境压力的M类群。
这种方法已获得某些成功(见表2-1)。
从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌(Actinopolyspora halophila)，从盐场分离出嗜盐链霉菌，说明在富盐环境中存在一类尚待开发的放线菌。
酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的放线菌类群有很大不同。
因此，也有可能利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。
自然环境的菌群可因人类的活动而改变。
于土壤中加入去莠津(atrazine)会导致放线菌菌群数量的增加。
如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂中。
发酵工程第2章_菌种选育
• 脂肪酶产生菌的分离
• 为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色 圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作 为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性 的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明 B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。
• 乙醇产生菌的分离
• 通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙 醇的菌株。
4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、 2天。
5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调 节到与试样的生态系统参数值相近。
37
五、自然界中细菌的分离
（三）分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常 用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 淀粉酶产生菌的分离：
• 分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为 惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过 培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂， 根据菌落周围是否出现透明的水解圈来 区别产酶菌株。
• 碘可以杀菌，一旦染色就很容易把细菌杀死，而曲利 苯蓝只是对细菌有影响但不会杀死。，建议选用0.0050.01%含量。
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。
• 选择性地添加抗生素。 • 分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养
箱中存放3天。
• 在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层 含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和 NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的 电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡 白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。
优良菌种的选育
菌种的复壮措施： ①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细 胞挑取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus huringiensis 的复壮） ； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行 处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。 ④采用有效的菌种保藏方法。
纯化分离的方法
一、遗传与变异的概念
遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传
递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具 稳定性。
遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的 全部基因的总和；------是一种内在可能性或潜力。
单孢子分离法:
将菌种的分生孢子制成一定浓度的分散的 单孢子悬浮液，分离在平板培养基上，挑选单 菌落进行筛选。
在产量高于亲株的菌株中选择群体中主要 菌落类型比例高于90％以上的高产量纯株再进 行3～5代连续传代试验，选择传代后生产能力 仍保持原来水平范围的菌株，便是高产纯种。
2.微观单孢子分离
用单孢子悬浮液分离单孢子菌落的方法很 难保证获得绝对的单孢子菌落。
1.单孢子分离
微生物群体中存在不同类型菌落的组成，并认为 是由一些亚种混合组成的。
其原因是遗传基因型与环境因素共同作用的结果。 因此，不可能得到绝对纯一的菌种。但通过选择可 以得到相对纯一的群体。
纯种的标准有两条：
一是群体中存在的不同菌落类型数量限制在相对 低的水平，例如限制在3～5种类型以下。
二是群体中起主导作用的菌型的比例数应占绝对 优势，如达到90％以上，或更高的比例，如98％、99 ％以上。
为了使孢子发芽适度，必须使用稀释的液体培养 基。培养基浓度不要太大，避免养分过于丰富而控制 不住孢子的生长。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
菌种的营养特征独特
生长特征独特
选择性分离
无选择性特征
根据产物的特征进行
随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，
从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理
控制营养成分
控制培养基酸碱度
添加抑制剂
控制培养温度
控制通气条件
选择性分离技术
施加选择压力，进行定向筛选
个平板上铺上一种试验菌。
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术
技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株
生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件
培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μ max）筛 选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等 问题
连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分；
避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏；
确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
培养基中加入新生霉素(25µ g/mL)和亚胺环己酮(50 µ g/mL)
能分离出普通高温放线菌。
菌种的培养
温度和时间两方面，主要变量为时间。
培养温度：放线菌25～30oC，嗜热菌45～55oC，嗜冷 菌4～10oC。 培养时间： 是培养的主要变量，嗜温菌（链霉菌和 小单孢菌）7～14d；嗜热菌（高温放线菌）1～2d。
2. 样品的预处理
目的：提高分离效率
方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法
化学方法
诱饵法
材料的预处理
（1）、物理法 ①、热处理：可减少材料中的细菌数。因许多放线菌 比细菌细胞耐热。 ②、膜过滤：样品中细胞数较少时 ( 如水)，可采用膜
滤法浓缩。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响。
选择压力：在选择培养基中加入所需酶的
基质
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专 一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方
法的确定。 随机分离技术举例 抗生素产生菌的筛选 药理活性化合物产生菌的筛选 生长因子产生菌的筛选 多糖产生菌的筛选
生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；
培养条件易于控制；
抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和 毒素。
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的指导思想
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术
紫红曲霉
红曲霉属
最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
未培养微生物
定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养 方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微
生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作、 宏基因组分 析法
较优菌株1-3株
必要的毒 性实验 保藏，诱变 出发菌株
随机分离 固体培养
选择分离
选择压力，定向筛选
富集培养
微生物选择性分离的原理(筛选系统)
选择性分离方法大致可分为五个步骤（放线菌的分离为 例）： ①、含微生物材料的选择；
②、材料预处理；
③、所需菌种分离； ④、菌种培养； ⑤、菌种纯化。
1. 含微生物材料的选择
②、淀粉-酪素培养基： 长出的放线菌种类与几丁质培养基上生长的相似，但 其菌落的密度更大、色素更多，同时细菌也容易生长。 这种培养基中加入 4.6 ％ (m/m) 的 NaCl ，有利于链霉 菌生长，但不是所有的链霉菌都能耐受这一浓度的NaCl。
2、选择合适的pH
大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的 pH通常在
二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求
（二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
2. 菌种选择的要求
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目 的产物产量高、易于回收；
③、离心法：处理放线菌繁殖体含量很低的海水，可 先将样品离心后再过滤。
④、搅动释放孢子法：收集腐烂稻草和其他植物材料 中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行。并可用一风筒 或一简单的沉淀室收集孢子。然后，用取样器将空气撞击
在含培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的细菌数
目。
（2）化学法 在分离前加一些固体基质(把几种基质加在土壤中) 或洒些可溶性养分来强化培养基。
注意：有时培养时间短会漏掉一些新的和不寻常的 菌株，有人在30oC和40oC将培养1个月，分离出不寻常的种 属。也有人在20oC培养6周从海水中获得放线菌。
菌落的选择（筛选方法）
分离步骤中最容易受挫折和最耗时间的阶段。
选择方法取决于筛选的最终目的。 菌落的选择有三种方法：
显微镜观察分离 铺菌法
抗生素产生菌的筛选
筛选模型：试验菌 筛选方法：
固体培养基
液体培养筛选
铺菌法 复印平板法
抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β -内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同
I
II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制
水解酶
（1）抗生素产生菌筛选 在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶
的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。
筛选模型：目标酶
1. 微生物来源的酪氨酸蛋白激酶抑制剂 （李靓，2007）
2. Biochemical study of a new {beta}-lactamase inhibitorresistant enzyme (SHV-84) produced by a clinical Escherichia coli strain.（Manageiro V, 2010） 3. α-糖昔酶抑制剂 SH-9766产生菌的筛选和鉴别 (孙敏，2005) 4. 几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探（谢洁，2006）
样品采集
→样品的预处理→目的菌富集培养
→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定 →菌种保藏。
3. 新种分离与筛选的步骤
调查研究（查阅资料） 试验方案设计 样品采集（所需微生物？） 样品预处理（目的微生物） 菌种分离
根据目的菌株及其产物特点
菌种纯化 复筛
初 筛
菌种纯化 初步工艺条件摸索， 生产性能测试
从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工
业目的的优良菌株 ；
从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
选择性
灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
加几丁质或碳酸钙、提高pH
（3）诱饵技术 将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成 后再铺平板。 如：花粉、蛇皮、人的头发、涂石蜡的棒 ①、广泛使用石蜡棒技术来分离诺卡氏菌； ②、从土壤中分离耐酸放线菌。
③、有人用花粉诱饵从土壤中分离出13株小瓶菌， 其中有些是新种或亚种。
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。
分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
结果有两种可能：
获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；
生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；
复印平板法
显微镜观察分离
不易区分同一属的不同种。
铺菌法
会使所需菌落污染，并且只能每平板一种试 验菌
复印平板法 对不生长孢子的链霉菌则不能使用，也不适 用于游动细菌的筛选。
放线菌常用筛选方法：
铺菌法
于平板上铺一层试验菌，观察抑菌圈大小， 可测定抗生素生产能力。
缺点：所需要的菌落易污染，且只能在每
3、利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类 的菌株。 例如：酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的 中性圈的放线菌类群有很大不同。
4、自然环境的菌群可因人类的活动而改变。
例如：于土壤中加入去莠津会导致放线菌菌群数 量的增加。如诺卡氏菌属能生长在 Carboxanilide 杀真菌剂 中。 5、更新的生态环境仍有待开发。 例如，从Componia的根瘤中分离出一株放线菌； 从白蚁肠子里分离出一株类似放线菌的细菌。
一、
生物物质产生菌的筛选
（一） 微生物是生物产物的主要来源之一
菌种是发酵工业的基础，是发酵工业的关键。
获得微生物和新产物，关键是：
①、选择合适的微生物源； ②、建立科学的筛选方案(检测系统)。 要求：选择性强、灵敏度高。
合适的微生物源
微生物是各种活性产物的源泉，资源丰富。 医药50％的化合物与天然产物有关。 微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。