菌种选育方法

应带有可转移因子。
（7）冗长的DNA对宿主细胞是一种负担，尽可能将质粒上的不需要的 DNA部分除去。
（8）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。
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2.2.7 菌种保藏
菌种保藏的目的
保持菌种的活力，不死亡。
保持菌株的纯净，不被污染。
保持菌株不变异，不退化。
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菌种退化原因
cDNA文库
用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称 c－文库。
mRNA
逆转录酶
cDNA
复制
双链cDNA
载体
重 组 DNA分 子
受体菌
含 重 组 分 子 的 转 化 菌
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PCR
PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用 酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA 的专门技术。
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工程菌不稳定性的表现(倾向)
工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个 方面。
质粒的丢失；
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的 混合物。在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的 比生长速率往往小于不含重组质粒的比生长速率，即宿 主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、 乙肝表面抗原、人促红细胞生成素(EPO)、重组激酶、集落 刺激因子GM-CSF等，成本大大下降
研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出
不稳定性，因而工程菌稳定性的解决已日益受到重视，并成
为基因工程这一高技术成就转变为生产力的关键之一。
4. 聚合酶链反应（polym精e品r课as件e chain reaction, PCR1）3
基因组DNA文库
组 织 或 细 胞 染 色 体 D N A
限 制 性 内 切 酶
基因片段
克隆载体
存在于转化细菌内， 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合。 简称G－文库。
重 组 DNA分 子
受体菌 精含 品课件重 组 分 子 的 转 化 菌 14
基因表达产物相互作用进行筛选。包括：
免疫化学方法
酶免检测法
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（六）克隆基因的表达
表达体系的建立：
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离、精品纯课件化
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举例：碱性磷酸酶基因工程菌的构建
2000bp 1000bp
PCR 扩增产物电泳结果
1 PCR基因扩增及扩增产物的回收-碱性磷酸酶基因获得
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30
2 质粒DNA的提取
从含pETBlue-2(或pET21a)质粒的K12菌株提取
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3 DNA重组－限制性酶切和连接
酶 切 反 应 体 系（ 20 uL ）
管号
核酸
10xbufferK
ddH2 O
目的基因
tube1 AKP
2 uL
0 uL
16 uL
10 uL
tube2 pETBlue-2
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8
DNA连接酶
❖ 连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末 端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
❖ 连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ❖ DNA连接酶的作用过程
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DNA连接酶的作用过程
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10
运载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞 内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。
粘性末端连接
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（四）重组DNA导入受体菌
导入方式：
转化
转导
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（五）重组体的筛选
重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的 基因的菌落区分鉴定出来，这一过程 即为筛选（screening）精或品课选件 择（selection）。 21
1. 直接选择法： 针对载体携带某种或某些标志基因
重组质粒发生DNA片段脱落；
表达产物不稳定。
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工程菌不稳定性的原因
工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理 和遗传性及环境条件等因素有关。
质粒本身的分子结构：引起工程菌不稳定常常是由于稳定区 受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主 染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定
以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。
(2)选择适当宿主 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗
传特性的影响，住选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重组质 粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
(3)施加选择压力 在重组DNA技术中，有好几个方面利用选择压力，
如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克隆菌进行
发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定，以
提高菌体纯度和发酵生产率。
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施加选择压力
A 抗生素添加法 通常在重组质粒上含有抗药性基因。在克隆菌发酵
时，于培养基中加入适量的相应抗生素，可阻止丢失了重组质粒的非生 产菌的生长。
2 uL
6 uL
酶 切 370Co酶r p解ET3-2小1a时
BamHI 1 uL 1 uL
HandIII 1 uL 1 uL
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酶切片段的回收
PCR产物快速胶回收试剂盒
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连接
目的基因 AKP
12 uL
连 接 反 应 体 系（ 20 uL ）
载体
pETBlue-2
10 x Ligase buffer
基因突变 自发负突变 回复突变：生产株成为野生型
分离现象：多核（或单核）但是DNA双链之一发生突
变，随着传代，核发生分离，导致突变基因和未突
变基因的分离。
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菌种保藏的原理和方法
原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点， 人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽 量降低，以减少其变异。 一般可通过 保持培养基营养成分在最低水平 缺氧状态 干燥和低温 使菌种处于“休眠’状态，抑制其繁殖能力。
到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能
存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。
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防止或降低工程菌的不稳定性(续)
（4） 控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆
菌的发酵生产率，但许多研究中发现，外源基因表达水平越高，重组质 粒往往越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢 失。
1. 作用：将外源基因送入受体细胞。
2. 条件：
1)能在宿主细胞内复制并稳定地保存。
2)具有多个限制酶切点。
3)具有某些标记基因
3. 种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。
4. 质粒的特点
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质粒
细胞染色体外能自主复制的小型 环状DNA分子；
质粒是基因工程中最常用的运载 体；
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；
宿主：除上述质粒中有同源序列外，还与宿主的比生长速率、 宿主中重组基因(rec系统)的完整性、重组时有关基因的具 体变异等都有关系。
培养环境：高温、去垢剂(如SDS等)、某些药物(如利福平)、 染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。
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防止或降低工程菌的不稳定性
(1)组建合适载体 在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因
（5）控制培养条件 克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表
达效率影响机制错综复杂的而众多的环境因素中，培养基组成、培养温 度、菌体的比生长速率三方面尤为重要，对已经组建完成的克隆菌来说， 选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。
（6）可转移性因子会促进插入和丢失的出现，因此所使用的质粒不
和目的基因而设计的筛选方法。其特
点是直接测定基因或基因表型。
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抗药性标记选择（插入失活法）：
将目的基因插入带ampr和tetr基因的载
体中，则tetr基因失活。在分别
含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中
培养，进行筛选。
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标志补救（marker rescue）
若目的基因能够在宿主菌表达，且表达
PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸(dNTP) 及含有Mg2＋的缓冲液。
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PCR的基本反应步骤：
1. 变性：将反应系统加热至95℃ ，使
模板DNA完全变性成为单链；
2. 退火：将温度下降至50℃左右，使引
物与模板DNA退火结合；
3. 延伸：将温度升至72℃ ，DNA聚合酶
存在于许多细菌及酵母菌等生物 中；
质粒的存在对宿主细胞无影响；
质粒的复制只能在宿主细胞内完 成。
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（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 用于已知序列，或可推导出序列的基因
2. 基因组DNA 基因组DNA文库（genomic DNA library）
3. cDNA cDNA文库（cDNA library）
以dNTP为底物催化DNA的合成反应。
上述三个步骤为一个循环，经25～30次循
环后，可将模板DNA扩增达百精品万课倍件 。
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（二）克隆载体的选精品择课件
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GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG
G GATC GCGAT CCTG AGCCTG AG
DNA连接酶
GGATCC
（三）外源基因与载C体C 的连T接G AG
转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程
致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作
细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶 的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细 胞吸收DNA复合物
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再 转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌 落
生物工艺学
2 菌种选育(4)
精品课件
1
主要内容
菌种选育
自然选育
诱变育种
抗噬菌体菌株的选育
杂交育种
原生质体融合技术
Biblioteka Baidu
DNA重组技术
菌种保藏
精品课件
2
2.2.6 DNA重组技术
概述
基因工程（genetic engineering） ：在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组 基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物（70年代， 基于DNA限制新性内切酶、DNA连接酶的发现） 。
基因工程主要包括两个步骤：
获得目的基因，取得基因的载体，使二者进行体外重组。
将重组的DNA转化到受体的活细胞中去，改变受体细胞的遗 传特性。
精品课件
3
精品课件
4
基因工程过程示意图
① ②
③ ④
⑤ ⑥
精品课件
①从细胞中分 离出DNA
②限制酶截取 DNA片断
③分离大肠杆 菌中的质粒
④ DNA重组
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌
产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对
营养素的依赖表型来筛选。精品课件
25
分子杂交法：
利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素 膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子 杂交，直接选择并鉴定目的基因。
精品课件
26
菌落(或噬菌体)原位杂交
精品课件
27
2. 非直接选择法：
免疫学方法：利用特异抗体与目的
转化的确切机制还不清楚
精品课件
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重组子筛选-蓝白筛选
精品课件
36
DNA重组－重组子的筛选及表达菌株的转化
重组质粒的提取
表达菌株感受态细胞的制备
转化及复苏
精品课件
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外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
细胞 破碎
培养
蛋白 分离
滤
凝胶
免疫
纸
分析
SDS－PAGE
NC 膜
转膜免疫分析
＋
精品课件
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B．抗生素依赖变异法 即通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依
赖性突变株，只有存该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上 含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克 隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。
C．营养缺陷型法 与上述抗生素依赖变异法相类似。其原理是通
过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入
⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因
5
基因工程过程流程图
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6
限制性内切酶
1. 分布：主要在微生物中。 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切 割特定切点。 3. 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 4. 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。
精品课件
7
❖ 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的 切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。
or pET-21a
ddH2O
T4DNA连接酶
X uL
2 uL
Y uL
1 uL
♦ 140C连接过夜。 ♦ －200C保存，用于转化受体细胞。
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大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
感受态（Competence)： NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌 株，细菌处于容易吸收外源DNA的状态