BSAS亚硫酸氢盐扩增子测序具体方法及步骤
(完整版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。
焦磷酸测序步骤中文版
焦磷酸测序步骤一、实验操作（一）甲基化检测亚硫酸氢盐转化1． bisulfite Mix+800μL Rnase free water，窝旋5min/60℃加热窝旋混匀（配置好的bisulfite Mix勿放置冰上）2. 配置buffer反应液，室温混匀：DNA Solution （1μg）+RNAfree water 共20μl+bisulfite Mix 85μl+DNA protect buffer 5μl，（配置好的体系为140μl，不方便上PCR仪，最好分为两管70μl）3. 上PCR仪，95℃5min→60℃25min→95℃5min→60℃85min→95℃5min→60℃175min→20℃20min，热循环结束，将PCR product转入Spin-column，加入560 Buffer BL。
（当DNA微量时，需要加入carrier RNA，其加强DNA与column膜的结合；当DNA 量>100ng，则不需要加入carrier RNA）混匀，12，000rpm，1min，废弃液。
4. 清洗Bisulfite DNA convertion1）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
2）加入500μl buffer BD，室温放置15min（加入buffer BD快速盖盖子，避免出现白色沉淀）3）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
4）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
5） 12,000rpm，1min，废弃液。
6） 56℃5min（蒸发残余液体）7） 20μl Buffer EB溶解，12,000rpm，1min（-20℃，可保存3年）PCR扩增目的片段回收的PCR product 1：5稀释→取2μl→PCR→准备焦磷酸测序焦磷酸测序1．在PCR板中，准备微珠预混液配制（每管）1）Beads：3μl，Binding Buffer，40μl，模版：20μl，dd Water：补足80μl。
重亚硫酸盐测序
CpG岛 基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二 核苷酸的一些区域，主要存在于基因的5′区 域。启动子区中CpG岛的未甲基化状态是基 因转录所必需的，而CpG序列中的C的甲基 化可导致基因转录被抑制。 位于多种脊椎动物已知基因转录起始位点周 围、由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重 复序列。
DNA甲基化含义 甲基化含义 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集 DNA 中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基化 位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲 基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。 DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤 （7-mG）
重亚硫酸盐修饰直接测序技术
亚硫酸氢盐技术
基本原理
亚硫酸氢盐能使单链DNA的胞嘧啶脱氨变成 尿嘧啶，而5‘甲基胞嘧啶无变化，在CpG两 端设计引物，扩增出所需片段后进行直接测 序，TG为非甲基化位点，CC为甲基化CG位 点。从而获取CpG岛内所有的甲基化位点。
含有很多CpG 结构, 2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳 原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特 定三维结构。基因组中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未 甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛, 位于结构基因启动子的核 心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化, 使 DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点, 以及DNA 酶的敏感位点, 使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 失去转录活 性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能 导致基因置换突变, 发生碱基错配: T2G, 如果在细胞分裂过 程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症, 而且, 生物体甲基化 的方式是稳定的, 可遗传的。
焦磷酸测序步骤中文版
焦磷酸测序步骤一、实验操作（一）甲基化检测亚硫酸氢盐转化1． bisulfite Mix+800μL Rnase free water，窝旋5min/60℃加热窝旋混匀（配置好的bisulfite Mix勿放置冰上）2. 配置buffer反应液，室温混匀：DNA Solution （1μg）+RNAfree water 共20μl+bisulfite Mix 85μl+DNA protect buffer 5μl，（配置好的体系为140μl，不方便上PCR仪，最好分为两管70μl）3. 上PCR仪，95℃5min→60℃25min→95℃5min→60℃85min→95℃5min→60℃175min→20℃20min，热循环结束，将PCR product转入Spin-column，加入560 Buffer BL。
（当DNA微量时，需要加入carrier RNA，其加强DNA与column膜的结合；当DNA 量>100ng，则不需要加入carrier RNA）混匀，12，000rpm，1min，废弃液。
4. 清洗Bisulfite DNA convertion1）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
2）加入500μl buffer BD，室温放置15min（加入buffer BD快速盖盖子，避免出现白色沉淀）3）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
4）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
5） 12,000rpm，1min，废弃液。
6） 56℃5min（蒸发残余液体）7） 20μl Buffer EB溶解，12,000rpm，1min（-20℃，可保存3年）PCR扩增目的片段回收的PCR product 1：5稀释→取2μl→PCR→准备焦磷酸测序焦磷酸测序1．在PCR板中，准备微珠预混液配制（每管）1）Beads：3μl，Binding Buffer，40μl，模版：20μl，dd Water：补足80μl。
基因组DNA亚硫酸氢盐处理
第一部分基因组DNA的提取。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K 及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
这一步细节：1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
重亚硫酸盐测序操作方案
重亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。
2、收集细胞样品80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。
向1.5 mL离心管底部加入8 μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。
迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 μL矿物质油覆盖。
最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。
二、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 μL 的20 mg/ml蛋白酶K。
4、向含样品的离心管内加入500 μL DNA细胞裂解液，50℃金属浴8 h以上，以消化样品。
6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：0.3M NaOH，500 μL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。
7、换液加入500 μL转化液，50℃金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。
8、用TE缓冲液中止转化，1 mL ，15 min，6次。
9、用0.2M NaOH脱磺化，500 μL，15 min，2次。
10、用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL，15 min，3次。
11、用双蒸水清洗，1 mL，10 min，2次。
12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 μL离心管中，-20℃保存待用。
三、甲基化基因的PCR第一轮反应体系25 μL，转化后琼脂糖小球计为2 μL DNA。
第二轮反应体系扩大为50 μL。
快速精确切取，将胶块放入1.5 mL离心管内。
四、胶回收15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1 g=100 μL）QG Buffer，50℃金属浴至胶融化，同批样品可统一为450 μL，以便于离心。
16、加入1倍胶体积（150 μL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000 g，1 min。
BSP检测技术
BSP检测技术亚硫酸氢盐处理后测序（bisulfite sequencing PCR,BSP）法是检测基因甲基化的经典方法，其原理为：用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。
基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。
BSP实验流程:引物设计及注意事项：引物设计软件：Methyl Primer Express v1.0引物设计注意事项：用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理，将未甲基化的C碱基转变为U碱基，而甲基化的C碱基不变，从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异，所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意：1、引物设计不能含有CpG位点，以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。
2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点，BSP扩增片段长度300-500bp，包含的CpG位点越多则引物的打分越高。
BSP服务完成时提供:Bisulfite处理的基因组DNA；实验报告(包括BSP产物的直接测序报告)。
结果展示：BSP测序图BSP点状图空点表示为发生甲基化的CpG位点，实点表示发生甲基化的CpG位点BSP柱状图案例分析：利用二代测序和BSP(bisulfite sequencing PCR)研究MLH1 启动子区域甲基化状况在肿瘤内部的异质性同一肿瘤中可能包含不同体细胞变异的细胞，过去对肿瘤的这种异质性研究主要集中在遗传学领域，作者则将目光锁定在表观遗传学方面。
研究人员先利用二代测序手段，对来自33个样本(包括子宫内膜癌，相应的外周血以及正常的子宫内膜组织)的1000个分子的MLH启动子区域的甲基化谱(spectrum of MLH1 promoter methylation)进行研究，后续再利用BSP手段进行验证，发现了不同的子宫内膜癌细胞MLH1启动子区域出人意料的甲基化异质性形式，这种高分辨率的研究手段能够研究肿瘤甲基化的克隆性(clonality of methylation)从而对肿瘤发生过程中对启动子区域异常甲基化的状况进行研究。
Bisulfite Sequencing
Bisulfite Sequencing1. General InformationAs the first discovered mark, DNA methylation plays a vital role in genome dynamics. It is implicated in repression of transcriptional activity and in animals it predominantly involves the addition of a methyl group to the carbon-5 position of residues at cytosine guanine dinucleotide (CpG) sites.Bisulfite sequencing is a powerful technique to study DNA methylation. Treatment of DNA with bisulfite converts cytosine residues to uracil, but leaves 5-methylcytosine residues unaffected. The following PCR amplification treatment converts uracil to thymine. Thus, bisulfite treatment introduces specific changes in the DNA sequence that depends on the methylation status of individual cytosine residues. Coupled with new-generation sequencing technology, it allows for an unbiased genome-wide analysis of DNA methylation and various analyses can be performed on the altered sequence. Bisulfite-seq is the golden standard for DNA methylation analysis. Process includes: treating of DNA with bisulfite to convert cytosine residues to uracil, while leaving 5-methylcytosine residues unaffected; running PCR to convert all the uracil to thymines; in the end, sequencing the PCR product and performingthe bioinformatics analysis compared with the untreated genome to profile quantitive regional methylation pattern.Compared to Sanger sequencing, Bisulfite sequencing is a low-cost method with high reliability and accuracy to determine each cytosine methylation state. Based on new-generation sequencing technology, it avoids mass work of clone sequencing and complicated process. The sequencing primers which will be added to the DNA fragments to process sequencing also can be treated as random amplication primer for DNA samples. Thus, primer designing is not necessary and work of PCR will be decreased when compared to Sanger sequencing to profile genome-wide DNA methylation pattern.2. Experimental PipelineBisulfite treatment of sample DNA and DNA sequencingPerform the bisulfite treatment of qualified DNA and forward to TA clone test. Then the DNA sequencing is carried out using on the new-generation sequencing technology.DNA was extracted and processed by bisulfite sodium and subjected to Illumina GA sequencing with methylated adaptor. The detailed pipeline is showed as following (Figure 6-2-1):3. Bioinformatics AnalysisThe bioinformatics analysis of Bisulfite sequencing is based on the SOAP alignment with C T mismatches tolerated. Ideally, this method would determine the methylation status separately for each allele, even each single strand. The methylation status for each allele is the most important information to detect differentially methylated region as the candidate of imprinting gene. The methylation status for each single strand could be used to describe thehemi-methylation (Figure 6-2-2) .3.1 Basic bioinformatics analysisData production statistics includes image recognition, base calling, filtering adapter sequences and detecting contaminants of sample.3.2 Advanced bioinformatics analysisMap bisulfite-seq reads to referenceGet the methylation profile of the mapped reads.Gather the methylation information of each base of the mapped reads.Get the methylation rate information of all methylated C in CpG of each chromosome.Get the methylation rate information of all dispersed C of each chromosome. Provide the methylated CpG information in different gene regions.Provide the methylated dispersed C information in different gene regions. Provide the methylated CpG information of genome sequence with different features.Provide the methylated dispersed C information of genome sequence with different features.4. Case Studies4.1 Study on an individual human genomeThe match information of all the base sites is gathered and decoded after SOAP alignment. At each base site, tags number which suggests this site to be methylated or not will be given. In the following analysis, the C bases with copy number > 1.5 and quality < 14 are filtered out. The methylated rate of CpG or non-CpG is based on tags number which supports this site to be methylated comparing with and number of all effective tags.5. Frequently Asked Questions1) How many nucleotides are required for Bisulfite sequencing analysis?In order to ensure at least 10X coverage of genome size,we suggest 10 g of DNA to be provided as the mininum amount required.2) How to ensure all the unmethylated C bases to be converted to T bases in the bisulfite treatment of DNA?Our experimental pipeline normally ensures the conversion rate of unmethylated C to T to meet the bioinformatics analysis requirement. Here we used standard DNA and H19 for quality control.3) How to classify the methylation level?We can classify the methylation level through the proportion of total C and total T sequenced in a certain region. For example, if we get 6C and 4T (which in the reference sequencing is C), the methylation level in this region is considered as 6/ (4+6)= 60%.4) Which factors will influence the result of bisulfite-seq?From the scientific view, uncertain factors of DNA methylation research are mainly from undiscovered area, such as methylation difference of individual cell from cell lines, time differences and dynamic changes of methylation during developmental process or pathological process; from the technical view, the length of sample DNA, the conversion rate of DNA during bisulfate treatment and sequencing depth may influence the result of bisulfate-seq.目前, 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。
(完整版)亚硫酸氢钠测序法
亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.第一部分基因组DNA的提取.这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3： 42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.8：50℃避光水浴16h.一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.这一步细节：1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收. 4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.第三部分修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min. 7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.10：-20℃保存DNA溶液.此步细节：1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用. 2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.第四部分修饰后DNA用于PCR这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递. 这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.第五部分 PCR产物的凝胶回收这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.几个细节：1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）15ul体系T-easy 1ulLigase 1ul2xbuffer 7.5ulDNA 5.5ul4度,过夜.2：连接产物的转化1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；3）42度, 90秒钟；4）冰上2分钟；5）800ul LB培养基；6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul后涂：混悬液过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.3：取白斑,划种于新板上新板：先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.针头挑白斑划2道于板上相应区域内.37度,孵箱过夜.4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.这一部分的细节：1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.。
重亚硫酸盐测序技术介绍
SSCP
将亚硫酸氢盐处理和单链构 象多态性 PCR(PCR．SSCP)结合起来，设计了针 对 转化后DNA序列的引物，同时扩增 未甲基化和甲 基化的DNA，由此产生 的两种不同的扩增产物可以 通过SSCP 区分。此方法可方便地应用于任何序 列的甲基化状态的分析，能对甲基化 的等位基因进行半定量，获得甲基化 和未甲基化等位基因的比例；并且可 以提示甲基化状态的不均匀性。
重亚硫酸氢盐直接测序技术介绍
.
DNA甲基化含义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。
.
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序 列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲 基化靶序列。
缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要 测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大 量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。 在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故 灵敏度较MSP差。
DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7-mG）
.
启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序的方法及试剂盒[发明专利]
![一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序的方法及试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/53b86e82011ca300a7c39071.png)
专利名称：一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序的方法及试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：柳青,王晓雯,洪燕,姜涛,赵红梅,张广思,玄兆伶,李大为,梁峻彬,陈重建
申请号：CN201511029177.5
申请日：20151231
公开号：CN105506109A
公开日：
20160420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法，包括单细胞裂解、MspI酶切、末端修复、3ˊ端加A、加甲基化接头、重亚硫酸氢盐处理以及PCR扩增的步骤，本发明同时包括单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序文库的构建试剂盒、检测方法和检测试剂盒，属于基因测序领域。
本发明提供的测序用单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法，以单个细胞为研究对象，能够从单细胞水平上研究细胞的异质性。
申请人：安诺优达基因科技(北京)有限公司
地址：100176 北京市大兴区经济技术开发区科创六街88号院8号楼2单元701室
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。
亚硫酸氢盐转化试剂盒产品技术要求
亚硫酸氢盐转化试剂盒产品技术要求文档下载说明Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document 亚硫酸氢盐转化试剂盒产品技术要求can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!亚硫酸氢盐（亦称硫代硫酸盐）转化试剂盒是一种常用于分析化学和生物化学领域的试剂盒，用于将某些化合物转化为相应的亚硫酸盐。
这些试剂盒通常包括所需的化学物质、溶剂以及必要的反应条件，以便用户能够方便地进行转化反应。
在设计和制造亚硫酸氢盐转化试剂盒时，需要考虑一系列技术要求，以确保其性能稳定、操作方便且符合相关标准。
以下是一些可能包括的产品技术要求。
重亚硫酸盐测序pcr实验流程
重亚硫酸盐测序pcr实验流程英文回答：The process of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for sequencing of bisulfite-treated DNA involves several steps. First, the genomic DNA is treated with sodium bisulfite to convert unmethylated cytosines to uracils, while methylated cytosines remain unchanged. This treatment allows for the differentiation of methylated and unmethylated cytosines during sequencing. After bisulfite treatment, the DNA is purified to remove any contaminants.Next, reverse transcription is performed to convert the bisulfite-treated DNA into cDNA. This step is carried out using a reverse transcriptase enzyme and specific primers that target the region of interest. The reverse transcriptase enzyme synthesizes complementary DNA strands based on the template DNA. The resulting cDNA is then amplified using PCR.PCR amplification is carried out using specific primers that flank the region of interest. These primers are designed based on the converted DNA sequence afterbisulfite treatment. The PCR reaction mix contains DNA polymerase, dNTPs, and buffer. The reaction goes through cycles of denaturation, annealing, and extension to amplify the target DNA region. The number of cycles depends on the starting DNA concentration and the desired level of amplification.After PCR amplification, the DNA product is purified to remove any residual contaminants. This purified DNA is then subjected to sequencing analysis. The sequencing can be done using Sanger sequencing or next-generation sequencing technologies. The sequencing results provide information on the methylation status of individual cytosines within the target region.Overall, the RT-PCR process for bisulfite sequencing involves bisulfite treatment of DNA, reverse transcription to convert bisulfite-treated DNA into cDNA, PCR amplification of the target region, purification of the DNAproduct, and sequencing analysis.中文回答：重亚硫酸盐测序PCR实验流程包括以下几个步骤。
BSAS亚硫酸氢盐扩增子测序具体方法及步骤
BSAS亚 硫 酸 氢 盐 扩 增 子 测 序 具 体 方 法 及 步 骤
BSAS亚硫酸氢盐扩增子测序具体方法及步骤 根据特异基因区域或CpG 岛的序列设计实验，Bisulfite PCR 扩增之后结合第二代高通量测序，能避免载体克隆测序的大量工 作量和高昂成本，大大提高DNA甲基化分辨率的同时完成多个样本多个候选区域的DNA 甲基化分析。技术优势 特异基因扩增，媲美亚硫酸盐克隆，更高效。 技
亚硫酸氢盐修饰后测序法
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。
希望能够对大家有所帮助。
第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
应用亚硫酸氢盐修饰后PCR联合TA克隆测序_省略__cadherin启动子区甲基
ISSN 1007-7626 CN 11-3870 / Q 中国生物化学与分子生物学报http: //c jbmb．bjmu．edu．cnC hinese Journal of B iochemistr y and M olecular B iol ogy2014 年6 月30( 6) : 611 ～616·技术与方法·DOI: 10．13865/j．cnki．cjbmb．2014．06．014应用亚硫酸氢盐修饰后PCＲ联合TA 克隆测序对E-cadherin启动子区甲基化水帄的检测贾文亮1) ，张庆瑜1) * ，李素丽1) ，周芳1)，张安玲2)( 1 ) 天津医科大学总医院消化内科，天津300052; 2 ) 天津市神经病学研究所脑肿瘤室，天津300052)摘要E-cadherin是一种细胞粘附因子，通过增强细胞之间的粘附而起到抑制肿瘤转移的作用．E- cadherin基因启动子区的高甲基化是导致其在众多肿瘤细胞中表达下调甚至缺失的主要原因之一．本实验首先抽提SGC-7901细胞( 胃腺癌细胞) 、A549细胞( 肺腺癌细胞) 、MC F-7细胞( 乳腺癌细胞) 等3个肿瘤细胞株的全基因组DNA，然后对抽提的DNA进行亚硫酸氢盐修饰和纯化回收，根据修饰后的DNA序列设计引物并对其进行P CＲ扩增．然后将P CＲ扩增产物与p U C-T T A载体连接并转化入感受态大肠杆菌DH5α中进行培养，对筛选出的含有阳性重组子的菌落进行测序．测序结果显示，3个肿瘤细胞株的E-cadherin基因启动子区的C pG岛都呈现了高度的甲基化，亚硫酸氢盐的修饰效率达到了99.2%．综上研究表明，亚硫酸氢盐修饰后P CＲ( B SP) 联合T A克隆测序可以对肿瘤细胞某基因启动子区C pG岛的甲基化水帄进行精确量化，研究所使用的3个肿瘤细胞株均可作为研究肿瘤细胞E-cadherin基因甲基化的细胞模型．关键词甲基化; 亚硫酸氢盐修饰后PCＲ; E-cadher in中图分类号Q26; Q5-3Detection Methylation of E-cadherin Gene Promoter by Combination of PCＲ with TA Clone Sequencing after Bisulfite ModificationJIA Wen-L iang1)，Z HANG Qing-Yu1) * ，L I Su-L i1)，Z HOU Fang1)，Z HANG An-L ing2)( 1) Department of Gastroenterol ogy，General Hospi tal of Ti anji n Medi cal Uni versity，Ti anjin 300052，Chi na;2) Laboratory of Neuro-oncol ogy，Ti anjin Neurol ogi cal Insti tute，Ti anjin 300052，Chi na)A b s t ract E-cadherin is a adhesion molecule w hich can suppress tumor invasion and metastasis byenhancing the adhesion bet w een cells and cells．Hypermethylation of E-cadherin gene pr om oter is one of the most important causes w hich lead t o E-cadherin dow n-expression or deficiency，a common phenomenon in a variet y of tum or cells． T he f irst step w as t o isolate genomic DNA f r om three tumor cells ( SGC-7901，A549and MC F-7) and then converted the isolated DNA using bisul f ite． T hen w e ampli f ied the bisul f ite converted DNA w ith speci f ic primers，ligated the P CＲproducts int o pU C-T T A plasmid vectors a nd then trans f ected int o E．c ol i DH5α．At last the positive recombinants w ere chosen andsequenced． T he r esults d emonstrated t hat high methylation w as i n all three tumor cells a nd the transformation rate from cytosine to thymine except the CpG sites reached 99. 2% ．Accurate quantification of methylation status of some genes can be obtained by the method of BSP combined with TA clone sequencing and all the three tumor cells can be used as cell m odels for the study of methylation收稿日期: 2014-01-06; 接受日期: 2014-03-22国家自然科学基金项目(N o． 81172356)，天津市自然科学基金重点项目( 10JCZDJC18500)*联系人Tel: 022-********;E-mail:z h angqy@ tijmu．edu． cnＲecei v ed:Januar y 6，2014;Accept ed:M arch 22，2014Supported by Nati o nal Natural Sci ence F o und ati o n of Chin a(N o． 81172356) and Natural Scien ce F o und ati o n of Tianjin(N o． 10JCZDJC18500)*C o rresponding author Tel: 022-********;E-mail:z hangqy@ tijmu． edu． cn612 中国生物化学与分子生物学报第30 卷of E-cadherin gene．Key words methylation; bisulfite sequencing PCＲ; E-cadherin肿瘤的发生发展与多种抑癌基因的失活有关［1］．肿瘤中许多抑癌基因的失活是由于基因启动子区C pG岛的异常甲基化引起的［2-5］．E-cadherin是钙依赖性上皮细胞粘附蛋白，是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的重要粘附分子，它可能通过促进同种细胞之间的粘附，减少癌细胞脱离原发灶向远处转移．众多研究表明，肿瘤细胞中普遍存在E-cadherin的表达下调甚至缺失，并且证明该基因启动子区C pG岛的高甲基化是导致该基因在肿瘤细胞中失活的主要原因之一［6-8］．D NA甲基化是一种DNA表观遗传修饰方式，是指在甲基转移酶的作用下，基因组C pG位点中的胞嘧啶共价结合1个甲基基团．而当此过程发生于基因启动子区的C pG岛时，可能通过阻碍转录因子与靶序列的结合或者改变染色质结构等机制，抑制基因的转录和表达．成熟的基因甲基化检测方法有很多种，但基本上都是以亚硫酸氢盐修饰为基础，其原理是单链DNA的胞嘧啶与亚硫酸氢盐作用生成6-磺基胞嘧啶，后者经水解脱氨生成尿嘧啶，而5甲基胞嘧啶则不能被修饰，然后利用不同的方法将这种差异呈现出来．亚硫酸氢盐修饰后测序P CＲ( B SP) 联合T A克隆测序即为一种基于亚硫酸氢盐修饰的定量研究方法，可以对基因启动子区数十个乃至数百个C pG位点的甲基化水帄进行精确量化［9］．本研究应用B SP联合T A克隆测序，检测SGC- 7901，A549，MC F-7等3个肿瘤细胞株中E-cadherin基因启动子区C pG岛的甲基化水帄，探讨该方法在基因甲基化研究中的应用并筛选出可以用于E-cadherin基因甲基化研究的细胞模型．1 材料与方法1. 1 材料胃腺癌细胞株S G C-7901(第四军医大学樊代明院士赠送) ; 肺腺癌细胞株A549(来自天津医科大学总医院肺癌研究所) ; 乳腺癌细胞株MC F-7 ( 来自天津医科大学总医院神经病学研究所) ;ＲP M I-1640培养基( Gibc o 公司) ; 胎牛血清( H y cl o ne公司) ; DNA提取试剂盒( B l oo d＆C ellC ulture DNA M ini Kit，Qia g en公司) ; 亚硫酸氢盐修饰试剂盒( Epi T ect B isul f ite K it，Qia g en公司) ; 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pU C-T T A连接试剂盒、大肠杆菌( E．c o li DH5α) 均购自北京康为世纪公司; 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷( X-Gal) 、异丙基-β-D硫代半乳糖苷( IPTG) 均购自TaKaＲa 公司; 氨苄西林( 北京索莱宝科技有限公司); 引物合成( 北京赛百盛基因技术有限公司) ; 测序( 北京华大基因公司) ．1. 2 细胞培养在5% C O2 ，37℃培养箱中，用含有10%胎牛血清的ＲP M I-1640培养基对3个肿瘤细胞株进行培养1.3DNA提取及亚硫酸氢盐修饰分别取对数生长期的3种肿瘤细胞，用B l ood＆C ell C ulture DNA M ini Kit试剂盒抽提全基因组DNA，主要包括4步: 1) 裂解: 在变性条件下用蛋白酶K裂解样本; 2) 结合: DNA结合到膜上，而杂质流出; 3) 清洗: 将残留的杂质洗掉; 4 ) 洗脱: 将高纯度、浓缩的DNA从硅胶膜上洗脱．取2μg DNA按照Epi T ect B isul f ite Kit试剂盒说明进行亚硫酸氢盐修饰及纯化．1. 4 引物设计及PCＲ扩增引物设计: DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后，DNA双链中非甲基化“C”脱掉氨基转化为“U”，通过之后的P CＲ，将“U”转化为“T”，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化“C ”发生上述转化，故除了C pG岛上的5甲基胞嘧啶( 5m C) 之外，所有非甲基化的“C ”都转换成了“T”．引物序列F or w ard: 5'- TTT AG T AA TTTT AGG TT AGAGGG TT-3'; Ｒeverse: 5'- CT AA TT AA CT AAAAA TTC A CCT A CC-3'．P CＲ反应体系共25μL 包括12.5μL HotStar T aq M aster M i x、上下游引物( 10μmol/ L) 各1μL、9.5μL ddH2 O、1μL经过亚硫酸氢盐处理的DNA样本．反应步骤: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s、50℃30 s、72℃30 s，30个循环; 72℃5m in．1. 5 PCＲ产物克隆及筛选按照北京康为世纪公司琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒说明纯化回收PCＲ产物; 将纯化回收的PCＲ产物与pUC-T TA 载体连接后转化入感受态大肠杆菌DH5α 中，将大肠杆菌DH5α 涂布至含有X-Gal、IPTG 及氨苄西林的L-琼脂帄板培养基上培养筛选，待形成单菌落，计数白色及蓝色菌落，挑选至少10 个白色菌落分别转移至SOC 液体培养基中置于37℃ 摇床振荡培养扩增，使用BcaBEST Sequencing第6 期贾文亮等: 应用亚硫酸氢盐修饰后PCＲ联合TA 克隆测序对E-cadherin 启动子区甲基化水帄的检测613Primers和M13通用引物行菌液P CＲ后，使用琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子，将符合预期的菌液送至北京华大基因公司进行测序．1. 6 分析测序结果将测序结果与GenBank数据库E-cadherin基因启动子区C pG岛原始序列进行比对分析．2 结果2. 1 E-cadherin 基因启动子区部分CpG 岛序列分析在GenBank 上找到E-cadherin 基因启动子区的原始序列，输入到“M ethP r im er”软件中，按照CpG 岛的定义设置参数，即“长度超过200bp，G C 含量大于50%，C pG的观察值/预测值比例高于0.6”，可以找到2个C pG岛，为便于研究，一般选择C pG位点相对比较密集的C pG岛设计引物，如Fi g．1所示是一个C pG位点相对比较密集的C pG岛及所有的C pG位点．若原始序列中的“C G”位点的C 为甲基化的C，则经B SP后C 不变，“YG”仍为“C G”; 若原始序列中的“C G”位点的C 为非甲基化的C，则经B SP后C 转化为T，“YG”即表示“T G”，而所有非“C G”位点的C 均转化为T．实验所检测的片段长130bp，含有10个C pG位点，即包含于Fi g．1所示的C pG岛的序列中．F ig． 1 P r ofile of o n e CpG isl and wi th i n E-c adh e r i n ge n e p r o m o t e r(－ 406 bp～ + 167 bp) All the CpG sites w ere in li g ht g reen． The re g i o n f r o m － 186 bp t o- 57 bp underlined w hich c o ntained 10CpG sites w ere ch o sen fo r B S P ampli f ica ti o n． A f ter bisul f ite m o di f icati o n，the “CG”chan g ed int o“UG”i f the o ri g inal “CG”w as unmeth y lated o r unchan g ed i f meth y lated2. 2 BSP 电泳结果以亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板行B SP，所得产物行琼脂糖凝胶电泳．如Fi g.2所示，SGC-7901、A549、MC F-7等3种肿瘤细胞在约130bp处均可见理想的目的条带，未见引物二聚体及非特异性扩增产物．2. 3 蓝白斑筛选将纯化回收的B SP产物与pU C-T T A载体连接后，转化入感受态大肠杆菌DH5α中．将大肠杆菌DH5α涂布至含有X-Gal、IP T G及氨苄西林的L-琼脂帄板培养基上，经培养后形成了蓝斑菌落和白斑F ig． 2 Ag a r ose gel elec t r o ph o r esis of BS P p r o du c t s i n S GC-7901，A549 and MCF-7 Bisul f ite c o n v erted DNA w as ampli f ied w ith spec i f ic primers． Then PCＲ pr o ducts w ere separated in 2% a g ar o se g el e lectr o ph o resis． Ideal bands w ere fo und in the re g i o n of130 bp in all three tum o r cells．M:M arker; 1:S GC-7901; 2: A549; 3:M CF-7菌落，根据蓝白斑筛选的原理，白斑菌落中含有目的614 中国生物化学与分子生物学报第30 卷片段( Fi g．3) ．2. 4 重组子PCＲ鉴定结果将白斑菌落转移至SOC 液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养扩增，使用B caBE ST Sequencing Primers和M13通用引物行菌液P CＲ后，使用琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子，将符合预期的菌液送至北京华大基因公司进行测序．如Fi g．4所示，3个肿瘤细胞株在约274bp处均可见到理想的重组子目的条带．F ig． 4 Ag a r ose gel elec t r o ph o r esis of p osi t ive r eco mb i nant s i n S GC-7901，A549 and MCF-7 Trans f erred the w hite plaque int o liquid S OC culture medium and incubated o n r o tat o r y shaker in 37℃． The rec o mbinants w ere identi f ied b y the meth o ds of PCＲw ith g eneral primers(S equencin g Primers and M13 ) and a g ar o se g el electr o ph o resis fo ll ow ed．M:M arker; 1:S GC-7901; 2: A549; 3:M CF-7 2. 5 测序结果分析2. 5. 1 亚硫酸氢盐的修饰效率检测将亚硫酸氢盐修饰后的序列与原序列进行比对，检测亚硫酸氢盐的修饰效率，序列中共有32 个非CpG 位点的C，3个肿瘤细胞株，每个细胞株5 个重组子共480 个非CpG 位点的C，只有4 个非CpG 位点的C 未被转化成T，非CpG 位点的C 转化成T 的效率为476 /480×100%=99.2%．据此认为结果可信．2.5.2测序结果分析如Fi g．5所示，所检测的片段长130b p，包含10个C pG位点，每个细胞系检测5个阳性重组子，3个肿瘤细胞株均呈现高度的甲基化，SGC-7901细胞中49/50、A549细胞中46/50、MC F-7细胞中47/50的“C G”位点呈现甲基化．如Fi g．6所示，3个肿瘤细胞株中的“C G”经B SP试验后绝大部分仍然为“C G”，说明原始序列中C G位点中的C 为甲基化的C，而单独存在的C 均转化为了T．F ig． 5 BS P ana lysis of E-c adh e r i n p r o m o t e r i n S GC-7901，A549 and MCF-7 Each line of squares represented a sin g le cl o ned allele．Fi v e sin g le cl o nes are represented fo r each cell． White square indicated unmeth y lated CpG site and black square represented meth y lated CpG site． 1:S GC-7901;2: A549; 3:M CF-73 讨论现代肿瘤理论认为，肿瘤的浸润、扩散及转移与肿瘤细胞之间的粘附因子的缺失密切相关．作为粘附因子之一的钙粘蛋白( cadherin) 是一组C a2 + 依赖性跨膜糖蛋白，主要有3种亚型E、N、P，而E- cadherin是其中最重要的一种，是公认的抑癌因子．相邻细胞间E-cadherin胞外区交错排列形成反向帄行二聚体，使相邻同种上皮细胞紧密粘附在一起，从而发挥其抑制肿瘤扩散及转移的功能．DNA甲基化是一种DNA自然修饰方式，是指在甲基转移酶作用下，基因组C pG的胞嘧啶共价结合1个甲基基团［10］．而当此过程发生于基因启动子区的C pG岛时，可能通过阻碍转录因子而促进转录抑制因子与靶序列的结合，或者改变染色质结构等机制，从而抑制目标基因的转录和表达．DNA甲基化作为一种重要的表观遗传机制，其分析方法多种多样，常用的方法包括甲基化特异性P CＲ( M SP) ［11］、结合重亚硫酸氢盐的限制性内切酶法( C O BＲA) ［12］、荧光定量法、亚硫酸氢盐修饰后的焦磷酸测序［13］、亚硫酸氢盐修饰后测序P CＲ(B SP) 等．但基本上都是以亚硫酸氢盐修饰为基础．其原理是单链DNA的胞嘧啶与亚硫酸氢盐作用生成6- 磺基胞嘧啶，后者经水解脱氨生成尿嘧啶，而5甲基胞嘧啶则不能被修饰，然后通过不同的方法将这种差异显示出来．目前，国内外关于E-cadherin基因的甲基化的研究基本都局限于M SP法［14-16］，作为一种定性研究方法，其原理同样是首先行亚硫酸氢盐修饰，在P CＲ反应时，根据亚硫酸氢盐修饰后可能产生的两种不同序列设计两套特异性引物进行扩增．此方法特点是灵敏度高，可以检出比例为千分之一的甲基化等位基因片段，且对DNA的质和量要求也较低．该方法简便快速、费用低廉，但是如果引物设计不恰当或者是亚硫酸氢盐修饰不完全，会导第 6 期贾文亮等: 应用亚硫酸氢盐修饰后 PC Ｒ 联合 TA 克隆测序对 E-cadherin 启动子区甲基化水帄的检测 615F ig ． 3 Wh i t e -b l u e p l aqu e selec t io n The B S P pr o ducts w ere li g ated w ith pUC -T TA plasmid v ect o rs and then trans f ected int o E ． co li D H5α． Applied the D H5α o nt o s o lid a g ar culturemedium c o ntainin g X -Gal ，IPTG and ampicillin and then fo rmed t wo kinds of c o l o nies ， w hite and blue ． Acc o rdin g t o the principle of “w hite -blue plaque selecti o n ”，the w hite plaque c o ntained tar g et DNA f ra g ments致假阳性结果出现． 另外，由于此方法的设计是以 所有 C pG 位点胞嘧啶均完全甲基化为前提设计的， 事实上并非 C pG 岛中每个 C pG 位点都完全甲基化， 所以 M SP 方法还存在特异性差的问题．本实验 中 采 用 B SP 联 合 T A 克 隆 测 序 对 E - cadherin 基因启动子区的甲基化水帄进行检测． 其 原理同样是首先行 DNA 的亚硫酸氢盐修饰，但在行 P C Ｒ 扩增时设计的引物不是和所要检测的片段结 合，而是和所要检测的片段两端的序列结合，并且尽 量避开 C pG 位点，以免受甲基化因素的影响，所得 的 P C Ｒ 产物连入载体进行测序，测序后与原始序列 进行比对分析． 作为一种定量研究方法，其最大的优 势在于可以明确所研究 DNA 片段中每 1 个 C pG 位 点的甲基化状态． 本实验中使用 B SP 联合 T A 克隆 测序对 E -cadherin 基因启动子区中一段长 130 bpF ig ． 6 Pa r t of th e b is u lf at e se qu e n ci n g d i a g r am Mo st of the “CG ”remained “CG ”in three tum o r cells a f ter bisul f ite c o n v ersi o n and B S P ampli f icati o n w hile m o st o f the “C ”w hich w ere n o t adjacent t o “G ”w ere c o n v erted t o “T ”． ( A ) S GC -7901; ( B ) A549; ( C ) M CF -7616 中国生物化学与分子生物学报第30 卷包含了10个C pG位点的片段的甲基化水帄进行测定，使用该方法多次重复实验，均能得到理想的B SP 扩增产物，说明引物可靠．将纯化回收的B SP产物与pU C-T T A载体连接后转化入感受态大肠杆菌DH5α中，根据蓝白斑筛选的原理［17］，筛选出含有阳性重组子的白斑菌落．此为测序之前对阳性样本的第一次筛选，但存在假阳性的可能．以含有白斑菌落的菌液为模板，使用B caBE ST Sequencing Primers和M13通用引物，行菌液P CＲ对阳性样本进行第2次筛选，可排除第1次筛选后可能存在的假阳性样本，保证了测序标本的准确性．又为了增加实验结果的可信度，每个肿瘤细胞株检测5个阳性重组子．以上均为测序之前保证实验结果准确的措施．而在进行测序结果分析时，质控实验结果的关键措施是亚硫酸氢盐修饰效率的计算，理论上哺乳动物中DNA甲基化只发生在5'-C pG-3'，而单独存在的不与G相邻的C 是不发生甲基化的，所以最终的测序结果中单独存在的不与G相邻的C 都应转化为T，但由于可能会存在亚硫酸氢盐修饰不彻底的情况，造成部分单独存在的不与G相邻的C 未能转化为T，但其比例必须控制在1%以下，否则最终的测序结果就不足信．本实验中统计了所有阳性重组子共480个非C pG位点的C，只有4个非C pG 位点的C 未被转化成T，亚硫酸氢盐修饰效率达到了99.2%，据此认为测序结果可信．测序结果表明，SGC-7901、A549和MC F-7等3个肿瘤细胞株E- cadherin基因启动子区C pG岛均呈现高度的甲基化，这也印证了肿瘤中普遍存在抑癌基因甲基化的论点．总之，B SP联合T A克隆测序能较为全面地显示基因启动子区C pG岛的甲基化状态，准确度较高．但由于该方法所需财力人力较大，限制了其应用，所以可以将M SP法和B SP法联合应用，用M SP 法对某基因是否存在甲基化进行初步筛查，对筛查阳性的基因再使用B SP法进行细致的研究．参考文献( Ｒeferences)［1 ］Weinber gＲA． Finding the anti-o nc og ene［J］． Sci Am，1988，259( 3) : 44-51［2 ］Hansen K D，Timp W，Bra vo H C，e t al．Increased methylati o n v ari ati o n in epi g en etic domains acr o ss can cer t y pes ［J］． NatGenet，2011，43( 8): 768-775［3 ］ Zemach A，M cd aniel I E， Sil v a P，e t al．Genome-w idee vo luti o nar y anal y sis of eukar yo tic DNA methylati o n［J］．Sci ence，2010，328( 5980): 916-919［4 ］Scart ozz i M，Bear z i I，M andolesi A，e t al．Epid ermal g r o w thf act o r recept o r(EGFＲ)g ene pr o m o ter methylati o n and cetuximabtreatment in c o l o rectal can cer patients［J］． Br J Cancer，2011，104( 11): 1786-1790［5 ］ Vrba L，Jens en T J，Garbe J C，e t al．Ｒo le fo r DNA methylati o n in the re g ulati o n of miＲ-200c and miＲ-141 e x pressi o n in normaland cancer cells ［J］．PL o S On e，2010，5( 1):e8697［6 ］ L o mbaerts M，v an We z el T，Philippo K，e t al．E-cadh erin transcripti o nal do w nre g ulati o n by pr o m o ter methylati o n but notmutati o n is related t o epithelial-t o-mesen chymal transiti o n inbreast cancer cell lines ［J］． Br J Cancer，2006，94 (5 ): 661-671［7 ］ Grec o M，D'Al o F，Scardocci A，e t al．Pr o m o ter methylati o n of DAPK1， E-cadherin and thr o mbospondin-1 in de no vo andtherapy-rel ated m y el o id ne o plasms［J］． Bl o o d Cells M o l Dis，2010，45( 3): 181-185［8 ］ Li C，D o ng J，Chen M Q，e t al．E ff ects of CDH1 g en e pr o m o ter methylati o n o n e x pressi o n of E-cadherin and beta-cat enin and itsclinic o p athol og ical si g ni f icance in c o l o n carcinoma［J］． Chin JGastr o ent er o l Sur g，2011，14( 7): 538-541［9 ］Li L C， Dahi y a Ｒ．M ethPrimer: desi g ning primers fo rmethylati o n PCＲs［J］． Bi o inf o rmatics，2002，18 ( 11 ): 1427-1431［10］Kaneda M，Okano M，Hat a K，e t al．Essential r o le fo r de no vo DNA methyltrans f erase Dnmt3a in paternal and maternalimprintin g［J］．Nature，2004，429( 6994): 900-903［11］Herman J G，Gra ff J Ｒ，M yo h an en S，e t al．M ethylati o n-speci f ic PCＲ: a novel PCＲ assay for methylation status of CpG islands［J］．Pr o c Natl Acad Sci U S A，1996，93( 18): 9821-9826［12］Xi o ng Z，Laird P W．COBＲA: a sensiti v e and qu antitati v e DNA methylati o n assa y［J］． Nuclei c AcidsＲes，1997，25(12): 2532-2534［13］T o st J，Gut I G． DNA methylati o n anal y sis by pyr o sequencing ［J］．Nat Pr o t o c，2007，2( 9): 2265-2275［14］Nass S J， H erman J G， Gabriels o n E，e t al． Aberrant methylati o n of the estr og en recept o r and E-cadherin 5' CpGislands increas es w ith mali g nant pr og ressi o n in human breastcan cer ［J］．Can cer Ｒes，2000，60( 16): 4346-4348［15］Lin H H，Ke H L，Huang S P，e t al． Increas e sensiti v it y indetecting super f icial，l o w g rad e bladder cancer by c o mbin ati o nanal y sis of hypermethylati o n of E-cadherin，p16，p14，ＲASSF1Ag en es in urine［J］．Ur o l Onc o l，2010，28( 6): 597-602［16］Ｒan Y，Wu S，Y o u Y． Demethylati o n of E-cadh erin g ene in nas o ph ar y ngeal carcinoma c o uld s er v e as a potential therap euticstrate g y［J］．J Bi o ch em，2011，149( 1): 49-54［17］Sher woo d A L．Virtual eliminati o n of f alse positi v es in blue-w hitec o l o ny screening ［J］．Bi o techniqu es，2003，34( 3): 644-647。