百合中LiLFY1基因的分离及表达

百合中LiLFY1基因的分离及表达摘要：LFY基因家族在植物开花方面主要起着保守调节的作用。

在此，我们运用RT-PCR 以及RACE技术从百合中分离出了LiLFY1的cDNA片段。

LiLFY1基因能够编码一个LFY转录因子。

推导LiLFY1基因编码的蛋白然后于其他已知的LFY的家族编码的蛋白进行比对分析，结果表明LiLFY1基因与大米中RFL基因以及玉米中的FLL基因具有高度同源性。

Southern 杂交试验结果表明在百合中有两个LFY基因家族的拷贝。

在幼嫩的花蕾，芽顶端分生组织中有LiLFY1基因的表达但在根部、芽、成熟的叶片，以及成熟的花器官中没有此基因的表达。

将克隆的LiLFY1基因用于基因工程，从而可以调控百合开花时间。

关键字：百合、LFY转录因子、LiLFY1、表达、开花1.前言开花是植物从营养生长到生殖的一个重要转折点。

研究拟南芥开花时间的调控机制，结果表明植物的开花是由众多因素共同调控作用。

一般来说，在拟南芥有四条途径调控着开花时间。

它们分别是光周期途径、春化途径、自主途径、GA调节途径。

这四条途径并不是孤立存在着，他们间存在着交互互作用(Blazquez and Weigel 2000; Mouradov et al. 2002;Putterill 2001)，而且现在我们都知道正是LEY基因将这些途径整合到一起。

LEY调节拟南芥开花起着非常重要的作用(Hempel et al. 1997; Schultz andHaughn 1991)。

在拟南芥中，LEY基因编码着一类植物特殊的转录因子(Blazquez et al. 1997; Mandel and Yanofsky 1995; Weigel et al. 1992)。

LEY基因最基本的功能就是抑制营养器官的生长和促进成花组织的形成，以及激活不同花器官形成的基因的表达。

在拟南芥中LEY基因突变能够引起迟花现象以及能够将一些花组织逆转为花序组织，然而LFY转基因的拟南芥植株中所有的都能转化为花(Buschet al. 1999; Lee et al. 1997; Wagner et al. 1999)。

自从1990年Coen在金鱼草中发现了第一个LFY基因家族的FLO基因以来,在许多植物像水稻、小麦、豌豆等物种中都分离出了LFY的家族基因(Dornelas and Rodriguez 2006; Hofer et al. 1997; Kelly et al. 1995; Kyozuka et al. 1998; Shitsukawa et al. 2006)。

已经鉴定的LFY家族基因不论结构还是它们的功能都具有高度保守性(Ma et al. 2005)。

研究发现LFY家族蛋白的氨基酸同源性为91%到44%之间不等。

LFY转基因杨树与非转基因杨树相比，转基因杨树能够在较短的时间内幼苗就能够达到较成熟的状态。

PTLF基因是一类由杨树中分离出的LFY家族基因，它的转基因拟南芥植株能表现出早的成花现象而非转基因拟南芥植株却限制成花(Rottmann et al. 2000)。

在水稻中分离出的RFL基因也属于LFY 基因家族，它能够使一些lfy突变植株的表型恢复，不过不能够改变水稻开花时间尽管它能够影响水稻花序组织建成(Kyozuka et al. 1998)。

在不同物种间LFY家族基因的拷贝数以及表达模式是都是有差异的(Sliwinski et al. 2006)。

百合(Lilium longiflorum Thunb.)是备受喜欢的单子叶开花植物，但有关LFY家族基因在百合内的研究尚未报道。

对于大多数百合属植物从播种到开花通常需要2-3年时间，因此通过遗传工程学和生物技术方法在百合中分离出能够促进开花缩短童期的基因有着良好的发展潜力。

2.1材料和方法2.11植物材料和试剂用于本次试验的百合植株采自中国北京百合资源圃，由赵祥云教授提供。

限制性内切酶以及连接酶由Promega公司提供，Taq酶为TaKaRa公司产品，Trizol试剂为Invitrogen 公司的产品。

2.2 LiLFY1基因的分离运用Trizol试剂法提取百合早期花芽（大约5毫米）的总RNA。

去除DNA后，运用M-MLV 反转录合成酶从5 µg总RNA中合成cDNA然后将此作为模板进行降落PCR反应。

我们根据LFY的同源序列LEY、FLO以及RFL而设计得到引物，然后利用这对兼并性引物LEY-F和LEY-R进行PCR的扩增，最后我们得到两条序列。

测序表明那个含有831个碱基的片段是LFY家族基因。

特异性长引物LiLFY1 3RE-F用来进行3’-RACE，另一个引物CDS III/3’PCR,是由SMART TM cDNA文库试剂盒提供(Clontech, USA)得到.特异性检测引物LiLFY1 3RE-TF 和 LiLFY1 3RE-TR用来检测3’-RACE的产物。

对于5’-RACE，我们设计了特异性长引物LiLFY1 5RE-R35和 LiLFY1 5RE-R2进行两个连续地降落PCR反应。

对于第一个降落PCR，从早期的百合花芽得出的RNA反转录得到的cDNA为模板，利用SMART TM cDNA文库试剂盒提供(Clontech公司, USA)的引物LiLFY1 5RE-R35 和SMART5´寡聚引物进行反应。

然后我们得到分散片段，。

第二次降落PCR反应，运用兼并一对引物LiLFY1 5RE-R2和 LiLFY1 1-21，得到了大约500个碱基的片段。

测序分析表明这个片段是LiLFY1的一部分，LiLFY1基因5’末端降落PCR反应程序如下：95 °C变性，5分钟、其次是20次的循环反应：95°C 变性40s、65 C复性40s（之后每一个循环降低0.5°C）、72°C延伸90s：然后进行30次循环反应：95°C变性40s、60° C复性40s、72°C延伸90s，最后一次延伸反应持续5分钟。

所使用的引物罗列在后面的表格中。

2.3同源序列分析以及系统发育分析运用DNAStar以及BLAST系统进行同源序列的分析。

使用属于LiLFY1蛋白的结构域中的396个氨基酸来进行多蛋白的序列比对。

通过运用MEGA2连接软件连接1000个条带试验得到了系统发生图。

用于在这项研究中的基因登录号如下：矮牵牛花×ALF(ALF030171），蓝桉ELF1（AF034806），番茄FAL（AF197936），菊花甘菊DFL（AY559245），加拿大罂粟EcFLO（AY188789），甘蓝BoFH（Z18362），黄瓜CFL（AF059320），金鱼草FLO（M55525）拟南芥LFY（M91208），苹果属AFL2（AB056159），葡萄VFL（AF450278），杨柳RFL（AB005620 ）豌豆FLL(AY179883），以及银杏（AF105111）。

2.4 Souther 杂交试验分析运用SDS试剂分离叶片基因组，基因组DNA使用限制性内切酶来消化，具体限制性内切酶为：BamH I，EcoRⅠ，EcoR V，XbaⅠ， KpnⅠ和HindⅢ，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，并涂抹在带正电的尼龙膜膜上（Amersham公司）。

杂交试验使用TaKaRa公司提供的P32同位素和标签试剂盒进行。

基因特异性杂交探针是通过PCR获得，所用基因特异引物有LiLFY1，LiLFY1PF，和LiLFY1 PR（表所示。

2.5 RT - PCR表达分析RT-PCR分析是使用M - MLV第一链合成系统（Promega公司）。

从根，叶，茎端分生组织，早期的花蕾，和不同的花器官提取的总RNA（5μg）用于合成第一链cDNA使用的是寡聚dT 引物。

采用引物LiLFY1 TF和LiLFY1 TR进行RT – PCR反应，以及15μLRT – PCR产物在琼脂糖凝胶电泳检测以及在紫外灯下观察并拍照。

作为对照，2μL 第一链RT - PCR产物被用于扩增表达百合肌动蛋白的基因，使用引物，Liact - F和Liact - R，分别作为上游和下游引物。

3 结果3.1LiLFY1的分离提取由于LFY家庭基因的结构是高度保守的，根据LFY的保守序列，LFY、FLO和RFL设计出一对简并引物，LFY - F和LFY - R。

RT – PCR是使用这对引物，由早期百合芽（约5毫米长）的得出的cDNA作为模板从而进行反应。

最终，我们获得了两个片段（图1-A）。

测序后，比对分析，证明一个片段属于LiLFY1的一部分它含有831个碱基并表现出较高的保守性，与已知的LFY的蛋白家族基因相类似。

对于3' – RACE反应，基因特异性引物，LiLFY1 3RE -F是根据LiLFY1片段得出的。

RT–PCR反应是利用引物LiLFY1 3RE-F和CDSⅢ/ 3“，由早期的的百合花芽（约5毫米长）得出的cDNA为模板来进行反应的。

最后，获得约500 个碱基的片段（图1 - B）。

利用一对测试引物LiLFY1 3RE - TF和LiLFY1 3RE – TR来进行PCR反应，然后由阳性克隆测序。

结果表明它属于LiLFY1的3'位置的片段，在多聚A尾巴前面，长约232个碱基。

对于5' –RACE反应，设计了两个基因特异引物，LiLFY1 5RE - R和LiLFY1 5RE - R2以及简并引物，LiLFY1 1-21RT - PCR和第一次降落PCR反应都是利用引物LiLFY1 5RE - R 和SMART 5´寡核苷酸，使用的从早期的百合花芽（约5毫米长）中得到的cDNA为模板，来进行反应的。

随后进行的第二次降落PCR反应，得到大约500碱基长的片段（图1 - C）。

经过对片段进行测序，结果表明，这是LiLFY15'端片段，其中包含启动子之后291个碱基。

所以，全长约1 387 碱基的LiLFY1的cDNA，通过RT –PCR已经得到，LiLFY1在基因库中的编号是是EF458319。

Fig. 1 LiLFY1的提取. A, RT-PCR; B, 3´-RACE; C, 5´-RACE.M, 分子量标签; CK, H2O是模板; 1,模板：由雪皇后得到的cDNA作为模板进行RT-PCR，得到的片段831bp; 2, 由雪皇后得到的cDNA作为模板进行3´-RACE的产物; 3, 第一次降落PCR在5´-RACE 由雪皇后得到的cDNA作为模板; 4, the第二次降落PCR在5´-RACE.3.2测序分析以及系统发育分析LiLFY1基因编码一个含396个氨基酸的蛋白质，残留着有着明显的LFY结构域（图2-A），LiLFY1基因编码的氨基酸序列排列以及他的同源染色体来自于单子叶植物和双子叶植物都表明LiLFY1与水稻RFL有52.38％的等同性，与玉米FLL相似度为50.07％与拟南芥的LFY (图.2-B)相似度为48.08％。