第七章蛋白质的分离纯化与表征
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2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。
•如肌红蛋白含铁量为0.335%
铁的原子量
55.8
•最低相对分子质量=铁的百分含量×100= 0.335 ×100=16 700
•血红蛋白与肌红蛋白一样，但用其它方法得Mr是68000，所以血 红蛋白中含有4个铁。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
一般是根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质和与配体分子的生物 学亲和力等。
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 2.密度梯度(区带)离心 3.凝胶过滤 (1)凝胶过滤的介质 (2)凝胶过滤的原理
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
（1）前处理：细胞破碎，有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研 缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。
(2)粗分离：盐析、等电点沉淀有机溶剂法分离，用PEG浓缩。 (3)细分离：电泳、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等 (4)蛋白质结晶：蛋白质溶液略过饱和。
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凝胶柱床总体积(Total Volume,Vt): 某一溶质组分的洗脱体积(Elution Volum,Ve):自加 样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）或洗脱峰上升边 缘的半高点出现时所流出的体积。 孔隙体积(Void volume)或外体积(outer volume， Vo)或外水体积：存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相 体积。用蓝色葡聚糖－2000检测。 内体积(inner volume,Vi)或内水体积：凝胶珠内部 的水相体积。用小分子的Ve-Vo。 凝胶基质体积(matrix volume，Vm)
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(二) 根据溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和pH控制 2.蛋白质的盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 4.温度对蛋白质溶解度的影响
(三) 根据电荷不同的纯化方法 1.电泳(electrophoresis) 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 3.毛细管电泳(capillary electrophoresis) 4.等电聚焦(isoelectric focusing,IEF) 5.聚焦层析(chromatofocusing) 6.离子交换层析(ion-exchange column chromatography)
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结 合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋 白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋 白质分子的大小。SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子 量 。1.4克SDS/1克蛋白质。不同的蛋白质的SDS复合体具有几乎相同的荷质比。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(一) 蛋白质的胶体性质
稳定胶体具备3个条件： 1.分散相质点大小在1~100nm范围，这在动力学上是稳定的，可不 断作布朗运动。 2.分散相质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集形成大颗粒而沉 淀。 3.分散相能与溶剂形成溶剂化层，这样质点相互不易靠拢而聚集。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(二) 蛋白质的沉淀
蛋白质的稳定性与质点大小、电荷和水化有关。 （1）盐析法：硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等。通常不引起蛋白质变性，
去盐即可溶解。 (2)有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等。 (3)重金属盐沉淀法：pH＞pI时,蛋白质带负电荷，能与重金属离子作用而变性。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(二) 根据渗透压法测定相对分子质量
当蛋白质分子处于等点时测定的渗透压才不受缓冲 液中无机离子的影响。(范托夫公式)
R：气体常数（8.314J/(K·mol)）
T：绝对温度（K） π：渗透压（N/m2，即Pa） Mr：相对分子量或摩尔质量（g/mol ）
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤
2020/3/1
切向流过滤
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 2.密度梯度离心
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性
•蛋白质中的一些氨基酸的侧链有可解离的基团
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性
•蛋白质的等电点 蛋白质所带正电荷与负电荷相等即净电荷为零， •蛋白质溶液的pH称为蛋白质的等电点。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
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菲克扩散定律：
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(四) 沉降分折法测定相对分子质量 1.沉降速度法(斯维得贝格方程)
2.沉降平衡法
s：单位离心场的沉降速度。 1 ×10-13 ~200 ×10-13秒 把10-13秒作为一个单位， 斯维得贝格单位（Svedberg unit）
(五)凝胶过滤法测定相对分子质量
R：气体常数（8.314J/(K·mol)） T：绝对温度（K） s：沉降系数（s） D：蛋白质扩散系数（cm2/s） v:偏微比容（蛋白质溶于水时为0.74cm3/g） ρ：溶剂密度
应用标准蛋白洗脱速度制作标准曲线进行比算。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
如（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等） (4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH＜pI时，蛋白质带正电荷，能与生物碱和 酸根负离子作用生成不溶性盐，鞣酸、苦味酸、钨酸、KI；三氯醋酸、磺基水杨 酸和硝酸等。 (5)加热变性沉淀：
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
四、蛋白质分离纯化的一般原则
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 3.凝胶过滤
溶质在柱中的移动速度取决于它在 两相之间的分配系数（Kd）:
可用分配系数（available coefficient,Kav）:
两种不同Mr和不同Kav值的组分洗脱体积差：
完全分开两种组分，样品的体积不能大于Vs
常用氯化铯、蔗糖、聚蔗糖（Ficoll）、 (Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）等
2纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 3.凝胶过滤
常用Sephadex、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖等，凝胶的粒度与洗脱流速 和分辨率有关，粒度常用筛眼数或 目数或珠直径。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(三) 蛋白质的扩散和扩散系数 平移扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移称为平移扩散 扩散系数：当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积 所扩散的溶质的量。
蛋白质的扩散系数与分子大小和形状及溶剂的粘度有关。
扩散过程受到蛋白质分子与溶剂间的内磨擦阻力所反抗，这种阻 力大小不仅取决于蛋白质分子的质量，并且还强力地取决于它的 颗粒形状。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
•分离蛋白质的目的 许多蛋白质的研究与应用都要获得 纯蛋白质。如研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理 化学性质，需要纯的、均一的甚至是结晶的蛋白质样品 。 •分离和纯化蛋白质方法的原理 根据蛋白质的之间的各 种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶 解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力进行 分离。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟磷灰石层析 2.疏水作用层析(苯基琼脂糖、辛基琼脂糖) (五) 利用对配体的特异生物学亲和的纯化方法 (六)高效液相层析和快速蛋白质液相层析
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、染料结合法 （Bradford）、胶体金测定法等。 (二)蛋白质纯度鉴定 电泳、沉降、HPLC、SDS－PAGE等。
二、蛋白质分子的大小与形状
(一) 根据化学组成测定最低相对分子质量
•如果已知蛋白质分子中含某种微量元素，并已知其含量，则可测 定此微量元素的含量，计算出最低相对分子质量。
•如肌红蛋白含铁量为0.335%
铁的原子量
55.8
•最低相对分子质量=铁的百分含量×100= 0.335 ×100=16 700
•血红蛋白与肌红蛋白一样，但用其它方法得Mr是68000，所以血 红蛋白中含有4个铁。
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
一般是根据蛋白质的分子大小、溶解度、电荷、吸附性质和与配体分子的生物 学亲和力等。
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤 2.密度梯度(区带)离心 3.凝胶过滤 (1)凝胶过滤的介质 (2)凝胶过滤的原理
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
（1）前处理：细胞破碎，有机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器、在研 缽中或球磨机上磨等。还有超声法、反复冻融法、自溶等方法。
(2)粗分离：盐析、等电点沉淀有机溶剂法分离，用PEG浓缩。 (3)细分离：电泳、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、吸附层析等 (4)蛋白质结晶：蛋白质溶液略过饱和。
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凝胶柱床总体积(Total Volume,Vt): 某一溶质组分的洗脱体积(Elution Volum,Ve):自加 样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）或洗脱峰上升边 缘的半高点出现时所流出的体积。 孔隙体积(Void volume)或外体积(outer volume， Vo)或外水体积：存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相 体积。用蓝色葡聚糖－2000检测。 内体积(inner volume,Vi)或内水体积：凝胶珠内部 的水相体积。用小分子的Ve-Vo。 凝胶基质体积(matrix volume，Vm)
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(二) 根据溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和pH控制 2.蛋白质的盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 4.温度对蛋白质溶解度的影响
(三) 根据电荷不同的纯化方法 1.电泳(electrophoresis) 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 3.毛细管电泳(capillary electrophoresis) 4.等电聚焦(isoelectric focusing,IEF) 5.聚焦层析(chromatofocusing) 6.离子交换层析(ion-exchange column chromatography)
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷，与蛋白质结 合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋 白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋 白质分子的大小。SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子 量 。1.4克SDS/1克蛋白质。不同的蛋白质的SDS复合体具有几乎相同的荷质比。
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二、蛋白质分子的大小与形状
(五) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(一) 蛋白质的胶体性质
稳定胶体具备3个条件： 1.分散相质点大小在1~100nm范围，这在动力学上是稳定的，可不 断作布朗运动。 2.分散相质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集形成大颗粒而沉 淀。 3.分散相能与溶剂形成溶剂化层，这样质点相互不易靠拢而聚集。
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三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(二) 蛋白质的沉淀
蛋白质的稳定性与质点大小、电荷和水化有关。 （1）盐析法：硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等。通常不引起蛋白质变性，
去盐即可溶解。 (2)有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等。 (3)重金属盐沉淀法：pH＞pI时,蛋白质带负电荷，能与重金属离子作用而变性。
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(二) 根据渗透压法测定相对分子质量
当蛋白质分子处于等点时测定的渗透压才不受缓冲 液中无机离子的影响。(范托夫公式)
R：气体常数（8.314J/(K·mol)）
T：绝对温度（K） π：渗透压（N/m2，即Pa） Mr：相对分子量或摩尔质量（g/mol ）
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤
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切向流过滤
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超过滤
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第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 2.密度梯度离心
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性
•蛋白质中的一些氨基酸的侧链有可解离的基团
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性
•蛋白质的等电点 蛋白质所带正电荷与负电荷相等即净电荷为零， •蛋白质溶液的pH称为蛋白质的等电点。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
2020/3/1
2020/3/1
菲克扩散定律：
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
二、蛋白质分子的大小与形状
(四) 沉降分折法测定相对分子质量 1.沉降速度法(斯维得贝格方程)
2.沉降平衡法
s：单位离心场的沉降速度。 1 ×10-13 ~200 ×10-13秒 把10-13秒作为一个单位， 斯维得贝格单位（Svedberg unit）
(五)凝胶过滤法测定相对分子质量
R：气体常数（8.314J/(K·mol)） T：绝对温度（K） s：沉降系数（s） D：蛋白质扩散系数（cm2/s） v:偏微比容（蛋白质溶于水时为0.74cm3/g） ρ：溶剂密度
应用标准蛋白洗脱速度制作标准曲线进行比算。
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
如（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等） (4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH＜pI时，蛋白质带正电荷，能与生物碱和 酸根负离子作用生成不溶性盐，鞣酸、苦味酸、钨酸、KI；三氯醋酸、磺基水杨 酸和硝酸等。 (5)加热变性沉淀：
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
四、蛋白质分离纯化的一般原则
2020/3/1
第七章 蛋白质的分离、纯化和表征
五、蛋白质的分离纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 3.凝胶过滤
溶质在柱中的移动速度取决于它在 两相之间的分配系数（Kd）:
可用分配系数（available coefficient,Kav）:
两种不同Mr和不同Kav值的组分洗脱体积差：
完全分开两种组分，样品的体积不能大于Vs
常用氯化铯、蔗糖、聚蔗糖（Ficoll）、 (Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）等
2纯化方法
(一) 根据分子大小不同的纯化方法 3.凝胶过滤
常用Sephadex、聚丙烯酰胺凝胶、 琼脂糖等，凝胶的粒度与洗脱流速 和分辨率有关，粒度常用筛眼数或 目数或珠直径。