第八章-克隆基因的表达上课讲义
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克隆基因的表达
实际的启动子中很少具备与上述序列完全一 致的区域，启动子的这两个区域与上述保 守序列的相似程度越高，该启动子的表达 能力也就越强。
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
专题八第一讲基因工程和克隆技术课件
本 DNA 连接酶构建的表达载体中仍存在限制酶Ⅱ的识别位点；
讲 栏
用限制酶Ⅱ切割后，编码控制细胞分裂素合成的物质就不能合
目 开
成了。
关
答案 D
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
网络构建·自我诊断
第1讲
2.家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导 入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
高频考点·命题示例
第1讲
必考点 1 基因工程 1.对基因工程基本工具的思考 本 (1)限制酶、DNA 连接酶、载体的化学本质一样吗？
讲
栏 答案 不一样。限制酶和 DNA 连接酶的化学本质是蛋白质，
目
开 载体的化学本质是核酸。
关
(2)限制酶和解旋酶有怎样的区别？
答案 限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条 链中特定的位置断开；而解旋酶是将 DNA 的两条链间的氢 键断开，从而形成两条单链。
第1讲
[自我诊断]
1.质粒是常用的基因工程载体。如图是某种天然土壤农杆菌 Ti
质粒结构示意图(标示了部分基因及部分限制酶作用位点)，据
图分析下列说法正确的是
本 讲 栏 目 开 关
()
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
网络构建·自我诊断
第1讲
A.图中的终止子是由三个相邻碱基组成的终止密码
B.用农杆菌转化法可将该质粒构建的表达载体导入动物细胞
本
讲 C.用限制酶Ⅰ和 DNA 连接酶改造后的质粒无法被限制酶Ⅱ
栏
目
切割
开
关 D.用限制酶Ⅱ处理能防止该质粒构建的表达载体引起植物
疯长
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
网络构建·自我诊断
基因的表达汇总讲解PPT课件
酸合成肽链，其碱基排列顺序如下：
AUUCGAUGAC……(40个碱基) ……CCAGAUCU……，
由于某种原因，在CCA后插入了一个碱基U，则突
变后多肽链中氨基酸的数目为
，该多肽
中的第9位16氨基酸由脯氨酸变为组氨酸。已知脯 氨酸的密码子为CCU、CCC、CCA、CCG，组氨酸的
密码子为CAU、CAC。突变后基因中决定第9位组
.
7
（1）mRNA mRNA上决定一个氨基酸的
三个相邻碱基叫做密码子。
核 孔
密码子
密码子
密码子
DNA mRNA
蛋白质
U U A G AU AUC
mRNA .
8
⑵转运RNA（tRNA）：含有反密码子
tRNA
一个转运RNA 只能携带一种特定的氨基酸！
细胞中的转运RNA至少有 61 种. ！
UA U
9
在某些病毒中，RNA也可以自我复制，并且还发现在
一些病毒蛋白质的合成过程中，RNA可以在逆转录酶的作
用下合成DNA。
.
17
中心法则补充
在某些病毒中，RNA也可以自我复制，并且还发现在 一些病毒蛋白质的合成过程中，RNA可以在逆转录酶的作 用下合成DNA。
复 制
DNA
转录 逆转录
复 制
RNA
翻译 蛋白质
整个DNA分子中都是由基因. 构成的吗？
2
基因与DNA和染色体以及脱氧核苷酸间的关系
基因1
非 编 码 区
基因2
编 码
区
染色体
非 编 码 区
.
3
1、染色体、DNA、基因、脱氧核苷酸的关系：
1条染色体
通常 含有
基因克隆PPT课件
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
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21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
《克隆基因的表达》PPT课件
3、控制目的基因的过量表达 • 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程
度 • 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的
拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 • 培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 • 培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
练习题
• 大肠杆菌为什么能高效表达外源基因？ • 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ • 什么是RBS位点，如何影响基因表达？ • 什么是包涵体？其形成机理是什么？ • 融合蛋白、寡聚型异源蛋白 • 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列：位于翻译起始密码子上游的5-13个核 苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’。
5’-AGGAGGU-3’ ？？？？
S-D序列后面的4个碱基： 如是A（U）, 翻译效率 最高；如是G（C）,效率只有50%或25%。
SD 序列与起始密码子之间的距离的影响
SD 与AUG 的距离保证 mRNA 在核糖体上定位，使AUG 正好 处于核糖体复合物的 P 位，这是翻译启动的前提条件。
表达载体的必要元件
1、启动子
TGTACA
TTGACA
TATAAT
sextama box
（1）最佳启动子必须具备的条件
① 必须是一种强启动子
能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的 10%-30%以上。
②应是可诱导型的
用温度或化学试剂诱导。 ③应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。
常用启动子：
➢ DNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型
染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组， 其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间 距离有关。
基因的表达复习课课件
CAT
CAC
GTA 或 GTG
基对是 G 。
C
，原基因中发生突变的碱
4．胸腺嘧啶脱氧核苷（简称胸苷）在细胞内 可以转化为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，后者是合成 DNA的原料，用含有3H—胸苷的营养液，处理 活的小肠黏膜层，半小时后洗去游离的3H—胸苷。 连续48小时检测小肠绒毛的被标记部位，结果如 下图（黑点表示放射性部位）。
基因的表达是一个什么过程？ 基因表达是一个把遗传信息反映到蛋白质分子 结构上的控制蛋白质合成的过程。
（二）基因控制蛋白质的合成
问题：基因主要位于细胞的___细__胞__核_ 中，细 胞中蛋白质合成的场所是__核__糖__体___，在细胞质
中遗。传信息是通过什么传递到细胞质的？
1、RNA分子结构与DNA的比较：
A. 390 B. 195 C. 65 D. 260
2．某真核生物体内有一种蛋白质分子，由一条
多肽链组成，共150个氨基酸，控制这个蛋白质
合成的基因中所含的碱基数为（ ）
A. 300
B. 600
C. 900
D. 多于900
3．已知AUG、GUG为起始密码子，UAA、UGA、 UAG 为终止密码子，某信使RNA能控制51个氨基 酸合成肽链，其碱基排列顺序如下：U AUUCGAUGAC……(40个碱基) ……CCAGAUCU……， 由于某种原因，在CCA后插入了一个碱基U，则 突变后多肽链中氨基酸的数目为 16 ，该 多肽中的第9位氨基酸由脯氨酸变为组氨酸。已 知脯氨酸的密码子为CCU、CCC、CCA、CCG，组 氨酸的密码子为CAU、CAC。突变后基因中决定 第9位组氨酸的密码子的碱基对的组成是：
密码子：信使RNA上决定一个氨基酸的3个 相邻的碱基叫做1个“密码子”（即遗传密码）。
基因克隆优秀课件
选用cDNA克隆这一实验方案，必须考虑到目的基 因的mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。
在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都 是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分 丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些类型 的mRNA的含量则相反，每个细胞只有少数几个拷 贝。
根据mRNA分子含量的多少，可以将mRNA划分为高 丰度、中丰度和胞内转录水平上的基因的群体 ，并不能包括该生物的全部基因，且这些 基因在的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载 体并导入宿主中繁殖。
基因克隆
分子克隆
基本概念:
DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作， 因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因 克隆。
基本概念:
• 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和 方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体 细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分 子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过 程
缺点：必须从3’端开始，不利于较长mRNA 的逆转录；由于cDNA末端存在较长的poly A而影响cDNA测序。
随机引物引导的cDNA合成：
采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段 作为合成第一链cDNA的引物。
cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生。
对于特长的mRNA分子中靠近5’-端的序列， 应用此方法较为容易得到克隆。
基因克隆的含义
“基因”：完整基因/等位基因型/基因片段； DNA基因/RNA基因/未知基因？
找到基因
获得基因一定数量的拷贝 分析基因的结构等特征
确定 克 隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的 群体，每一重组子只含一种mRNA信息。
在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都 是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分 丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些类型 的mRNA的含量则相反，每个细胞只有少数几个拷 贝。
根据mRNA分子含量的多少，可以将mRNA划分为高 丰度、中丰度和胞内转录水平上的基因的群体 ，并不能包括该生物的全部基因，且这些 基因在的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载 体并导入宿主中繁殖。
基因克隆
分子克隆
基本概念:
DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作， 因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因 克隆。
基本概念:
• 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和 方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体 细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分 子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过 程
缺点：必须从3’端开始，不利于较长mRNA 的逆转录；由于cDNA末端存在较长的poly A而影响cDNA测序。
随机引物引导的cDNA合成：
采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段 作为合成第一链cDNA的引物。
cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同 时发生。
对于特长的mRNA分子中靠近5’-端的序列， 应用此方法较为容易得到克隆。
基因克隆的含义
“基因”：完整基因/等位基因型/基因片段； DNA基因/RNA基因/未知基因？
找到基因
获得基因一定数量的拷贝 分析基因的结构等特征
确定 克 隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的 群体，每一重组子只含一种mRNA信息。
《基因克隆与表达》课件
总结基因克隆与表达的重要性，并鼓励进一步学习和研究。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
基因克隆的基本理论及实验技术ppt课件
基因克隆的基本理论及实验技术
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆与表达36页PPT
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
基因克ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ与表达
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
基因克ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ与表达
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
基因克隆与表达讲课文档
现在三十二页，总共三十三页。
结果分析
蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 （ c m ） 相 对 迁 移 率 =
溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 （ c m ）
以每个蛋白标准的分子量对数对 它的相对迁移率作图得标准曲线， 量出未知蛋白的迁移率即可测出其 分于量。
标难曲线只对同 一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。
基本原理
SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚 成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS—肽链复 合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电） ，并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合 PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差 异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白 质或测定定蛋白质分子量的实验技术。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、λDE3溶原
状态下的大肠杆菌染色体上。
现在二十四页，总共三十三页。
T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型
噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
质粒具有自主复制和 转录能力，能在子代细 胞中保持恒定的拷贝数 ，并表达所携带的遗传 信息。
基因组DNA
质粒DNA
现在十三页，总共三十三页。
ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构
破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中 性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大 分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除 去。
结果分析
蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 （ c m ） 相 对 迁 移 率 =
溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 （ c m ）
以每个蛋白标准的分子量对数对 它的相对迁移率作图得标准曲线， 量出未知蛋白的迁移率即可测出其 分于量。
标难曲线只对同 一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。
基本原理
SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚 成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS—肽链复 合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电） ，并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合 PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差 异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白 质或测定定蛋白质分子量的实验技术。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、λDE3溶原
状态下的大肠杆菌染色体上。
现在二十四页，总共三十三页。
T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型
噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
质粒具有自主复制和 转录能力，能在子代细 胞中保持恒定的拷贝数 ，并表达所携带的遗传 信息。
基因组DNA
质粒DNA
现在十三页，总共三十三页。
ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构
破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中 性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大 分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除 去。
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（1） 启动子序列
大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序 （consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
consensus sequences
① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’
② -10box（Pribnow Box）
5’-TATAAT-3’
二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）
5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
三、原核生物基因表达的调控
1. 启动子
是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA 合成的序列。
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓来自mRNA折叠C
UC
UG G—C
脱落
A—U
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
DNA
4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止 密码防止核糖体跳跃（skipping）。
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
一、原核生物基因表达的特点
1. 只有一种RNA多聚酶
识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。
2. 以操纵子为单位
数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个 表达的协同单位。
5’ TTGACA
TATAAT 转录起始位点
17bp
核糖体结合位点
原核启动子共有序列的功能
（2）翻译的起始位点
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。
SD mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
② 多聚A/U
由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较 差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。
5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
第八章-克隆基因的表达
一、基因表达：
遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程--中心法则。
二、克隆基因的表达：
外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
三、制约目的基因表达的因素：
1. 外源基因是否插入在正确的阅读框架 2. 目的基因的有效转录（如启动子的作用） 3. mRNA的有效转录（如S-D序列等作用） 4. 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程
所谓表达体系，是由目的基因、表达载体 与宿主细胞组成的完整体系
四、在原核细胞内正确表达的基本条件：
必须能够正常地转录和翻译 1. 外源基因不能带有间隔序列（内含子）
真核基因必须用cDNA或全化学合 成基因，不能用基因组DNA 2. 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调 节元件控制外源基因的表达
UCCUCCA 16S rRNA3’
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
ii）起始密码： 位于SD序列下游。
AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
2. RNA多聚酶
大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA， rRNA和mRNA。
（1）结构
全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大 亚基（β和β′），一个σ亚基。
3. 外源基因和表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架 阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列
4. 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白 表达载体：适合在受体细胞内表达外源基因的载体
5. 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因表达，防止外源 基因表达产物对宿主菌毒害
3. 转录和翻译偶联、连续进行。
5’
有意义链
3’
3’
反意义链
5’
转录
5’
mRNA
3’
翻译
N
蛋白质
C
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点
Shine-Dalgarno（S-D）sequence:
含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端 碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。
能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋 白的10%-30%以上。
② 应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。
③应是可诱导型的
用温度或化学试剂诱导。
（2） 乳糖启动子lac
来自大肠杆菌的乳 糖操纵子。 用乳糖或其类似物 IPTG充当诱导物， 与阻遏蛋白结合， 解除抑制。
Plac O 目的基因
阻遏物与操纵基因结合
四聚体的 阻遏物
阻遏物与DNA的结合
①乳糖操纵子控制区的结构
“可移动的lac启动子小片断”
组成：
长度：
阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区
203bp的HaeIII片断 （包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。
IPTG =异丙基硫 代-β-D半乳糖
IPTG有毒、昂 贵，不理想。
3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子 启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反 向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终
止子，形成终止信号。
原因：
① 茎环结构
反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结 构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低， 整个减弱了RNA 与DNA的互作
5. 翻译增强子 Translation enhancer
能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
21
6. 基因工程常用的原核启动子
（1）最佳启动子必须具备的条件
① 必须是一种强启动子
大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序 （consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
consensus sequences
① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’
② -10box（Pribnow Box）
5’-TATAAT-3’
二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）
5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
三、原核生物基因表达的调控
1. 启动子
是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA 合成的序列。
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓来自mRNA折叠C
UC
UG G—C
脱落
A—U
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
DNA
4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止 密码防止核糖体跳跃（skipping）。
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
一、原核生物基因表达的特点
1. 只有一种RNA多聚酶
识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。
2. 以操纵子为单位
数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个 表达的协同单位。
5’ TTGACA
TATAAT 转录起始位点
17bp
核糖体结合位点
原核启动子共有序列的功能
（2）翻译的起始位点
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。
SD mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
② 多聚A/U
由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较 差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。
5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
第八章-克隆基因的表达
一、基因表达：
遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程--中心法则。
二、克隆基因的表达：
外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
三、制约目的基因表达的因素：
1. 外源基因是否插入在正确的阅读框架 2. 目的基因的有效转录（如启动子的作用） 3. mRNA的有效转录（如S-D序列等作用） 4. 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程
所谓表达体系，是由目的基因、表达载体 与宿主细胞组成的完整体系
四、在原核细胞内正确表达的基本条件：
必须能够正常地转录和翻译 1. 外源基因不能带有间隔序列（内含子）
真核基因必须用cDNA或全化学合 成基因，不能用基因组DNA 2. 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调 节元件控制外源基因的表达
UCCUCCA 16S rRNA3’
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
ii）起始密码： 位于SD序列下游。
AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
2. RNA多聚酶
大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA， rRNA和mRNA。
（1）结构
全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大 亚基（β和β′），一个σ亚基。
3. 外源基因和表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架 阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列
4. 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白 表达载体：适合在受体细胞内表达外源基因的载体
5. 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因表达，防止外源 基因表达产物对宿主菌毒害
3. 转录和翻译偶联、连续进行。
5’
有意义链
3’
3’
反意义链
5’
转录
5’
mRNA
3’
翻译
N
蛋白质
C
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点
Shine-Dalgarno（S-D）sequence:
含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端 碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。
能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋 白的10%-30%以上。
② 应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。
③应是可诱导型的
用温度或化学试剂诱导。
（2） 乳糖启动子lac
来自大肠杆菌的乳 糖操纵子。 用乳糖或其类似物 IPTG充当诱导物， 与阻遏蛋白结合， 解除抑制。
Plac O 目的基因
阻遏物与操纵基因结合
四聚体的 阻遏物
阻遏物与DNA的结合
①乳糖操纵子控制区的结构
“可移动的lac启动子小片断”
组成：
长度：
阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区
203bp的HaeIII片断 （包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。
IPTG =异丙基硫 代-β-D半乳糖
IPTG有毒、昂 贵，不理想。
3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子 启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反 向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终
止子，形成终止信号。
原因：
① 茎环结构
反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结 构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低， 整个减弱了RNA 与DNA的互作
5. 翻译增强子 Translation enhancer
能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
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6. 基因工程常用的原核启动子
（1）最佳启动子必须具备的条件
① 必须是一种强启动子