第八章-克隆基因的表达上课讲义

5’ TTGACA
TATAAT 转录起始位点
17bp
核糖体结合位点
原核启动子共有序列的功能
（2）翻译的起始位点
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。
SD mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
② 多聚A/U
由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较 差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。
5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
3. 外源基因和表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架 阅读框架:由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列
4. 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的 酶系统合成外源蛋白 表达载体：适合在受体细胞内表达外源基因的载体
5. 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因表达，防止外源 基因表达产物对宿主菌毒害
3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子 启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反 向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终
止子，形成终止信号。
原因：
① 茎环结构
反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结 构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低， 整个减弱了RNA 与DNA的互作
四聚体的 阻遏物
阻遏物与DNA的结合
①乳糖操纵子控制区的结构
“可移动的lac启动子小片断”
组成：
长度：
阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区
203bp的HaeIII片断 （包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。
IPTG =异丙基硫 代-β-D半乳糖
IPTG有毒、昂 贵，不理想。
5. 翻译增强子 Translation enhancer
能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
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6. 基因工程常用的原核启动子
（1）最佳启动子必须具备的条件
① 必须是一种强启动子
二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）
5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
三、原核生物基因表达的调控
1. 启动子
是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA 合成的序列。
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)
RNA折叠↓
mRNA折叠
C
UC
UG G—C
脱落
A—Uቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
DNA
4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止 密码防止核糖体跳跃（skipping）。
所谓表达体系，是由目的基因、表达载体 与宿主细胞组成的完整体系
四、在原核细胞内正确表达的基本条件：
必须能够正常地转录和翻译 1. 外源基因不能带有间隔序列（内含子）
真核基因必须用cDNA或全化学合 成基因，不能用基因组DNA 2. 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调 节元件控制外源基因的表达
（1） 启动子序列
大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序 （consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
consensus sequences
① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’
② -10box（Pribnow Box）
5’-TATAAT-3’
3. 转录和翻译偶联、连续进行。
5’
有意义链
3’
3’
反意义链
5’
转录
5’
mRNA
3’
翻译
N
蛋白质
C
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点
Shine-Dalgarno（S-D）sequence:
含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端 碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。
能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋 白的10%-30%以上。
② 应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。
③应是可诱导型的
用温度或化学试剂诱导。
（2） 乳糖启动子lac
来自大肠杆菌的乳 糖操纵子。 用乳糖或其类似物 IPTG充当诱导物， 与阻遏蛋白结合， 解除抑制。
Plac O 目的基因
阻遏物与操纵基因结合
UCCUCCA 16S rRNA3’
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
ii）起始密码： 位于SD序列下游。
AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
2. RNA多聚酶
大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA， rRNA和mRNA。
（1）结构
全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大 亚基（β和β′），一个σ亚基。
第八章-克隆基因的表达
一、基因表达：
遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程--中心法则。
二、克隆基因的表达：
外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
三、制约目的基因表达的因素：
1. 外源基因是否插入在正确的阅读框架 2. 目的基因的有效转录（如启动子的作用） 3. mRNA的有效转录（如S-D序列等作用） 4. 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
一、原核生物基因表达的特点
1. 只有一种RNA多聚酶
识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。
2. 以操纵子为单位
数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个 表达的协同单位。