第八章 克隆基因的表达系统 2014
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基因工程-第八章1
• 启动子 • 终止子 • 增强子 • 密码子 • 质粒拷贝数
• 结构基因
启动区 核糖体识别区 ATG ORF TAG 终止区
2.1 启动子
• 启动子（Promoter）是DNA上的能与RNA聚合酶结合并 能起始mRNA合成的序列。
• 强启动子起始合成mRNA的效率高，弱启动子合成的效率 低。
• 启动子序列：大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺 序（consensus sequence）： -35 Box 和 -10 Box
• 感染寄生缺陷型 防止重组细菌/病毒扩散污染，生物武器除外
• 具有较高的转化效率 较高的可转化性
• 具有与载体选择标记互补的表型 利于筛选
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
• 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单， 重组子稳定。
• 产结构复杂、种类繁多的内毒素。 • 适用于外源DNA的克隆扩增和扩增、原核生物基因的高效
肽链的合成后加工与修饰
• 一级结构的加工修饰
1）N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合 成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被 切除。其过程是：① 去甲酰化；② 去蛋氨酰基。
2）氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、 羟基化、磷酸化、甲酰化等。
3）二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。 4）肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。
• 结构基因
启动区 核糖体识别区 ATG ORF TAG 终止区
2.1 启动子
• 启动子（Promoter）是DNA上的能与RNA聚合酶结合并 能起始mRNA合成的序列。
• 强启动子起始合成mRNA的效率高，弱启动子合成的效率 低。
• 启动子序列：大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺 序（consensus sequence）： -35 Box 和 -10 Box
• 感染寄生缺陷型 防止重组细菌/病毒扩散污染，生物武器除外
• 具有较高的转化效率 较高的可转化性
• 具有与载体选择标记互补的表型 利于筛选
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
• 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单， 重组子稳定。
• 产结构复杂、种类繁多的内毒素。 • 适用于外源DNA的克隆扩增和扩增、原核生物基因的高效
肽链的合成后加工与修饰
• 一级结构的加工修饰
1）N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合 成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被 切除。其过程是：① 去甲酰化；② 去蛋氨酰基。
2）氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、 羟基化、磷酸化、甲酰化等。
3）二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。 4）肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。
克隆基因的表达
三、基因表达调控的生物学意义 （一）适应环境、维持生长和增殖 （二）维持个体发育与分化
wk.baidu.com
基因表达调控的多级调控 （一）DNA水平
基因丢失；基因扩增 基因重排；甲基化修饰 染色质的结构状态 （二）RNA水平 转录水平调控 RNA的转录后加工 mRNA从核内向胞浆转运 mRNA稳定性 （三）蛋白质水平 翻译过程 翻译后加工 蛋白质的稳定性
一、宿主菌
受体细胞的基因型： 野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）
野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被 省略），表示的方法的规则如下： ①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单 词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。 如：DNA Adenine Methylase, 即dam。 ② 变异基因不同，用作用结果的英文名称的前三 个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。 如：Recombination , recA、recB、recC。 ③ 某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。 ④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变 化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个 字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上 “-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗 性标记为Ampr, 敏感性为Amp-。
Lac乳糖操纵子：启动子Plac + 操纵基因lacO + 结 构基因。
酵母表达载体的构件
产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋
白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌
是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
真核基因在大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含 有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞 中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分 子，并把它们降解掉。
3. 可实现真正的分泌表达
4. 真核生物的基因工程 5. 基因治疗
自从1979年开始，科学家为了克服大肠杆菌表达系统
表达真核基因的缺点，开始利用酵母来作为表达系统。
由于酿酒酵母与人的生活和生产密切相关，没有致病
性，具有和大肠杆菌一样容易的培养方式，又具有真
核生物翻译后的修饰功能，所以成为首选的表达宿主。
过RNA拼接反应而被去除的RNA序列，或基因中与
这种序列对应的DNA序列。
外显子（exon）：也称外元原初转录物通过RNA拼
接反应后，而保留于成熟RNA中的序列，或基因中
《目的基因的表达》PPT课件
克隆基因末端的转录终止区的存在，可避免以下几种不利现象：
①若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大 量非必须的蛋白质；
②在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了 转译的效率；
③偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因启动子所开始的转录干扰 另一个必要的基因或调节基因的转译。
1. 外源基因在原核细胞中表达必须满足的条件：
➢ 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋 白；
➢ 外源基因不能带内含子，必须用cDNA，而不能用基因组DNA； ➢ 利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达； ➢ 外源基因与表达载体连接必须形成正确的开放阅读框架； ➢ 利用宿主菌的调控系统，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
5) 基因末端的转录终止区的影响。 外源末端除要安装好的启动子，还要注意终止区的设置。
第二节 大肠杆菌原核表达体系
一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径
大肠杆菌是基因工程采用最多的蛋白质表达体系。 原因是：培养方法简单、迅速、经济而又易于掌握，再 加上人们运用大肠杆菌表达外源基因有三十多年的经验。
2. 外源基因在原核细胞中高效表达需注意的因素：
（1）启动子结构对表达效率的影响。 （2 ）转译起始序列对表达效率的影响。 （3）启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响。 （4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响。
大肠杆菌基因表达系统ppt课件
能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需 要正确切割掉。
一般位于N端。
（3）常用的原核信号肽 ①大肠杆菌的信号肽： phoA、OmpA、OmpT、OmpF、 LamB、β-内酰胺酶（lactamase） ②金黄色葡萄球菌的蛋白A。
（2）真核信号肽 也能在细菌中起作用。 鼠源RNase、人生长激素信号肽。
无IPTG: 阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外 源基因转录。宿主大量生长。
有IPTG:
阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解 放，外源基因大量转录。宿主生长受 抑制。
（2）表达载体诱导复制
将宿主的生长与载体的复制分开。
当需要宿主大量生长时，抑制载体质 粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的 复制，增加拷贝数。
3. 改变起始密码下面的几组密码子
能提高翻译的起始效率。
4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性 “重复性基因外回文序列”能防止 mRNA受到3’5’外切酶的攻击。
5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表 达的关系。 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。
一般采用温度诱导或药物诱导。
pGEX-3X的插入区：
Xa因子
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGAC
一般位于N端。
（3）常用的原核信号肽 ①大肠杆菌的信号肽： phoA、OmpA、OmpT、OmpF、 LamB、β-内酰胺酶（lactamase） ②金黄色葡萄球菌的蛋白A。
（2）真核信号肽 也能在细菌中起作用。 鼠源RNase、人生长激素信号肽。
无IPTG: 阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外 源基因转录。宿主大量生长。
有IPTG:
阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解 放，外源基因大量转录。宿主生长受 抑制。
（2）表达载体诱导复制
将宿主的生长与载体的复制分开。
当需要宿主大量生长时，抑制载体质 粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的 复制，增加拷贝数。
3. 改变起始密码下面的几组密码子
能提高翻译的起始效率。
4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性 “重复性基因外回文序列”能防止 mRNA受到3’5’外切酶的攻击。
5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表 达的关系。 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。
一般采用温度诱导或药物诱导。
pGEX-3X的插入区：
Xa因子
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGAC
基因表达
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌 至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
技术关键：克隆基因插入原核序列3’端 而维持正确阅读框架。 • 选择合适酶切位点
• 加人工合成的DNA接头
• 构建位相载体
载体部分序列
EcoRI BamHI
----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ------TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
所需元件：
限制性内切酶
连接酶
载体
受体细胞
基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
基因的克隆与表达
基因克隆(gene cloning)
基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基 因 克 隆
Gene Cloning
概述
克隆载体
受体细胞 体外重组的策略
基因克隆工作流程
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质 • 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机理 • 提出了中心法则和操纵子学说，破译了 遗传密码
酵母菌是单细胞真核生物
但是我们为什么要发展真核表达系统呢？
第一节 真核表达系统的发展
使克隆基因在细胞中表达对理论的研究以及实验的应 用都具有十分重要意义的。克隆的基因只有通过表达 才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理， 克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的 研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上、以 至在工业上都是很有应用价值的，可以通过克隆其基
AGGA或 CAAT盒
加帽位点 5'Байду номын сангаас7GpppNp
各个外显子
终止密码子
真核基因的一般结构
真核生物基因表达过程示意图
真核生物基因的结构特点
真核生物结构基因示意图
可见，真核生物基因的转录和翻译具有时间 和空间上的分隔。上述真核生物基因转录后 的剪切、拼接和转移等过程，都需要有调控 序列的调控，这种调控作用是原核生物所没 有的。
1981年首
先将人
的a-干扰 素基因 实现在 酵母中
成功表
达。
Recombinant Human Interferon
第二节 真核基因的表达与调控
真核基因的表达与调控是一个多水平（包括转录 前、转录、转录后、翻译、翻译后）的复杂调控过 程。
（一）真核生物基因的表达调控的特点 1. DNA量大，不存在操纵子结构 2. 真核细胞的编码基因大多是不连续的，由外显子和
第八章 基因工程与体外表达
松弛控制型 (relaxed control)
在整个细胞周期中 随时都可进行复制 在细胞内一般在20 个以上, 甚至多达
数千个
克隆载体的的质粒应具备下列特点
分子量小，以容纳较大的外源DNA，有 较高的拷贝数； 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； 具有多个限制内切酶的单一酶切位点，称 为多克隆位点；便于外源基因插入。
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
重组体
配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
2. 平端连接 适用于： •限制性内切酶切割产生的平端 •粘端补齐或切平形成的平端
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 出现两种末端 粘性末端 平头末端 粘端 平端
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端
粘端
4.同功异源酶： 来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
基因工程的表达系统
基因工程的表达系统
基因工程是一门研究在实验室中人为操纵和修改生物体遗传材料的学科，从而达到改变或改造生物性能的目的。其中，表达系统是基因工程的重要技术之一，也是用来实现基因功能分析和基因转录的重要手段。
表达系统是指将外源基因引入宿主菌株，进而在宿主菌株中实现外源基因表达的技术系统。表达系统包括各种实验技术，如基因克隆、基因表达定位、基因调控、基因表达调控、基因表达产物分离等技术。
基因克隆是在表达系统中要完成的第一步，即将指定的DNA序列导入宿主菌株，这一步可以使用质粒克隆技术或集成克隆技术来实现，这两种技术都简单、快捷、可靠，因此在基因工程的实验中得到了广泛的应用。
定位和调控是表达系统中的第二步，目的是将克隆好的外源基因放置在宿主菌株中能够正常发育和表达的位置，以便获得正确的表达方式，这一步可以使用启动子技术、启动子组装技术、表达调控因子技术等来实现。
表达系统的最后一步是表达产物的分离，也就是将克隆好的外源基因在宿主菌株中表达出来的产物进行分离，这一步可以使用浓缩、沉淀、超滤、离心分离等方法来实现，以获得更高的产物纯度。
总的来说，基因工程的表达系统是一整套实验技术，既可以用于表达和功能分析基因，也可以用于产生新型药物、新型酶、新型农药、新型食品添加剂等多种产品，是基因工程的重要技术手段。
克隆基因的表达
第五章克隆基因的表达
基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功
能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。
思考:基因表达与克隆基因表达的异同? 从表达的对象、过程、场所等方面考虑。
第一节影响外源基因表达的因素
利用基因工程技术高水平表达各种外源蛋白质，无论在理论研究还是实际应用上都是十分重要的。因此，如何使外源基因在宿主细胞中高效表达，成为基因工程中的关键问题。应该指出，现在基因工程所涉及的受体细胞多种多样，从细菌到高等动植物细胞，乃至动、植物个体；而所涉及到的基因也是成千上万，各不相同，这种差别使得对特定基因的表达研究就有其特定的个性。影响外源基因高效表达的各种因素：
1. 外源基因的表达效率
①启动子的强弱。有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。因此，选择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
最理想的可调控启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。
②核糖体结合位点的有效性。SD 序列是指原核细胞mRNA 5`端非翻译区同16S rRNA 3` 端的互补序列。按统计学的原则，一般SD 序列至少含AGGAGG 序列中的4 个碱基。SD 序列的存在对原核细胞mRNA 翻译起始至关重要。
基因工程7克隆基因的表达概述
在克隆基因的末端，存在一个转录终止 区是十分重要的，这是因为：
(1) 若干非必需的转录本的合成，会使细胞消 耗巨大的能量，用于制造大批不必要的蛋白 质；
(2) 在转录本上有可能形成一些不希望其出现 的二级结构，从而降低转译效率；
(3) 有时会出现启动子阻塞现象，克隆基因启 动子所开始的转录，有时会干扰另一个必要 的基因或调节基因的转录。
基因工程7克隆基因的表达 概述
7.1 基因表达的含义
生物的遗传信息是以基因的形式储存在 DNA分子上的，将DNA分子所承载的遗传信 息转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋 白质分子的过程，即为基因的表达(gene expression)。
基因表达的过程为：
利用各种先进的基因导入技术及细胞培 养方法已实现了外源基因在动植物及酵母等真 核宿主细胞中的表达。利用真核细胞作宿主表 达系统的优点是：
3. 常用于表达载体的启动子：
(1) PLac：乳糖启动子，是控制LacZ基因转录 的序列。Lac启动子可被IPTG诱导，加入该 试剂到培养基后，将使表达载体中Lac启动 子下游插入的基因开始转录，表达产物为 包含-半乳糖苷酶的融合蛋白。
(2) Ptrp：色氨酸启动子，通常是编码参与色 氨酸生物合成过程中的几种酶的基因簇上 游序列。trp启动子被色氨酸抑制，但易被 -吲哚丙烯酸诱导，也可用色氨酸饥饿诱导 ，所合成的蛋白质产量高于PLac表达载体系 统。
8基因表达,大肠杆菌基因工程
HS
S
+ 2e + 2H+
+ R-S-S-R
HS HS
2R-SH
2、分泌型异源蛋白的表达
在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分
为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细
胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿
过外膜进入培养基中。
蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。
分离纯化
M M
C
人胰岛素原的cDNA
重组人胰岛素原
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
表达产物的后处理路线：
R
C peptide R R
S S
S S
A peptide
C S S
K
M
N
B peptide
R
CNBr S S
胰蛋白酶
N
羧肽酶B N
S S
C S
S
R
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链同时表达法
tac
Met
b-Gal
转化
分离纯化
N
Apr
Met
B peptide A peptide
M
M
C
CNBr 处理
ori
化学合成AB链编码序列
基因表达系统及技术
6）链霉菌表达系Baidu Nhomakorabea优缺点及研究发展趋势
（1）优点： 链霉菌工业化培养条件成熟,适合于大规模
产业化
链霉菌基本为非致病菌,不产生内毒素 可以进行高密度培养,在稳定期仍能维持异
源蛋白的产生
链霉菌可分泌胞外酶,利用信号肽可分泌外 源蛋白
链霉菌中有许多可利用的转录起始信号,利 用它可以高表达外源基因
Division: budding Do not form filaments Some form filaments Some can mate.
1）酵母菌基因表达系统的宿主特点：
（1） 安全无毒, 不致病。 （2）有较清楚的背景,容易遗传操作。 （3）容易进行载体DNA的导入。 （4）培养条件简单，容易进行高密度发
酵。 （5）有良好的蛋白质分泌能力。 （6）有类似高等真核生物的蛋白质翻译
后的修饰功能。
2）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
酿酒酵母是最早发展的真核基因表达系统。 已表达和生产乙型肝炎疫苗、人胰岛素、干扰素 等。 酿酒酵母的不足之处： （1）发酵时会产生乙醇，乙醇的积累会影响酵
（2）缺点：
由于研究链霉菌表达有生物活性的真核 来源的蛋白还处于初级阶段,许多实验结 果不具有普遍规律,存在的问题有下列方 面
高活性启动子
信号肽切割位点的氨基酸序列
基因的克隆与表达
6, 与翻译有关的原核细胞结构 : —— , 与翻译有关的原核细胞结构: 核糖体结合位点 转译起始密码子AUG 或GUG 转译起始密码子 SD顺序(shine-dalgarno): 顺序( ) 顺序 AUG上游 上游3-11 bp 上游 长约3-9bp 长约 mRNA与16s核糖体亚基间的识别与 与 核糖体亚基间的识别与 结合序列
2,基因剂量: ,基因剂量: 3,核糖体结合位点: ,核糖体结合位点: SD顺序与 顺序与16srRNA3'末端互补程度 . 末端互补程度. 顺序与 末端互补程度 AUG—SD间距离. 间距离. 间距离 AUG后的核苷酸 后的核苷酸
五.原核表达载体: 适用于在原核细胞 原核表达载体: 中表达外源基因的载体. 中表达外源基因的载体. 主要元件:强启动子 主要元件: SD顺序 顺序 筛选标志 其它调控基因
5,人工合成较短的DNA 人工合成较短的DNA 6,差异显示法(differential display, 差异显示法(differential DD)—筛选差异表达的基因 DD) 筛选差异表达的基因
(二)体外重组 连接体系的建立: 连接体系的建立: 温度:粘末端连接:12-18℃ 温度:粘末端连接:12平末端连接:室温(低于30℃) 平末端连接:室温(低于30℃) DNA量:载体分子数/目的基因分子数 DNA量 载体分子数/ =1: =1:1-3 酶量:平端连接时需加大酶量 酶量:
克隆与表达外源蛋白
克隆与表达外源蛋白
外源蛋白的克隆与表达在生物科学研究领域中扮演着重要的角色。通过克隆外源基因，并在表达系统中进行合适的表达，研究人员能够获取大量的目标蛋白，从而开展进一步的实验或应用研究。本文将介绍克隆与表达外源蛋白的方法以及相关技术的发展。
1. 克隆外源基因
克隆外源基因的方法有很多种，常见的包括PCR扩增、限制性内切酶切割和连接、基因合成等。首先，研究人员需要获取外源基因的DNA序列，并设计或选择适当的引物进行PCR扩增。扩增的外源基因片段可以通过电泳等方法进行验证，以确保所得到的片段长度正确。接着，通过限制性内切酶酶切，将扩增的外源基因片段与表达载体进行连接。连接方法可以选择经典的T4 DNA连接酶或现代化的无序连接酶。此外，一些基因合成公司也提供将外源基因片段进行合成的服务。
2. 表达系统的选择
表达外源蛋白需要选择合适的表达系统。常用的表达系统包括真核细胞系统和原核细胞系统。真核细胞系统如哺乳动物细胞、昆虫细胞和酿酒酵母等，适用于表达复杂的外源蛋白，但相对而言工艺较为繁琐。原核细胞系统如大肠杆菌则工艺相对简单，但只适用于表达简单的外源蛋白。根据实际需要选择合适的表达系统，是成功表达外源蛋白的关键。
3. 表达载体设计
表达载体是用于将外源基因引入表达系统的工具，其中包含了启动子、转录终止子、选择标记等元件。启动子决定了外源基因的转录水平，而转录终止子则保证了转录的准确终止。选择标记则用于筛选带
有外源基因的细胞。常用的选择标记有抗生素抗性基因等。此外，还
可以通过融合标签（如6xHis标签、GST标签等）实现对目标蛋白的
8外源基因的表达系统
第八章 外源基因的表达系统
第一节 基因表达的机制 第二节 外源基因表达系统
表达系统
克隆的基因只有通过在宿主细胞中表达才能进一步 研究其功能和调控机理，同样，也只有通过其表达 才能获得具有特定生物活性的目的产物。这种表达 外源基因的宿主细胞就叫表达系统，它可分为原核 (主要是大肠杆菌)表达系统和真核(酵母、昆虫细胞、 哺乳类动物细胞、植物细胞)表达系统两类。要使克 隆基因在宿主细胞中表达，就要将它插入带有基因 表达所需要的各种元件的载体中，这种裁体就称为 表达载体。对不同的表达系统，需要构建不同的表 达载体。
正确表达的基本条件
①外源基因不能带有间隔序列(内含子)； ②必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元 件控制外源基因的表达； ③外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开 放阅读框架； ④通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿 主菌的酶系统合成外源蛋白； ⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
5 目的基因沉默
基因沉默(gene silencing)是导致外源基因不 能正常表达的重要因素。其作用机制主要有三 种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉 默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主 要表现在转基因植物和转基因动物中。
5.1 位置效应
是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。 在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核 中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基 因的表达密切相关。如果外源基因整合到甲基 化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不 能表达;
第一节 基因表达的机制 第二节 外源基因表达系统
表达系统
克隆的基因只有通过在宿主细胞中表达才能进一步 研究其功能和调控机理，同样，也只有通过其表达 才能获得具有特定生物活性的目的产物。这种表达 外源基因的宿主细胞就叫表达系统，它可分为原核 (主要是大肠杆菌)表达系统和真核(酵母、昆虫细胞、 哺乳类动物细胞、植物细胞)表达系统两类。要使克 隆基因在宿主细胞中表达，就要将它插入带有基因 表达所需要的各种元件的载体中，这种裁体就称为 表达载体。对不同的表达系统，需要构建不同的表 达载体。
正确表达的基本条件
①外源基因不能带有间隔序列(内含子)； ②必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元 件控制外源基因的表达； ③外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开 放阅读框架； ④通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿 主菌的酶系统合成外源蛋白； ⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。
5 目的基因沉默
基因沉默(gene silencing)是导致外源基因不 能正常表达的重要因素。其作用机制主要有三 种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉 默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主 要表现在转基因植物和转基因动物中。
5.1 位置效应
是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。 在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核 中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基 因的表达密切相关。如果外源基因整合到甲基 化程度高、转录活性低的异染色质上,一般不 能表达;
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(3) SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的距离是影响mRNA转译成
蛋白的主要因素之一。在很多情况下，SD序列位于
AUG之前大约七个碱基处。在此间隔中少一个碱基 或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降 低
3.终止子结构
在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往有一特定的核 苷酸序列,有终止转录的功能,这一序列称为转录终止子, 简称终止子. 转录终止过程包括: DNA聚合酶停留在DNA模板上不再前进，RNA的延伸停止； 完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来； RNA聚合酶从模板上释放出来。 特点:有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C区 域又具有回文对称结构,转录后形成的RNA具有茎环结构, 并且有与A/T富含区对应的一串U.
终止密码子对翻译的效率有很大影响. UAA,UAG,UGA
4 表达系统对表达产物的影响
表达载体和受体细胞共同组成了外源基因 的表达系统.
二、外源基因在原核细胞中的表达
Operator promoter
Structural gene
terminator
G1
G2
G3
(一)、原核生物基因表达的特点
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
lac
3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌 体蛋白连接在一起的。 优点： 可诱导高效表达 载体内含有lacI阻遏蛋白基因 融合蛋白的分离和纯化方便 使用凝血酶和Xa因子可以从表达的融合蛋白中 切下所需的蛋白质和多肽 用EcoRI从rgt11载体中分离的基因可直接插 入Pgex-1rT中
-1 +1 +30
TTGACA
- 35元件
15~20bp
TATAAT
- 10元件
6bp
CAT
启动子
启动子
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
TTGACA
-10 区序列
GATAC T
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
远距离调节启动子以降低转录效率的一段 DNA序列,是调节基因表达的顺势作用负 调控元件,最早在酿酒酵母中发现
终止子 Terminator
为转录提供终止信号的一段DNA序列,是 基因表达的顺势作用负调控元件.
衰减子
是原核生物基因表达调控的精细调节装置, 是基因表达的负调控元件.
3 翻译过程对表达的影响
Foreign DNA P SD
融合型表达载体
融合基因
启动子：tac 操纵基因：lacO， 调节基因：lacI S-D序列， ori：pBR322 ori， S-D下游融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） lacI--Ptac----lacO---S-D/ATG---GST---基因插 入位点---TGA
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
乳糖启动子lac---来自大肠杆菌的乳糖操纵子 色氨酸启动子trp-来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 PL和PR启动子 -l噬菌体中得到的一类启动子 比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高.
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
(1) SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起 始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与
16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序
列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何 一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低
(五)、提高外源基因表达水平的策略
选择强启动子序列，如tac 等 调整S-D序列与AUG碱的距离，一般为5-9bp 改变起始密码下面的几组密码子 增加mRNA的拷贝数和稳定性 减轻宿主细胞的代谢负荷 提高表达产物的稳定性
减轻宿主细胞的代谢负荷
常用的方法有: 诱导表达:使细菌的生长与外源基因的表 达分开.一般用温度或药物诱导 表达载体的诱导复制:将宿主菌的生长和 表达质粒的复制分开
(2) SD序列与起始密码子之间的序列的影响
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译 效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别 是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个 碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳 的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、 UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍
第八章 克隆基因的表达
目的基因分离后，对研究者来 说最重要的就是了解基因的功能。 只有当一个基因能正常表达时， 我们才能了解基因的内幕。
基因的表达:指遗传信息从DNA到RNA再到 蛋白质的过程
Operator promoter Structural gene terminator
G1
G2
G3
一、影响外源Baidu Nhomakorabea因表达的因素
蛋白质在大肠杆菌中进行分泌必须具备的条件是: 有一段信号肽;在成熟蛋白质内有适当的与分泌 相关的氨基酸序列;细胞内具有相应的转运机制. 信号肽:信号肽序列对于分泌蛋白质是必需的.长 度一般为15-30个氨基酸,特点: (a)在氨基末端有一段带正点荷的氨基酸序列,往往 是精氨酸或赖氨酸残基,数目为1-3个;(b)有一个 疏水的核心区,含亮氨酸或异亮氨酸残基,位置可 以从带正点荷的氨基酸延伸到含切割位点的区 域;(c) 含有能被信号肽酶水解的切割位点,这个 位点常在丙氨酸之后或甘氨酸,丝氨酸之后.
(二)、原核生物基因表达的调控序列
原核生物基因表达的调控序列主要涉及启 动子,S-D序列,终止子,衰减子等序列
1.原核生物启动子结构
启动子 :是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列 ,是基因表达不可缺少的序列.
保守序列
-10区（Pribnow框）也称TATA-box,TATAAT -35区（Sextama框）TTGACA,是RNA聚合酶σ 亚 基的识别与结合位点
P
如pKK223-3 载体
S-D
结构基因
TAG
pKK223-3 载体
强启动子: tac（trp-lac） 操纵基因：乳糖操纵子系统。 调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统， 如JM105 终止子：rrnB核糖体RNA的强终止子 S-D序列和插入位点区 载体的其余部分：来自pBR322质粒 表达诱导物IPTG（乳糖的类似物，不会被降 解） 必须选择一个有lacI的宿主菌
(三)、几种常用的原核表达载体
1.
2.
3.
pkk233-3:非融合型表达蛋白载体； PIN III: 分泌型克隆表达载体； pGEX:融合蛋白表达载体。
1.非融合型表达载体
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的 任何蛋白质融合在一起 优点:产物结构接近于真核细胞体内的蛋白 质结构,其表达产物的生物学功能也就更 接近生物体内天然蛋白 缺点:容易被细菌蛋白酶所破坏.
2.分泌型表达载体- pIN III系列
除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分 泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方式 可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋 白正确折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨酸， 从而达到维护目标蛋白活性的目的。 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号 肽连在一起。
1、阅读框架：指基因的编码区，包含从起始密码 子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。 2、顺式作用元件 顺式作用元件对基因转录起始的调控 启动子 增强子 沉默子 顺式作用元件对转录终止的调控 终止子 衰减子
启动子
是RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段 DNA序列,长度随生物种类不同而异.主要 特征: 序列特异性: 方向性:结构一般是不对称的，正反两个 方向只有一种具有启动功能 位置特异性 种属特异性:
-10 区顺序:GATAAT, -35区顺序:TGACTA
tac启动子 由trp 和 lac启动子人工构建的杂合启动 子
2.Shine-Dalgarno（SD）序列
位于翻译起始密码子（AUG)上游5-13bp处 的由3-9个bp组成的核苷酸序列富含嘌呤 核苷酸， 5’ UAAGGAGG 3’，，它通 过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与 之专一性结合，将mRNA定位于核糖体 上，从而启动翻译；
提高表达产物的稳定性
(1)克隆一段原核序列,表达融合蛋白 融合蛋白:指表达的蛋白质或多肽N端由原核 DNA编码,C末端由克隆的真核DNA的完整序 列编码,这样表达的蛋白是由一条短的原核多 肽和真核蛋白结合在一起,称为融合蛋白. 去除原核蛋白的方法由:化学降解法和酶降解法.
(2)采用某种突变菌株,保护表达蛋白不被降解. 如次黄嘌呤核苷缺陷型菌株做受体菌,使蛋白 酶合成受阻. (3)表达分泌蛋白 大肠杆菌主要由4部分组成:胞质,内膜,外膜及内 外膜之间的周间质. 分泌是指蛋白质从胞质跨过内膜进入周间质这一 过程.
mRNA上一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，叫 Shine-Dalgarno（S-D）序列
原核表达系统的注意事项
通过表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导 宿主菌酶系统合成外源蛋白 外源基因不能带有内含子,必须用cDNA或全 化学合成基因 外源基因与表达载体连接后形成正确的开放 阅读框架(open reading frame)。 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
pIN III系列：pINIII comA1-3
强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子 调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG 分泌信号肽 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa 插入位点区（多克隆位点）。 Ipp---lac-----lacO----S-D/ATG—ompa----插入位点 pIN III-comA1 以pBR322为基础构建的 调节基因不必借助于宿主的lacI.
内在终止子 依赖ρ 因子的终止子
（intrinsic terminator)
(ρ - dependent terminator ）
4.衰减子
指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成 速率的调节区。能够与mRNA作用形成独 特的结构，终止转录。
原核生物的选择标记基因
Amp, Tet, St 等
只有一种 RNA 聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所 有的RNA合成。 以操纵子为单位，数个相关的结构基因与其调控区结合 形成一个表达的协同单位 转录和翻译偶联、连续进行。 不含内含子，缺乏转录后的加工系统 调控主要在转录水平上 mRNA的核糖体结合位点上含有一个转译起始密码子及 同16S核糖体RNA末端互补的序列,即Shine-Dalgarno （S-D）sequence
二、 外源基因在真核细胞中的表达
真核细胞做宿主表达系统的优点 能够识别和除去外源基因中的内含子,剪接加工形 成成熟的mRNA,包括5’端加帽和3’-端加尾 真核细胞将表达的蛋白质糖基化 缺点: 选择标记及选择系统只有少数几个 转化效率低,只有10-6~10-4 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一 定的自发性和盲目性,整合的拷贝数和位置还不能 控制 细胞培养和细胞挑选的要求比较高
增强子
远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列, 由多个元件组成,每个元件可与一种或多种转录调 控因子结合.最早在SV40中发现,作用方式特点: 双向作用 提高转录效率 无位置效应 远距离作用 组织特异性:只能在特定组织中增强与其相连的 启动子的活性 无基因特异性
沉默子
翻译是mRNA指导多态链合成的过程,包括 多态链合成的起始,延伸和终止过程 翻译起始对基因表达的影响
原核生物起始密码子(AUG),SD,SD序列与起始密码之间的 距离保持在9±3个核苷酸;真核生物的5’端帽子结构,起始密 码子周边共有序列,有效的ORF是翻译所必需
密码子偏爱的影响 翻译终止的影响