第四章 克隆基因的表达

tac启动子是药物诱导型 调节基因lacⅠ(位于宿主基因组内或载体上）)始 终产生阻遏物。
• 无IPTG：阻遏物与lac操纵基因结合，抑制 外源 基因转录。宿主大量生长。
• 有IPTG：阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放， 外源基因大量转录。宿主生长受抑制。
（2）表达载体诱导复制
将宿主的生长与载体的复制分开。
2.获得目的片段： （1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为
模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游 引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得 所需基因片段。
（2）通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组 织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成 c环获得产物。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
这是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。
λ△Z载体系列
提供三种融合插入阅读框
λ△ZUV5载体 λ△Z2载体
第四章 克隆基因的表达
第一节 基因表达的过程
• 基因表达（gene expression）是指储存遗 传信息的基因经过一系列步骤表现出其生 物功能的整个过程。
• 典型的基因表达是基因经过转录、翻译， 产生有生物活性的蛋白质的过程。
• 基因表达是受调控的
一、基因表达的基本规律
• （一）时间特异性 • 按功能需要，某一特定基因的表达严格按
3.启动子与外源基因之间的距离 SD距离AUG的距离也影响翻译（7个较好）
4.转录终止区对表达效率的影响 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因， 不必浪费源量和能量，不会干扰正常的表达。
5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。 增加表达效率。 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。
Lac乳糖操纵子：启动子Plac + 操纵基因lacO + 结 构基因。
其转录受CAP正调控和lacI负调控。
lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始 转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，
lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和 lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活 转录。
6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响。
五、提高表达水平常用的方法 1.选择强启动子序列，如tac等 2.调整SD序列与AUG将的距离
3.改变起码密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率。
4.增加mRNA的拷贝数和稳定性
在外源基因的下游插入“重复性基因外回文 序列”能防止mRNA受到3’ 5’外切酶的 攻击。
• 基因分类： 管家基因 表达很少受环境因素影响 可调节基因 受环境因素的诱导或阻遏 可诱导 可阻遏
按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：
（一） 组成性表达
某些基因在一个个体的几乎所有细胞中 持续表达，通常被称为管家基因 （housekeeping gene）
• 无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影 响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全 部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基 因，这类基因表达被视为组成性基因表达 （constitutive gene expression）
（二）构建原核表达载体 适宜的选择标志；
具有能调控转录、生产大量mRNA的启动子; 含适当的翻译调控序列，和翻译起始点和 终止序列等；含合理设计的多接头克隆位 点，以确保目的基因按一定的方向与载体 正确连接（定向克隆 ）。
⑴启动子
要求是：①强启动子②是诱导性的， 如热诱导和化学诱导
启动子
启动子
2.外源基因不能带有内含子。必须用cDNA,不能直 接用真核基因组DNA。
3.必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元 件控制外源基因的表达
4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开 放阅读框架
5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。
四、影响外源基因表达效率的因素
1.启动子的结构对表达效率的影响 （1）一致顺序 ①-35box • RNA聚合酶亚基的识别位点 ②-10box（Pribnow Box）
实际的启动子中很少具备与上述序列完全一 致的区域，启动子的这两个区域与上述保 守序列的相似程度越高，该启动子的表达 能力也就越强。
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
•
• ③、BL21（DE3）菌株
• 该菌株用于以T7RNA聚合酶为表达系统 的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌 体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体 DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21 的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表 达。
二、原核生物基因表达的特征
1.只有一种RNA多聚酶
4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5.调控主要在转录水平上。一是起始控制(启动子控
制)，二是终止控制(衰减子控制)。
6.mRNA的核糖体结合位点 含有一个起始密码子和一段同核糖体16SRNA3’ 末端碱基互补的序列,SD序列
三、原核表达系统的注意事项
1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿 主菌的酶系统合成外源蛋白
（3）细胞内的转运机制。 信号肽酶，信号肽酶等近20种蛋白质的参与。
六、外源蛋白质表达后的正确修饰
1.形成正确的二硫键
• 分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异 构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。
人胰岛素分子
人血红蛋白分子
抗体分子
• 2.前体切割 如信号肽、内含肽等序列的切割。
3.蛋白质糖基化 • 增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。
• ①、JM109菌株
• 可作为大多数质粒载体的受体菌，也可以用于 制备M13等噬菌体载体的单链DNA。该菌株易于 培养，并且可以用较多的转化方法进行有效的转
化。 α－互补,容易鉴别重组体菌株
• ②、DH5α菌株
• 一种常用于质粒克隆的菌株。其j80lacZ△M15 基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨 基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质 粒DNA的提取。
三、基因表达调控的生物学意义 （一）适应环境、维持生长和增殖 （二）维持个体发育与分化
基因表达调控的多级调控 （一）DNA水平
基因丢失；基因扩增 基因重排；甲基化修饰 染色质的结构状态 （二）RNA水平 转录水平调控 RNA的转录后加工 mRNA从核内向胞浆转运 mRNA稳定性 （三）蛋白质水平 翻译过程 翻译后加工 蛋白质的稳定性
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
1.全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 2.基因克隆表达系统成熟完善 3.繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 4.被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
1.缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 2.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 3.内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 4.细胞周质内含有种类繁多的内毒素
PlL PrecA
PtraA
Ptrp Plac
Ptac
-35 区序列 -10 区序列
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
Lac启动子
5.减轻宿主细胞的代谢负荷
合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的 关系。
（1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。
一般采用温度诱导或药物诱导。
λPL启动子是温度诱导型
32℃
cⅠ857阻遏物有活性，抑制λPL启动子，外源基因 不表达，宿主大量生长。
42℃：
cⅠ857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高 水平表达，宿主生长受到限制。
一、宿主菌
受体细胞的基因型： 野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）
野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被 省略），表示的方法的规则如下： ①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单 词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。 如：DNA Adenine Methylase, 即dam。 ② 变异基因不同，用作用结果的英文名称的前三 个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。 如：Recombination , recA、recB、recC。 ③ 某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。 ④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变 化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个 字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上 “-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗 性标记为Ampr, 敏感性为Amp-。