HPLC法测定谷物食品中赭曲霉毒素A检出限、精密度、准确度试验

JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE 检验检疫学刊Vol.30No.22020年第2期
1前言
赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一种引起世界广泛关注的霉菌毒素,主要由多种生长在粮谷类农作物上的曲霉和青霉产生。

赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏,可引起肾脏损伤,大量的毒素可引起动物的肠黏膜炎症和坏死[1]。

其中,毒性最大的是赭
曲霉毒素A,GB 2762—2017《食品中污染物限量》[2]中规定,谷物制品中赭曲霉毒素A 的最大限量为5.0μg/kg。

2仪器尧材料与方法2.1仪器
高效液相色谱仪(HPLC 美国Waters),配荧光检测器。

2.2材料
赭曲霉毒素A 免疫亲和柱:Agela,产品编号:BAC10005;甲醇(CH 3OH):色谱纯(默克);乙腈
(CH 3CN):色谱纯(默克);冰乙酸(C 2H 4O 2):优级纯(天津大茂化学试剂有限公司);赭曲霉毒素A 标准物质[3]:GBW(E)100303,浓度1.9μg/mL;赭曲霉毒素A 标准储备液:用甲醇-乙腈(50+50)溶液将标物
稀释10倍,配制成浓度0.19μg/mL 的标准储备液,4℃冰箱保存;提取液:乙腈+水(60+40);真菌毒素清洗缓冲液:称取25.0g 氯化钠、5.0g 碳酸氢钠溶于水中,加入0.1mL 吐温20,用水稀释至1L;磷酸盐
缓冲液:称取8.0g 氯化钠、1.2g 磷酸氢钠、0.2g 磷酸二氢钾、0.2g 氯化钾溶解于约990mL 水中,用浓盐酸调节pH 至7.0,用水稀释至1L。

2.3方法2.3.1
色谱条件
液相色谱柱C18柱(1.7μm×2.1mm×50mm);检
测器:荧光检测器(大流通池),激发波长333nm,发射波长460nm;流动相:水(含2%冰乙酸):乙腈=54∶46;
第一作者E-mail:****************收稿日期:2020-02-15
HPLC 法测定谷物食品中赭曲霉毒素A 检出限、
精密度、准确度试验
郝艳萍张胜利
冯骁骄
(晋中市综合检验检测中心
山西晋中
030600)
摘要为了解晋中市综合检验检测中心是否具备高效液相色谱(HPLC )法开展谷物食品中赭曲霉毒素A 的测定检验能力,本文对HPLC 法测定谷物食品中赭曲霉毒素A 的检出限、精密度、准确度进行评价。

结果表明,晋中市综合检验检测中心现有仪器设备可满足GB 5009.96—2016《食品中赭曲霉毒素A 的测定》第一法测定谷物食品中赭曲霉毒素A 含量的要求。

关键词高效液相色谱法;谷物食品;赭曲霉毒素A 中图分类号TS207
Determination of Detection Limit,Precision and Accuracy of Ochratoxin A in Cereal Foods by HPLC
HAO Yanping,ZHANG Shengli,FENG Xiaojiao
(Jinzhong General Inspection and Testing Centre,Jinzhong,Shanxi,030600,China )
Abstract :In order to investigate whether Jinzhong General Inspection and Testing Centre has the ability to determine Ochratoxin A in cereals by HPLC,the detection limit,precision and accuracy of Ochratoxin A in cereals by HPLC are evaluated.The results shows that the existing instruments and equipments of Jinzhong Comprehensive Inspection and Testing Center could meet the requirements of the first method for the determination of Ochratoxin A in cereals and food by GB 5009.96—2016Determination of Ochratoxin A in Food.
Key Words :HPLC;Cereals;Ochratoxin A ·54·
2020年第2期Vol.30No.2检验检疫学刊JOURNAL OF INSPECTION AND QUARANTINE
样品号回收率(%)
相对标准偏差(%)
样品号
回收率(%)
相对标准偏差(%)
样品号回收率(%)相对标准偏差(%)
123456
80.588.986.481.283.582.7
2.77
789
10111287.782.783.386.583.781.0
2.49
131415161718
93.590.991.896.492.093.2
1.93
表33组样品回收率与相对标准偏差
流速:0.30mL/min;进样体积:3.0μL;柱温:25℃。

2.3.2供测试溶液的制备
称取样品25.0g(精确至0.1g),加入100mL 提取液(乙腈+水(60+40)),振荡30min,定量滤纸过滤,移取4mL 滤液加入26mL 磷酸盐缓冲液混合均匀,之后于8000r/min 离心5min,上清液作为滤液备用。

将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取全部滤液注入玻璃注射器中,将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s 的流速通过免疫亲和柱,至空气进入亲和柱中,依次用10mL
真菌毒素清洗缓冲液、10mL 水先后淋洗免疫亲和
柱,流速为1~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。

准确加入1.5mL 甲醇洗脱,流速约为1滴/s,收集全部洗脱液氮吹至干,用流动相溶解残渣定容至1mL 供检测用[4]。

3检出限的测定
赭曲霉毒素A 标准储备液用流动相溶液逐级稀释成0.475、0.95、1.9、3.8、9.5、19、38ng/mL 的标准工作液,仪器自动进样,绘制标准曲线,详见表1。

工作系列浓度(ng/mL)0.4750.95 1.9 3.89.51938面积(μV ·s)
21735
44321
94820
187743463039
928333
1858235
标准曲线方程和相关系数
Y =104X ,r =0.9999
表1
标准曲线
将标准品溶液适当稀释后制得一系列不同浓度的标准溶液,进样分析,以信噪比10∶1作为定量限,所进标液浓度为0.475ng/mL,定量限为0.475μg/kg,估约为0.48μg/kg;本实验室赭曲霉毒素A 的定量限为0.48μg/kg。

以信噪比3∶1作为检出限,所进标液浓度为0.158ng/mL,检出限为0.158μg/kg,估约为0.16μg/kg;本实验室赭曲霉毒素A 的检出限为0.16μg/kg(以样品称样量为25.0g,稀释倍数为25,最终定容体积为1.0mL 计),低于标准中的谷物食品测定定量限1μg/kg 和检出限0.3μg/kg。

4
精密度试验
以一阳性燕麦作为样品,称取6份,按2.3.2方
法处理后上机测定,做精密度试验。

结果详见表2。

5准确度试验
取上述样品共称取18份,每份称取质量25.0g,
每6份为一组,每组分别加入不同浓度水平的标准物质溶液适量,样品号1~6瓶为一组,每瓶各加入
0.19μg/mL 赭曲霉毒素A 标准储备液100μL,样品号7~12瓶为一组,每瓶各加入0.19μg/mL 赭曲霉毒素A 标准储备液500μL,样品号13~18瓶为一组,各加入0.19μg/mL 赭曲霉毒素A 标准储备液1.5mL,按2.3.2方法处理后上机测定做加标回收试验,同时计算每组加标后样品测定值的相对标准偏差,进一步进行精密度确认,结果详见表3。

6分析与讨论
本文用HPLC 测定谷物食品中赭曲霉毒素A 含量,在0~40ng/mL 范围内线性关系良好,r =0.9999,赭曲霉毒素A 的检出限为0.16μg/kg,精密度相对标准偏差为1.93%~3.05%,加标回收率为80%~100%。

可见晋中市综合检验检测中心实验室现有的仪器设备能满足GB 5009.6—2016《食品中赭曲霉毒素A 的测定》[5]第一法免疫亲和净化液相色谱法的要求,可以正常开展谷物食品中赭曲霉毒素A 的检测工作。

参考文献
[1]GB/T 27404—2008实验室质量控制规范食品理化检测[S].[2]
桑晓霞,马江媛,黄登宇.赭曲霉毒素A 检测方法的研究进展[J].
食品安全质量检测学报,2019,10(21):7271-7277.[3]余晓琴.相关食品安全标准中赭曲霉毒素解读[N].中国市场监管报,2019-10-17(008).
[4]
王颖,张妮娜,雒丽娜,等.赭曲霉毒素A 检测方法的研究进展[J].
中国卫生检验杂志,2014,24(5):757-760.
[5]GB 5009.96—2016食品中赭曲霉毒素A 的测定[S].
表2精密度试验结果
样品号样品中赭曲霉毒素A
含量(μg/kg)
样品号样品中赭曲霉毒素A
含量(μg/kg)
123
0.7120.7640.755
456
0.7380.7450.786
·55·。