2014体外分析(1)(1)
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标记免疫分析技术
重医大儿童医院核医学科 王栋钢
精品课件
标记免疫分析技术
放射性核素标记免疫分析 非放射性核素标记免疫分析
精品课件
放射性标记免疫分析的分类
竞争性 非竞争性
精品课件
放射性标记免疫分析
RIA （放射免疫分析） CPBA（竞争性蛋白结合分析） RRA （放射受体分析）
性 REA （放射酶分析） RMA （放射微生物分析）
精品课件
滴度曲线
精品课件
抗血清
（３）放射性核素标记抗原*Ag
对*Ag的要求：
1)比活度(specific activity)高而恰当。
度。
单位量物质中含有的放射性活
2)放化纯度(radiochemical purity)高： 特定化学结构的放射性药物
的放射性活度占总放射性活度的百分比。
精品课件
（２）Ab---抗体；
（３）*Ag---放射性核素标记抗
原。
精品课件
（１）标准抗原Ag
要求：
１要高度纯化； ２性质与待测抗原相同；
3定量要准确。
精品课件
（２） 抗体 Ab
优质抗体应具备高亲合力，高特异性， 高滴度三条件。
➢ １） 高亲合力：其大小用亲合常数K表 示。亲合力测定最常用Scatchard作图。
精品课件
➢ ２）高特异性：特异性用交叉反应表示。
交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A）× 100%
B 类似物
A 对应物
精品课件
３）高滴度：滴度测定用滴度曲线。
测定方法：将抗血清稀释成不同浓度，分别加入恒 量标记抗原，经温育后分离B、F，求出不同稀释度的 B%，以稀释度为横座标，B%为纵座标，绘制出抗血清 滴度曲线（antiserum titer curve），一般以B%为 30%～50%的抗体稀释度为最适稀释度。
精品课件
§－１
RIA
RIA的原理； RIA标准曲线； RIA基本试剂； RIA的分离方法； RIA的质量控制； RIA的临床应用．
精品课件
一原理
1）竞争性抑制。即*Ag与Ag同时与限量的 特异性抗体发生竞争性的免疫结合反应。
2）公式表示如下：
AgAb +
Ag + Ab Ag
+
*Ag *AgAb + *Ag
肝脏良性病变的辅助诊断。 某些妇产科疾病及胎儿疾病的
诊断。
3)半衰期恰当。 4)保持原有抗原的特 性。 5)选择恰当的放射性核素作标记。
常用 3H、14C 、125I，首选125I 。
精品Biblioteka Baidu件
四 RIA的分离方法
１）对分离的总要求：
◆ NSB低； ◆ B与F分离完全，快速，特异； ◆ 分离剂价廉，易得，操作简便。
２）常用分离方法分类：
双抗法 液相法 沉淀法
５）稳定性：
◆NSB%;
◆B0%;
◆ED75; ED50； ED２5。
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6）质控图
根据药盒给出的或连续测定10 批以上高、中、低三种已知浓度的质控 血清所求出的各自的均数±标准差
（x±s），画出均数线与两个标准差的
范围，将以后每次实验测定的高、中、 低值标在图上，即为质控图（quality control profile）
95%位数
范围
144263
21644
8652
3640
精品课件
AFP诊断肝细胞肝癌的标准
１ AFP>500μg/L持续四周； ２ AFP>２00µg/L持续八周； ３ AFP由低浓度逐步升高不降。
注意： 前提是在排除妊娠和生殖胚胎瘤基础上， 才作出诊断。
精品课件
4）AFP的临床应用
原发性肝细胞性肝癌的诊断、 疗效判断及预后估计。
竞争
IRMA(免疫放射分析)
争性
精品课件
非竞
放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) 的发展史
Yalow和Berson因创立RIA而获 得诺贝尔医学奖。
进展。
精品课件
RIA的概念
定义：是一种由放射性核素标记的定 量 免疫分析技术．它采用竞争性免疫 结合反应，其灵敏度高、特异性强， 适合作微量分析。
精品课件
精品课件
质控图上显示整批实验要 舍去的情况（质控规则）
WHO规定，有下列情况之一要舍弃： 1 三种中有一个>3SD; 2 三种中有两个在同一方向上>2SD; 3 三种全在同一方向上>1SD;
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六 RIA的临床应用
(HCG)。
（１）甲胎蛋白(AFP); （２）血清铁蛋白(SF); （３）人绒毛膜促性腺激素
吸附法 固相法
精品课件
五 RIA的质量控制 (quality control ,QC)
质控目的
对实验的误差进行检查和质量判断， 寻找原因并采取纠正措施，使误差控制在可接 受的范围。
杜绝过失误差，校正系统误差，控制 随机误差。
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(1)实验室内部质量控制（internal quality control, IQC)
一般： NSB－nonspecific binding ,
B－binding ，F－free，T－ total B%=B/(B+F)，F%=F/(B+F)， R=B/F， T= B + F ． 见图二．
精品课件
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三 RIA基本试剂
RIA的三种主要试剂(Ag ，Ab ，*Ag) （１）Ag---标准抗原；
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3)反应条件： ◆ *Ag和Ab限量； ◆ *Ag和Ag的总量大于Ab上的有效 结合位点； ◆ *Ag和Ag具有相同的免疫活性。
4）分析如何理解竞争： ◆ 当待测Ag↑，生成的*AgAb↓; ◆ 反之，亦然。即待测Ag与*AgAb
呈函数关系（负相关）见图一
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二 RIA标准曲线
精品课件
（１）甲胎蛋白(α -fetal protein, AFP)
１） AFP的生理：
2）AFP的分布：
▲ 胎儿：
▲ 妊母：
3） AFP与亚临床肝癌：
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附 婴儿AFP正常参考值
婴儿年龄
<11d 940~200000
11~20d 260~36000
21~30d 170~10000
1~2m 24~4800
批内质控：整批分析质量评价； 批间质控：批间质量评价。
(2)实验室外部质量控制（External quality control, EQC)
对不同实验室同一项目的结果进行比较 (WHO或卫生部层面）
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１）精密度：CV表示。
２）灵敏度：
３）准确度：回收率表示。
４）特异性：交叉反应表示。
重医大儿童医院核医学科 王栋钢
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标记免疫分析技术
放射性核素标记免疫分析 非放射性核素标记免疫分析
精品课件
放射性标记免疫分析的分类
竞争性 非竞争性
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放射性标记免疫分析
RIA （放射免疫分析） CPBA（竞争性蛋白结合分析） RRA （放射受体分析）
性 REA （放射酶分析） RMA （放射微生物分析）
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滴度曲线
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抗血清
（３）放射性核素标记抗原*Ag
对*Ag的要求：
1)比活度(specific activity)高而恰当。
度。
单位量物质中含有的放射性活
2)放化纯度(radiochemical purity)高： 特定化学结构的放射性药物
的放射性活度占总放射性活度的百分比。
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（２）Ab---抗体；
（３）*Ag---放射性核素标记抗
原。
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（１）标准抗原Ag
要求：
１要高度纯化； ２性质与待测抗原相同；
3定量要准确。
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（２） 抗体 Ab
优质抗体应具备高亲合力，高特异性， 高滴度三条件。
➢ １） 高亲合力：其大小用亲合常数K表 示。亲合力测定最常用Scatchard作图。
精品课件
➢ ２）高特异性：特异性用交叉反应表示。
交叉反应率 = ED50（B）/ ED50（A）× 100%
B 类似物
A 对应物
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３）高滴度：滴度测定用滴度曲线。
测定方法：将抗血清稀释成不同浓度，分别加入恒 量标记抗原，经温育后分离B、F，求出不同稀释度的 B%，以稀释度为横座标，B%为纵座标，绘制出抗血清 滴度曲线（antiserum titer curve），一般以B%为 30%～50%的抗体稀释度为最适稀释度。
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§－１
RIA
RIA的原理； RIA标准曲线； RIA基本试剂； RIA的分离方法； RIA的质量控制； RIA的临床应用．
精品课件
一原理
1）竞争性抑制。即*Ag与Ag同时与限量的 特异性抗体发生竞争性的免疫结合反应。
2）公式表示如下：
AgAb +
Ag + Ab Ag
+
*Ag *AgAb + *Ag
肝脏良性病变的辅助诊断。 某些妇产科疾病及胎儿疾病的
诊断。
3)半衰期恰当。 4)保持原有抗原的特 性。 5)选择恰当的放射性核素作标记。
常用 3H、14C 、125I，首选125I 。
精品Biblioteka Baidu件
四 RIA的分离方法
１）对分离的总要求：
◆ NSB低； ◆ B与F分离完全，快速，特异； ◆ 分离剂价廉，易得，操作简便。
２）常用分离方法分类：
双抗法 液相法 沉淀法
５）稳定性：
◆NSB%;
◆B0%;
◆ED75; ED50； ED２5。
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6）质控图
根据药盒给出的或连续测定10 批以上高、中、低三种已知浓度的质控 血清所求出的各自的均数±标准差
（x±s），画出均数线与两个标准差的
范围，将以后每次实验测定的高、中、 低值标在图上，即为质控图（quality control profile）
95%位数
范围
144263
21644
8652
3640
精品课件
AFP诊断肝细胞肝癌的标准
１ AFP>500μg/L持续四周； ２ AFP>２00µg/L持续八周； ３ AFP由低浓度逐步升高不降。
注意： 前提是在排除妊娠和生殖胚胎瘤基础上， 才作出诊断。
精品课件
4）AFP的临床应用
原发性肝细胞性肝癌的诊断、 疗效判断及预后估计。
竞争
IRMA(免疫放射分析)
争性
精品课件
非竞
放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) 的发展史
Yalow和Berson因创立RIA而获 得诺贝尔医学奖。
进展。
精品课件
RIA的概念
定义：是一种由放射性核素标记的定 量 免疫分析技术．它采用竞争性免疫 结合反应，其灵敏度高、特异性强， 适合作微量分析。
精品课件
精品课件
质控图上显示整批实验要 舍去的情况（质控规则）
WHO规定，有下列情况之一要舍弃： 1 三种中有一个>3SD; 2 三种中有两个在同一方向上>2SD; 3 三种全在同一方向上>1SD;
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六 RIA的临床应用
(HCG)。
（１）甲胎蛋白(AFP); （２）血清铁蛋白(SF); （３）人绒毛膜促性腺激素
吸附法 固相法
精品课件
五 RIA的质量控制 (quality control ,QC)
质控目的
对实验的误差进行检查和质量判断， 寻找原因并采取纠正措施，使误差控制在可接 受的范围。
杜绝过失误差，校正系统误差，控制 随机误差。
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(1)实验室内部质量控制（internal quality control, IQC)
一般： NSB－nonspecific binding ,
B－binding ，F－free，T－ total B%=B/(B+F)，F%=F/(B+F)， R=B/F， T= B + F ． 见图二．
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三 RIA基本试剂
RIA的三种主要试剂(Ag ，Ab ，*Ag) （１）Ag---标准抗原；
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3)反应条件： ◆ *Ag和Ab限量； ◆ *Ag和Ag的总量大于Ab上的有效 结合位点； ◆ *Ag和Ag具有相同的免疫活性。
4）分析如何理解竞争： ◆ 当待测Ag↑，生成的*AgAb↓; ◆ 反之，亦然。即待测Ag与*AgAb
呈函数关系（负相关）见图一
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二 RIA标准曲线
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（１）甲胎蛋白(α -fetal protein, AFP)
１） AFP的生理：
2）AFP的分布：
▲ 胎儿：
▲ 妊母：
3） AFP与亚临床肝癌：
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附 婴儿AFP正常参考值
婴儿年龄
<11d 940~200000
11~20d 260~36000
21~30d 170~10000
1~2m 24~4800
批内质控：整批分析质量评价； 批间质控：批间质量评价。
(2)实验室外部质量控制（External quality control, EQC)
对不同实验室同一项目的结果进行比较 (WHO或卫生部层面）
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１）精密度：CV表示。
２）灵敏度：
３）准确度：回收率表示。
４）特异性：交叉反应表示。