增强型绿色荧光蛋白基因(e-gfp)在莱茵衣藻中表达的研究
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质，可以发射绿色荧光。
由于GFP具有结构简单，对细胞无毒性和较强稳定性等特点，因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。
以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。
一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质，能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。
GFP最初是在1955年，美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。
GFP由238个氨基酸组成，分子量约27kDa。
GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达，使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。
二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr（酪氨酸）、Ser（丝氨酸）和Gly（甘氨酸）构成的环状结构决定。
当氧气与Tyr形成共轭键时，便使荧光激发能量被吸收，并在GFP分子腔内缓慢扩散，直至荧光发射。
三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。
由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性，可以将其组装到生物体内，使其具有明亮的绿色荧光。
通过转化所需的基因序列来表达GFP，可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。
2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。
在这种情况下，GFP被连接到研究的蛋白质上，而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况，从而确定蛋白质之间是否相互作用。
3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。
通过表达GFP基因，可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。
4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。
通过转染GFP基因，可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置，比如细胞分裂、游走和迁移等。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）.. 95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
增强型绿色荧光蛋白基因的克隆和表达
增强型绿色荧光蛋白基因的克隆和表达陈曦2013141411122实验设计分析：若实验所需的目的基因EGFP及载体质粒皆只提供相关菌液，则直接提取质粒，纯化后进行双酶切及连接重组，利用热激法转化DH5α，涂抗性板后观察现象进行菌落PCR鉴定即可。
若载体质粒已准备好，仅目的基因质粒于菌内，则可直接利用菌落PCR技术提取目的基因，再与载体质粒进行slic连接后热激转化，涂抗性板后观察现象进行菌落PCR鉴定即可。
由于考虑成本问题及质粒特点，本实验主要利用双酶切法。
实验计划：1.质粒DNA的提取及检测2.DNA的限制性内切酶酶切及连接重组3.重组DNA的转化及重组子的鉴定4.利用菌落PCR技术进行阳性克隆的鉴定实验详细步骤：一、质粒DNA的提取及检测实验设计分析：由于pET- 28a质粒、pEGFP-N3质粒皆有Bam HⅠ与Not I酶切位点，且分别距EGFP基因上下游较近，而于pET- 28a中，两酶切位点距离很近，仅相隔30kb左右，且二者接含有卡纳抗性。
因而先利用碱裂解法小提质粒并纯化两质粒，为下一步双酶切做准备。
质粒示意图实验原理：分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌、分离和纯化质粒DNA。
实验步骤：①溶液及培养基配制。
溶液Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH至8.0。
高压蒸汽灭菌后，4℃保存。
作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解。
溶液Ⅱ：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%，现配现用（可均配2×溶液贮存，用前等体积混合）。
作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性。
溶液Ⅲ：按体积比5 mol/L乙酸钾：冰乙酸：ddH2O为6：1.15：2.85配制而成。
保存于4℃，用时置于冰浴中。
作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用绿色荧光蛋白的研究进展及应用姜丽摘要：源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)，是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。
绿色荧光蛋白的发现具有划时代的重要意义，它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段，并且在此基础上改造发展和发现了一些列荧光蛋白，扩展了应用范围。
现就 GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。
关键词：荧光蛋白(GFP) ；荧光特性；进展；应用一、什么是绿色荧光蛋白(GFP)?发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962年Shimomura等首先从多管水母 (Aequoriavictoria) 中分离出一种分子量为20kD的称为 Aequorin的蛋白。
由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。
随后，人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP，其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae)和海紫罗兰科 (Renillidae)的GFP，即AequoriaGFP和RenillaGFP。
二、GFP的理化性质、荧光性质及其进展2.1GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2．6kD，由3个外显子组成，分别编码 69、98和 71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
AequoriaGFP分子量约 27×l03，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽；而 RenillaGFP是分子量为54kD的同型二聚体。
两种 GFP有不同的激发光谱，AequoriaGFP在395nm具有最高光吸收峰，肩峰为473rim；RenillaGFP在498Bin具有强烈的光吸收，肩峰为470nin。
增强型绿色荧光蛋白基因(e-gfp)在莱茵衣藻中表达的研究
上清转移到另一离心管中。
（8）加入两倍体积无水乙醇沉淀 DNA，－20℃冰箱沉淀 1h 以上； （9）4℃、15000r/min、离心 5min 弃上清，用冰预冷的 70％乙醇 1ml 洗涤 DNA 沉淀，弃
其他：氯化钙、氨苄青霉素、饱和酚、氯仿、氧化铝等为国产，有关化学试剂，均为
分析纯或分子生物学级（Molecular biology grade）。
1.4 主要仪器设备
仪器
型号
制造商
离 大型离心机 2K15G Refrigerated Centifuge
心 小型离心机
1-13 Laboratory Centrifuge
上清，倒置于滤纸上，使乙醇完全挥发，直至试管内没有看见的液体存在。
（10）溶于 20ul 无菌水或含有去 DNA 酶的 RNA 酶的 TE 溶液。 （11）通过电泳鉴定该质粒是否为目的质粒以及判断质粒的纯度。 3.2 限制性内切酶酶切反应 （遵照所购试剂说明书）
(1) 据实验需要取一定量的 DNA，加入适量的限制性内切酶及相应的反应缓冲液、无菌去 离子水，使反应体系中的甘油浓度<5%.
增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）
在莱茵衣藻中表达的研究
（生命科学学院，生物工程系生物技术专业 吴锦霞） （学号：2000302055）
内容提要：通过构建增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）衣藻表达载体，利用“珠磨法” 将 e-gfp 导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻（CC-849）中，经 Zeocin 抗性筛选出转 e-gfp 基因衣藻； 在光照下培养转基因藻，经 PCR 和 RT-PCR 对转基因藻进行分子检测，结果表明 e-gfp 已经 稳定整合到莱茵衣藻基因组中，并具有转录活性；随后的转基因藻相对荧光强度分析表明转 e-gfp 衣藻的相对荧光强度明显高于野生型衣藻。
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
9、药物研发：在药物研发领域，GFP可以用于标记和追踪目标药物分子。通过 观察GFP的荧光信号，可以研究药物分子的体内分布、药代动力学和毒性等指 标。同时，利用GFP还可以筛选和优化药物作用靶点及候选药物的有效性和安 全性。
谢谢观看
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
01 引言
03 GFP的发现
目录
02 研究进展 04 GFP的分类和功能
目录
05 研究现状与不足
07 应用领域
06 未来研究方向
引言
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种重要的生物 标志物，它在生物学研究中被广泛用于标记和追踪目标细胞、蛋白质及其相互 作用。GFP的发现和应用为生物科学研究开辟了新的途径，本次演示将介绍 GFP的研究进展及其在各个领域的应用。
7、发育生物学：在发育生物学领域，GFP可以用于标记和追踪胚胎期和成体期 不同组织的细胞生长、分化和迁移。通过观察GFP的荧光信号，可以研究器官 形成、组织修复和再生等过程。
8、微生物学：在微生物学领域，GFP可以用于标记和追踪细菌、真菌和寄生虫 等微生物。通过观察GFP的荧光信号，可以研究微生物的感染、传播和抗感染 免疫等过程。
GFP的分类和功能
根据来源和结构差异，GFP可以分为多种类型，包括海洋水母型GFP、珊瑚型 GFP、发光细菌型GFP等。这些不同类型的GFP具有不同的光谱特性和应用范围。 其中，海洋水母型GFP具有较高的荧光亮度和良好的溶解性，是生物科学研究 中最常用的类型。
GFP的功能主要包括两个方面：作为报告基因和作为标签蛋白。作为报告基因， GFP可以用于监测基因的表达和蛋白质的定位。作为标签蛋白，GFP可以用于 研究蛋白质的结构和功能，以及细胞生物学中细胞标记、追踪和分选等方面。
绿色荧光蛋白_GFP_研究进展
酶活性及产量成为可能。
迄今为止,国外对纳豆激酶基因的研究仅限于Nadamura 等人利用鸟枪法得到了NK 基因,并将NK 基因重组到pUC19质粒上,转化到E.coli H B101受体菌中,该基因工程菌发酵产物具有胞外蛋白酶活性,但没有检测其溶栓活性。
至于对纳豆激酶基因表达及表达产物的研究还未见报道。
但与纳豆激酶同源性很高的枯草杆菌蛋白酶E 和枯草杆菌蛋白酶amylosacchariticus 都已有基因克隆的报道。
Y oshim otoT 等人利用穿梭质粒载体pHY 300P LK 克隆amylosac 2chariticus 基因,转化到四种不同的枯草杆菌中(ISW1214,M1111,I A510,I A274),发现转化菌株(ISW1214/PTH1)的蛋白水解酶的产率比宿主菌和基因供给菌分别提高20倍和4倍(Y oshim oto T ,1988年)[5]。
Mark L 等人将枯草杆菌蛋白酶E 基因克隆到穿梭载体pBS42上,转化枯草杆菌,表达的丝氨酸蛋白酶活性是野生型的5倍(Mark L ,1984年)[6]。
W ong 等人通过质粒整合和噬菌体pBS1转导绘制了枯草杆菌蛋白酶E 基因图谱。
研究表明,克隆化的枯草杆菌蛋白酶基因只在静止生长期表达,并且受δ37启动子的控制(Maria Y,1984年)[7]。
H T akagi 等人[8]将枯草杆菌蛋白酶E 基因克隆到嗜热表达载体上,实现了在嗜热杆菌中的表达。
近年来,我国掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮,纳豆激酶的药用价值日益突出,我国学者渴望利用基因工程菌生产纳豆激酶,致使对纳豆激酶基因的克隆、表达、纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了很大进展。
已经从不同菌株(枯草杆菌,纳豆杆菌,解淀粉芽孢杆菌)中克隆了纳豆激酶成熟肽基因,包括前导肽和成熟肽的纳豆激酶原基因,以及包括启动子、前导肽、信号肽和成熟肽的纳豆激酶全基因。
分别重组到温控型和诱导型质粒载体上,实现了在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中的表达。
绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用教材
荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞 亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可 以发出荧光：刺胞亚门的动物多发射绿色荧光，而栉水母 类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，它的发现和应用被称为细胞生物学 上的一次革命。这种蛋白质结构很特殊，在受到蓝光或紫 外线刺激时可以发射绿色荧光，并不需要任何协同因子、 底物，适合用作普遍的报告标记，尤其适合于活体细胞或 组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应 不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一 性, 检测简单， 结果真实可靠，是一种独特的报告蛋白 (Reporter protein) 。可广泛用于基因的表达与调控、 蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。
7 用于细胞示踪实验研究
利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵 袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以 往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗 原性有较高要求。利用β半乳糖昔酶(Lac Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操 作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行 示踪。 李侠【21】等将携有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pEGFP-N3质粒体 外转染C6胶质瘤细胞，筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆，以立体定向 法植入SD大鼠脑实质内建立大鼠移植瘤模型。4周后处死大鼠并作鼠脑连续 石蜡切片,相邻的切片分别做苏木素-伊红(HE)或免疫组化染色后荧光显微镜 下检测。在荧光显微镜很容易区分肿瘤区和非肿瘤区，并能发现侵袭至远处 的单个肿瘤细胞，其敏感性和特异性明显优于HE染色和免疫组化方法。朱君 明[22]等将GFP和HTH1双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH1-SN转 染NIH-3 T3细胞，且移植人Parkinon病模型大鼠纹状体内后，也清晰地观 察到了NIH-3 T3细胞在脑内的生长情况。Xin[23]等将EGFP转人EG4细胞 (一种原胚细胞)中，建立了几株既可以表达绿色荧光蛋白又依然保持了多能 干细胞特征的EG4-GFP细胞系，通过对聚集的EG4-GFP细胞到8细胞胚胎的 研究,可以追踪到EG4-GFP细胞在体外分化情况以及在胚胎发育中的命运。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达
分子生物学综合实验论文题目:绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam HI和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。
取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌 E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。
重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1μL/mL的卡纳霉素的LB培养基上培养。
当A600达到0.7时，用终浓度为0.8mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。
关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight,College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam HI and Not I,the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言：01.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP）01.1.1 GFP研究背景01.1.2 GFP研究应用11.2基因的克隆与表达22.实验试剂及实验仪器：42.1实验试剂与材料：52.2实验仪器：63.实验方法63.1质粒提取方法:63.2琼脂糖凝胶电泳及回收:83.3酶切及连接：93.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入：113.5酶切验证重组质粒：123.6GFP基因的表达133.6.1活化菌种133.6.2扩大培养133.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达134.结果与分析134.1质粒提取过程中现象与结果：134.2琼脂糖凝胶电泳144.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果：154.4酶切验证重组质粒154.5GFP基因的表达结果：165.讨论：165.1提取质粒出现图六的原因是：165.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因：175.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因:17 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因：195.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因：196.参考文献20前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）1.1.1 GFP 研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
（细胞生物学专业优秀论文）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因真核表达载体的构建与表达
二实验方法“。
”４”１技术路线１．１质粒构建藉弼丈学矮士学柱论定椽穗杰结果１质粒ｐＣＤＮＡ３．１“）和ｐＥＧＦＰ一１的双酶切鉴定ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒经过ＢａｍＩｔＩ、ＮｏｔＩ双酶切后，电泳结聚（见阉ｌ一８）显示有一条５。
４Ｋｂ麓絷带，穰据ｐＣＤＮＡ３。
ｉ（＋）瘊粒酶窃图谱分析，该质救含有ＢａｍＨｌ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过双酶切后得到线性化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）和另外一个很短的片段，电泳时这令缀籁静冀蔽燕出了璩瓣糖凝黢，最蘑凝胶上褥剿的条带聿誊合线往化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）的长度，故可以验证所获质粒确为ｐＣＤＮＡ３．１（十）质粒。
ｐＥＧＦＰ－１蒺载经过８ａ硎ｉ、Ｎｏｔ｛瑟酶切鑫，电濠结莱（冕圈ｌ—Ｃ）鼹示有瓶条分别为３．５Ｋｂ卸０。
７Ｋｂ的祭带，根据ｐＥＧＦＰ—ｌ质粮酶切图谱分析，该质粒同样含商ＢａｍＨＩ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过载酶切籁得嚣露静蘩茜ＥＧＦＰ片段帮勇终一个鞍长豹的片段，电泳时凝胶上的条带符合鼹个片段的长度，数可以验证雕获质粒确为ｐＥＧＦＰ一１质粮。
豳ｌｐＣＤＮＡ３．１（＋）羊¨ｐＥＧＦＰ—ｌ质粒的酶切分毫斥Ａ：ＤＮＡ分子量标记：Ｂ：ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ舣酶切Ｃ：ｐＥＧＦＰ－ｔ矮粒ＢａｍＨ｛、Ｎｏｔ｛鼹酶鞠鞫ｊｌ｜大学疆士学盈论文撩谗杰２垂缣质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＥＧＦＰ的酶稍釜定重组厦粒ｐＣＤＮＡ３。
ｌ（＋）一ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨＩ单酶切基，电溶结果（见图２一Ｂ）显示有一条单一的６．１Ｋｂ条带，根据ｐＣＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ强谱分析，该质粒含有单一的ＢａｍＨＩ酶切位点，全长为６．１Ｋｂ左右。
耋组质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）～ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨｌ、ＮｏＬＩ双酶切蜃，电泳结果（见网２一Ｃ）显示有两条分别为５．４Ｋｂ和０．７Ｋｂ的条带，符台线赣ｐＣＤＮＡ３。
ｌ（十）载体和ＥＧＦＰ片段的长发，故可以验证所较质粒确为耋缀质粒ｐＣＤＮＡ３，ｌ《＋）－ＥＧＦＰ。
《2024年用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究》范文
《用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，转基因技术已成为现代生物学研究的重要手段之一。
通过基因工程改造生物体的基因，可以达到改变生物体的生长特性、改良其经济性状和利用特定遗传信息等目的。
本研究将绿色荧光蛋白基因和肝再生增强因子基因相结合，开展对转基因绵羊胚胎的研究，为农业生产以及医药等提供理论基础和研究方向。
二、研究目的与意义本研究旨在通过将绿色荧光蛋白基因（GFP）和肝再生增强因子基因（LRE）进行转基因操作，研究其对绵羊胚胎的生长发育、遗传特性及生理功能的影响。
这一研究不仅有助于我们更深入地理解基因在生物体中的作用机制，同时也为农业生产中的品种改良、疾病防治以及医药研究等领域提供新的思路和方法。
三、研究方法1. 基因选择与构建：选择合适的绿色荧光蛋白基因和肝再生增强因子基因，通过基因工程技术构建转基因载体。
2. 转基因操作：将构建好的转基因载体通过显微注射等方式，注入绵羊的受精卵中。
3. 胚胎培养：将注射了转基因载体的受精卵在特定条件下进行培养，使其发育成早期胚胎。
4. 胚胎移植：将发育到适当阶段的胚胎移植到代孕母羊体内，观察其生长发育情况。
5. 数据分析与验证：通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，以及肝脏再生能力的相关指标检测，分析转基因对绵羊胚胎的影响。
四、实验结果与分析1. 绿色荧光蛋白的表达：在显微镜下观察到转基因绵羊胚胎表达绿色荧光蛋白，表明基因成功整合到绵羊的基因组中并表达。
2. 肝脏再生能力的增强：通过对转基因绵羊的肝脏组织进行检测，发现其肝脏再生能力较对照组有明显提高，表明肝再生增强因子基因起到了作用。
3. 生长发育状况：观察代孕母羊体内的转基因绵羊胚胎生长发育情况，发现其生长发育状况良好，未出现明显的异常情况。
五、讨论与结论本研究成功将绿色荧光蛋白基因和肝再生增强因子基因进行转基因操作，并观察到其在绵羊胚胎中的表达和作用。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。
该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。
二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA 分子，分子量范围从1kb到200kb。
质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。
绿色荧光蛋白GFP的显微观察及其在转基因研究中的应用
报告基因的特点
已被克隆和全序列已测定； 表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细 胞中无相似的内源性表达产物；
其表达产物容易观察或能进行定量测定
常用的报告基因
基因名称 GUS 基因编码蛋白
β-D-glucuronidase（β-D葡萄糖苷酶）
检测方法
催化底物形成β-D-葡萄糖苷 酸，它在植物体中几乎无背 景，组织化学检测很稳定
实验仪器：荧光显微镜
实验步骤：
1. 2. 3.
取部分转基因幼苗放入IAA溶液中处理5-10分钟 。 无IAA处理的作为对照。 PI 染色 将植物根部浸泡在1XPI工作液中10秒左右。 用水冲洗30秒。
4. 制片 用擦镜纸擦载玻片 滴一滴水 用镊子取一棵幼苗，将根部在水中展开（可以将叶 片切除） 用镊子夹取盖玻片，从一侧轻轻盖上 5.显微镜观察 放下载物台，将载玻片放上载物台，旋转20X物镜 至光路，滤光片在明场位置（1） 将载物台上升至离物镜很近处，不要碰到物镜 寻找视野中模糊的根，下调载物台，聚焦 移动载物台，寻找根尖 转换至40X物镜，滤光片调至蓝光（3）或绿光（4 ），打开shutter，观察、拍照和保存实验结果。
3:绿色荧光蛋白--GFP
GFP最初从水母，jellyfish Aequorea victoria 中分离出 在分子生物学和细胞学领域，GFP是广 泛使用的报告基因
GFP
GFP蛋白含238 氨基酸残基， 分子量29.6KDa Fluorescent protein (荧光蛋白 ): 在蓝-紫外光的激发下产生强的 绿色荧光
普通生物学实验
GFP报告基因的显微观察及其在
增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达开题报告
增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达开题报告毕业论文开题报告生物技术增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达一、选题的背景与意义随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶( secreted embryo alkaline phosphatase，SEAP)基因、β-半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β-葡糖苷酸酶(glucosidase，GUS)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase，LUC)基因等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。
而绿色荧光蛋白基因作为一类新型的报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光。
作为报告基因，GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。
而且新的研究表明，GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使。
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，且EGFP具有敏感的标记检测率，又无放射性的危害，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。
目前，在利用一些原核表达载体进行基因表达研究，常常遇到外源基因表达与否不能迅速得知，纯化过程中对各分离组分需进行多次电泳检测，才能进行后续工作，花费大量时间。
因此，构建以绿色荧光蛋白为标记的原核表达载体能够为外源基因表达的检测提供一种简单而直观的方法。
本课题旨在利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体pET-28a-EGFP，并了解该载体的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。
二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：基本内容：（1）设计引物，通过PCR法扩增EGFP目的片段；（2）将EGFP目的片段与pMD19 T-Vector连接，构建pMD19-EGFP载体；（3）将pMD19-EGFP与pET-28a双酶切，回收大小片段之后连接，构建pET-28a-EGFP载体；（4）将pET-28a-EGFP重组载体转化至大肠杆菌，获得转EGFP基因的大肠杆菌；（5）IPTG诱导，并在诱导不同时间观察转EGFP基因大肠杆菌中绿色荧光蛋白的表达量。
含铁辅基的蛋白在莱茵衣藻中表达的研究
含铁辅基的蛋白在莱茵衣藻中表达的研究铁等金属元素在生物体中起着至关重要的作用，是生物活性的关键因子。
蛋白质将金属元素作为辅因子介导不同的生化过程。
莱茵衣藻的杯状叶绿体约占细胞体积的40%，其中含有大量的铁元素，并已被证明含有折叠和组装复杂的真核蛋白质的必要机制。
随着作物产量和治疗化合物需求的不断增加，细胞器作为生物反应器已经成为一大研究热点，并具有广阔的前景。
我们希望可以以衣藻作为生物反应器，研究需铁蛋白FAO1、Cyb5和NifH在莱茵衣藻中对铁的利用情况。
代谢和环境压力显著影响着农作物植物的最终产量。
脂肪醇氧化酶是生物体中链烃和长链脂肪酸进行ω-氧化通路中的重要组成酶，广泛存在于多种农作物中，不仅对植物基础代谢，而且可能对植物发育和抗逆性都起着重要作用。
并且该酶含有血红素辅基，需与铁结合才有活性。
我们以需铁蛋白FAO1为研究对象，首先建立其原核表达体系，在大肠杆菌中诱导表达FAO1，并纯化目的蛋白，通过ABTS底物显色反应检测蛋白活性；其次以pDBle 载体为基础，构建信号肽、Candida cloacae的fao1和His-tag融合基因的核转化表达载体，利用玻璃珠转化法将载体导入莱茵衣藻（CW15）中，使目的基因随机整合在衣藻基因组DNA中，目的基因转录后通过信号肽的作用，将FAO1定位到叶绿体中，纯化目的蛋白，通过ABTS底物显色反应检测蛋白活性；再次改造p72B-GX衣藻叶绿体转化载体，并利用改造后载体构建FAO1叶绿体转化表达载体。
我们的结果表明成功建立了FAO1原核表达体系，并优化了诱导表达和蛋白纯化条件，获得了具有活性的较纯FAO1蛋白；成功构建了FAO1的衣藻核转化表达载体pDBle-TFHis，获得了转化子，重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中，并成功转录，纯化的FAO1蛋白检测有活性；完成了从p72B-GX到p72B-MZ的衣藻叶绿体转化载体的改造，并成功构建了FAO1衣藻叶绿体转化载体p72B-MZ-FAO1。
增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达
增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞【摘要】In this study, EGFP was cloned into pGEX-4T-l vector to construct prokaryotic expression vector pGEX-4T-EGFP, the recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced with IPTG for protein expression, then the EGFP protein was detected by UV irradiation and SDS-PAGE. It can be used to provide a new report gene and selective marker for prokaryotic expression system.%以EGFP为标记基因,原核表达质粒pGEX-4T-1为载体,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP,并将其转入大肠杆菌BL21 (DE3).用IPTG进行诱导表达,通过紫外照射和SDS-PAGE检测其在大肠杆菌中的表达情况,为原核表达系统提供新的报告基因和筛选标记.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)002【总页数】4页(P103-106)【关键词】EGFP;克隆;重组质粒;原核表达【作者】刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q786绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
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2.3 电泳胶的浓度及其配制： 配制 100ml 1％TAE 琼脂糖电泳胶：在 100ml TAE 缓冲液中，加入 1g 琼脂糖，加热至
沸腾，待冷却到 40℃左右时加入 1ul EB 荧光液。 2.4 上样缓冲液：0.25％溴酚蓝和 40％（w/v）蔗糖水溶液混合成，存于 4℃。 3、 实验方法 3.1 SDS 碱裂解法制备质粒 DNA：小量制备 （1）挑转化后的单菌落，接种到 2ml 含有适当抗生素的丰富培养基（LB），37℃，200-300rpm
1
终止子）、衣藻转化载体 p124（带有 ble 基因，使宿主细胞具有腐草霉素和 Zeocin 抗性）、
大肠杆菌菌株（E.coli）XL1 由本实验室保存；
E-gfp 质粒（携带有 e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠。
1.2 衣藻材料
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii cc-849）由香港城市大学植物分子生物学与环境
SIGMA aborzentrifuge GmbH
机
电子天平
AB204－E
梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
电泳仪
PowerPac 300
Bio－Rad Laboratories，Inc.
PH 计
320－S PH 计
梅特勒－托利多仪器（上海）有
限公司
高压消毒锅
SA－300VA
新骏实业股份有限公司
光照培养箱
3
（4）Add 1 ul T4 DNA ligase(vial 3) （5）充分混匀 （6）16℃，过夜
3.5 一步法制备感受态细胞并进行转化 （1） 吸取 1ml OD600 约 0.5～0.6 的细菌到 1.5ml 离心管中，4000r/min 离心 5 分钟，彻底
去除上清。 （2） 加入 0.1ml 冰水预冷的 SSCS Solution 轻轻悬浮菌体，可立即转化或冻存于－70℃待
沉淀回收 DNA 后再进行第二酶酶切反应。 3.3 胶回收
用试剂盒从 Agarose 胶中回收 DNA，试剂盒购自 TaKaRa，方法参照 PCR Fragment Recovery Kit Ver.2.0 说明书 3.4 连接 用快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit） 载体 DNA 和插入片断按 1：3 的摩尔比加入，所加入 DNA 的最大量不要超过 200ng。 （1）10ulDNA(载体与插入基因) 溶于 1×conc. DNA 稀释缓冲液 （2）再加入 10ulT4 DNA 连接缓冲液(2×conc.)(vial 1) （3）充分混匀
其他：氯化钙、氨苄青霉素、饱和酚、氯仿、氧化铝等为国产，有关化学试剂，均为
分析纯或分子生物学级（Molecular biology grade）。
1.4 主要仪器设备
仪器
型号பைடு நூலகம்
制造商
离 大型离心机 2K15G Refrigerated Centifuge
心 小型离心机
1-13 Laboratory Centrifuge
对于大量制备，可相应增加 SSCS Solution。重悬后的细胞应分装成 50～100ul，然 后储存于－70℃。 3.6 e-gfp 基因衣藻表达载体的构建 3.6.1 克隆载体 p105G 的构建 E-gfp 质粒（携带有 e-gfp 基因）由中科院上海生化所惠赠，为了得到实验所需量的质粒， 现将 E-gfp 质粒转入到感受态菌株 XL1 blue 中，挑取单克隆进行摇瓶培养，大量扩增 e-gfp 基因，并通过 SDS 碱裂解法提取 E-gfp 质粒，凝胶电泳检测并定量。 通过 NotI 进行酶切 E-gfp 质粒后，加 Klenow 片断补平，并用酚氯仿抽提， 乙醇沉淀 过夜。离心收集沉淀并用去离子无菌水溶解，再用 SmaI 酶切，经电泳分离得到 e-gfp 基因 （大约 740bp），并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收。 用 PmacI 酶切 p105 质粒，经电泳分离得到线状的 p105 质粒，并用试剂盒从琼脂糖凝 胶中回收质粒。 插入片段（e-gfp 基因）和载体（p105）按 3：1 的摩尔比连接过夜，然后转化大肠杆 菌 E.coli XL1 中，通过酶切分析和 PCR 筛选出转化子，得到重组质粒 p105G。 3.6.2 表达载体 p105G124 的构建 筛选得到的阳性重组子 p105G 经大量扩增培养后，用 SDS 碱裂解法提取质粒，并用 EcoRI 酶切 p105G，经电泳分离并回收 e-gfp 基因的表达框架（约 1.7kb）。 插入片段（e-gfp 基因的表达框架）和载体（p124）按 3：1 的摩尔比连接过夜，然后 转化大肠杆菌 E.coli XL1 中，通过酶切分析和 PCR 筛选出转化子，得到重组质粒 p105G124。 3.7 衣藻的转化 通过“珠磨法”将外源基因转化到衣藻中，即将含有 e-gfp 基因的表达载体 p105G124 转入到衣藻细胞中，并在含 Zeocin 抗性平板（20ug/ml）上进行筛选。 （1）CC-849 在连续光照下，在 TAP 培养液中培养至对数期，细胞数约为 1－2×106 cells/ml。 （2）5000rpm,室温离心 5min，收集 CC-849。 （3）弃上清，用灭过菌的 TAP 培养液重悬沉淀，调整细胞浓度至 2×108cells/mL （4）吸取 300ul 悬浮液到 5ml 的试管里（里面有灭过菌的石英砂）。 （5）目的 DNA p105G124 用 NotI 酶切成线状，取 1μg 加入（4）中的试管中，同时建立一 个不加目的 DNA 的对照组（CK）。（注：目的 DNA 可以用 CsCl2 梯度离心法或试剂盒 提取）。 （6）把 CC-849/石英砂/外源 DNA 混合物在振荡器上以最高速度振荡 15 秒。 （7）把混合物转移到 25mL 的带螺旋帽的离心管中，加入 10mL 灭菌 TAP 培养液，在 100rpm 摇床过夜培养（18℃），让细胞恢复。 （8）3000rpm，室温 5min，收集细胞。 （9）弃上清，用 0.5mL TAP 缓冲液小心重悬，加入 3.5mL0.5％TAP 培养基，混匀后倒在 TAP 平板上（含 20μg /ml、Zeocin） （10）静置待凝固，倒置平板，放在 22℃光照培养箱里培养 3 周，待平板上长出绿色的单 克隆。 3.8 衣藻 DNA 的提取 （1）取 20m1 处于对数生长后期的衣藻培养液．4℃，5000r／min，离心 5min，收集细胞。
散均匀，然后冰浴 3－5min。 （6）4℃、15000r/min、离心 5min，将上清转移到另一离心管中。 （7）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提， 4℃，15000r/min，离心 2min，将
上清转移到另一离心管中。
（8）加入两倍体积无水乙醇沉淀 DNA，－20℃冰箱沉淀 1h 以上； （9）4℃、15000r/min、离心 5min 弃上清，用冰预冷的 70％乙醇 1ml 洗涤 DNA 沉淀，弃
生物技术实验室提供，属细胞壁缺陷株。
1.3 主要试剂
限制性内切酶、klenow 片断、去磷酸化酶、T4 连接酶；质粒提取试剂盒、PCR 片断回
收试剂盒（PCR Fragment Recovery Kit Ver.2.0）、DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation
Kit）、DNA 片断纯化试剂盒（DNA Fragment Purification Kit）、RT-PCR 反应试剂盒；DNA
上清，倒置于滤纸上，使乙醇完全挥发，直至试管内没有看见的液体存在。
（10）溶于 20ul 无菌水或含有去 DNA 酶的 RNA 酶的 TE 溶液。 （11）通过电泳鉴定该质粒是否为目的质粒以及判断质粒的纯度。 3.2 限制性内切酶酶切反应 （遵照所购试剂说明书）
(1) 据实验需要取一定量的 DNA，加入适量的限制性内切酶及相应的反应缓冲液、无菌去 离子水，使反应体系中的甘油浓度<5%.
摇床上培养过夜。
（2）取 1.5ml 菌液至 EP 管(1.5ml 离心管），4℃、13000r/min、30sec 离心收集沉淀。 （3）弃上清，尽可能吸干培养液，加入预冷的碱裂解液Ⅰ100ul，剧烈振荡。 （4）加入 200ul 新配制的碱裂解液Ⅱ，颠倒 4－5 次，以混合内容物，切勿振荡！冰浴 10min。 （5）加入 150ul 冰预冷的碱裂解液Ⅲ，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分
Marker（λDNA/EcoRⅠ＋HindⅢ）、DL 2000、ExTaq Mix（dNTP、Taq 酶、缓冲液）等均购
自 TaKaRa 生物（大连）有限公司）。
PCR 引物由上海生工生物工程公司合成；
DNA 快速连接试剂盒（Rapid DNA Ligation Kit）购自 Roche 公司
Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司；
MJ Research
紫外分光光度计
Ultrospec 2000
Pharmacoa Biotech
荧光分光光度计 F－4500FL Spectrophotometer
HITACHI
2、 主要试剂的配制或成分
2.1 衣藻培养基：
培养基名称
TAP
Tris min
HSM
H2O Tris 4×Beijerinck salts
增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）
在莱茵衣藻中表达的研究
（生命科学学院，生物工程系生物技术专业 吴锦霞） （学号：2000302055）
内容提要：通过构建增强型绿色荧光蛋白基因（e-gfp）衣藻表达载体，利用“珠磨法” 将 e-gfp 导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻（CC-849）中，经 Zeocin 抗性筛选出转 e-gfp 基因衣藻； 在光照下培养转基因藻，经 PCR 和 RT-PCR 对转基因藻进行分子检测，结果表明 e-gfp 已经 稳定整合到莱茵衣藻基因组中，并具有转录活性；随后的转基因藻相对荧光强度分析表明转 e-gfp 衣藻的相对荧光强度明显高于野生型衣藻。