荧光蛋白基因试验
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白EGFP的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015- ~2015-实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min13000rpm,1min13000rpm,2min13000rpm,1min2)PCR扩增目的基因GFP取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：O 6μlH2质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
红色荧光蛋白(RFP)的原核表达
红色荧光蛋白（RFP）的原核表达报告题目红色荧光蛋白（RFP）的原核表达作者姓名饶慧班级学号0802班/*************指导教师王友如完成时间2011年02月生物学实验教学中心目录引言 (1)1实验材料及实验仪器 (4)1.1实验材料 (4)1.2实验仪器 (5)2实验方法 (7)2.1 重组质粒的构建 (7)2.2工程菌株的活化 (7)2.3诱导表达 (8)2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 (8)3 结果与分析 (9)总结 (10)参考文献 (11)致谢 (13)红色荧光蛋白的原核表达饶慧（指导老师：王友如）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）摘要实验目的：研究红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）基因在大肠杆菌中原核表达。
实验方法：通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ (pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白（RFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导RFP 基因表达，可以看到显现红色，最后根据SDS-PAGE电泳结果，判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。
实验结果：结果显示构建的重组质粒pET-28ɑ-RFP在E.coli中成功表达。
关键词红色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达分子生物学综合实验Prokaryote Expression of Red Fluorescent Protein (RFP)Rao Hui(Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi,Hubei,435002 )Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ(pET-28ɑ).Then the two plasmids are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judging whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28ɑ-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli.Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression红色荧光蛋白的原核表达饶慧（指导老师：王友如）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
蛋白质荧光标记技术简介
蛋白质荧光标记技术简介蛋白质荧光标记技术是一种重要的生物化学技术，用于研究蛋白质的位置、表达和相互作用。
它通过将荧光染料或荧光蛋白与目标蛋白结合，从而使其在实验过程中能够被可视化和检测。
本文将介绍蛋白质荧光标记技术的原理、应用领域以及最常用的几种标记方法。
一、蛋白质荧光标记技术的原理蛋白质荧光标记技术的原理基于荧光现象，即某些物质在受到一定波长的光照射后，会发出可见光的特性。
这种技术利用具有荧光特性的染料或蛋白质与目标蛋白质发生特异性结合，从而实现对目标蛋白质的可视化和检测。
二、蛋白质荧光标记技术的应用领域1. 蛋白质定位和分布研究：蛋白质荧光标记技术可以帮助研究人员确定特定蛋白质在细胞或组织中的位置和分布情况，从而了解其功能和作用机制。
2. 蛋白质表达研究：通过标记目标蛋白质的荧光染料或蛋白质，可以追踪和监测蛋白质在细胞或组织中的表达水平和动态变化。
3. 蛋白质相互作用研究：蛋白质荧光标记技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系，如蛋白质的复合物形成、酶促反应等。
4. 药物研发与筛选：蛋白质荧光标记技术可用于评估药物与目标蛋白质之间的结合能力和影响，有助于药物研发和筛选过程。
三、常用的蛋白质荧光标记方法1. 化学标记法：化学标记法是通过将荧光染料或某些具有荧光性质的化合物与目标蛋白质反应来实现标记。
常用的化学标记剂有荧光同位素、闪烁染料和化学选择性染料等。
2. 基因工程标记法：基因工程标记法是通过将荧光蛋白基因与目标蛋白质基因相连接，使得目标蛋白质能够表达出与荧光蛋白相结合的融合蛋白，从而实现标记。
其中最为常见的是绿色荧光蛋白（GFP）。
3. 免疫标记法：免疫标记法是利用抗体的特异性与目标蛋白质发生结合，再将带有荧光标记的二抗与抗原-抗体复合物相结合，从而实现对目标蛋白质的标记。
四、对蛋白质荧光标记技术的观点和理解蛋白质荧光标记技术是一种非常强大和广泛应用的技术，在生物学研究领域中起到了至关重要的作用。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达
分子生物学综合实验论文题目:绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam HI和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。
取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌 E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。
重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1μL/mL的卡纳霉素的LB培养基上培养。
当A600达到0.7时，用终浓度为0.8mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。
关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight,College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam HI and Not I,the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言：01.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP）01.1.1 GFP研究背景01.1.2 GFP研究应用11.2基因的克隆与表达22.实验试剂及实验仪器：42.1实验试剂与材料：52.2实验仪器：63.实验方法63.1质粒提取方法:63.2琼脂糖凝胶电泳及回收:83.3酶切及连接：93.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入：113.5酶切验证重组质粒：123.6GFP基因的表达133.6.1活化菌种133.6.2扩大培养133.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达134.结果与分析134.1质粒提取过程中现象与结果：134.2琼脂糖凝胶电泳144.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果：154.4酶切验证重组质粒154.5GFP基因的表达结果：165.讨论：165.1提取质粒出现图六的原因是：165.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因：175.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因:17 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因：195.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因：196.参考文献20前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）1.1.1 GFP 研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋20杨晨20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
二、实验流程三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。
它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。
荧光蛋白基因的克隆和表达实验一
提示
质粒提取的菌种培养时间为16-18h 相关器材灭菌及使用器皿的清洁干净，不
确定是否干净的坚决不用 了解样品的保存方法，根据自己的需要进
行保存 EP管标识：样品名称、制备人、制备日期 实验过程中做到胆大心细，关键步骤不能
忽视
每组试剂配制量（3人一组）
LB培养液（100ml），共五瓶 (1L溶液中)：Tryptone(胰蛋白胨)：10g,
pET- 28a质粒
载体(Vector)： 要把一个有用
的外源基因通过 基因工程手段， 转化到细胞中去 外源基因进入受 体进行繁殖和表 达，需要运载工 具，携带细胞的 这种工具就叫载 体。
质粒pET-28a
pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统 之一。 目的基因被克隆到pET质粒载体上， 受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达 由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿 主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基 因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导 时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的 蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通 常可以占到细胞总蛋白的5们 三 人 在 发
科 学 家 下 村 修 、 美 国 科 学 家 马
日 ， 瑞 典 皇 家 科 学 院 宣 布 ，
2008 ·
现丁
和 研 究 绿 色 荧
沙 尔 菲 和 美
年 诺 贝 尔 化
什么是绿色荧光蛋白？
绿色荧光蛋白 （green fluorescent protein，GFP）是 一类存在于包括水母、 水螅和珊瑚等腔肠动 物体内的生物发光蛋 白。当受到紫外或蓝 光激发时，GFP 发 射绿色荧光。
实验一 自主选择实验内容，预习准备，试剂配制 实验二 交实验计划报告及每次实验详细步骤，质
荧光蛋白基因
荧光蛋白基因
荧光蛋白基因是一种能够发出荧光的基因，通常在生物学和医学领域中被广泛应用。
它是由一个叫做GFP（Green Fluorescent Protein）的蛋白质编码而来的。
该基因最初是从海葵中发现的，后来被转移到了其他生物体中，如昆虫、哺乳动物、植物等。
荧光蛋白基因的应用非常广泛。
在生物学研究中，它可以用于标记细胞、组织或器官，以便观察它们在不同条件下的变化。
例如，在显微镜下观察标记了荧光蛋白基因的细胞时，可以清晰地看到它们在体内运动和交互的过程。
此外，在医学诊断和治疗方面也有很多应用。
例如，可以通过将荧光蛋白基因转移到人类细胞中来检测某些疾病或治疗某些疾病。
荧光蛋白基因是如何工作的呢？当GFP蛋白质与紫外线或蓝色光线相遇时，会发出绿色的荧光。
这是因为GFP蛋白质中存在一种名为色素的化合物，它可以吸收能量并将其转换为绿色荧光。
这种荧光可以被显微镜或其他设备检测到，从而使得我们能够观察到标记了荧光蛋白基因的细胞或组织。
最后，需要注意的是，虽然荧光蛋白基因在生物学和医学领域中有着广泛的应用，但它也存在一些限制。
例如，在某些情况下，标记了荧
光蛋白基因的细胞或组织可能会受到损伤或死亡。
此外，在某些实验
条件下，荧光信号可能会受到干扰或噪音影响。
因此，在使用荧光蛋
白基因时需要谨慎考虑，并尝试最大限度地减少其潜在的风险和限制。
总之，荧光蛋白基因是一种非常有用的工具，在生物学和医学领域中
有着广泛的应用。
它可以帮助我们更好地理解生命现象，并为疾病诊
断和治疗提供新的思路和方法。
rfp红色荧光蛋白实验方法
rfp红色荧光蛋白实验方法
RFP红色荧光蛋白的实验方法主要是通过生物技术手段将含有荧光蛋白基因的质粒进行体外转化和克隆化，从而在受体细胞中表达出红色荧光蛋白。
具体步骤如下：
1. 提取质粒：从DH-5α大肠杆菌中提取质粒pET-28a，并构建重组质粒pET-28a-RFP，将含红色荧光蛋白(RFP)基因的片段插入到质粒pET-28a中。
2. 活化菌种：将重组质粒pET-28a-RFP转入大肠杆菌感受态细胞中，通过热激法或化学法等方法使细胞吸收重组质粒。
3. IPTG诱导：在含有重组质粒的大肠杆菌培养基中加入IPTG诱导剂，以促进RFP基因的表达。
4. 蛋白质提取和纯化：收集表达红色荧光蛋白的大肠杆菌细胞，通过细胞破碎、离心等方法提取和纯化红色荧光蛋白。
5. SDS-PAGE检测：通过SDS-PAGE电泳技术检测表达出的红色荧光蛋白分子量，确认其是否成功表达。
6. 结果分析与处理：根据实验结果分析重组质粒是否成功转化、RFP基因是否成功表达以及表达产物的纯度和含量等指标，并进行数据处理和结果分析。
需要注意的是，以上步骤仅是基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整和优化。
同时，实验过程中需要注意安全问题，如使用菌种的安全性、操作过程中的无菌技术等。
荧光蛋白技术在生物分析中的应用
荧光蛋白技术在生物分析中的应用生物学研究中有很多需要观测细胞、分子移动、信号转导等过程的实验。
在这个领域中，荧光蛋白技术是一种常用的手段。
它可以有力地解决这种研究中分子标记和信号监控的问题。
荧光蛋白技术在生物分析中应用广泛，包括监测DNA合成和 DNA 损伤修复、分析蛋白质的分布和相互作用、研究酶的功能及其动力学行为等。
下面，我们将详细介绍荧光蛋白技术在这些领域中的应用。
1、监测DNA合成和 DNA 损伤修复荧光蛋白用于监测 DNA 合成及 DNA 损伤修复的实验，可以通过荧光显微镜观测单个细胞或细胞群中单个细胞的荧光强度的变化。
荧光蛋白可以被标记在DNA 而不破坏其结构，从而使其与其他荧光蛋白结合，形成不同的荧光混合物，实现对 DNA 合成和损伤修复的监测。
荧光蛋白技术的一个突出应用是监测 DNA 合成和修复过程中的核转录现象，这个过程可以得到相关基因表达的信息。
2、分析蛋白质的分布和相互作用对于分子生物学研究来说，了解分子的结构、组成、量和分布等信息是非常重要的，这些信息可以了解蛋白质在生物体中的生理作用。
荧光蛋白可以用于标记蛋白质并实现它们的定位和分布，用于研究蛋白质相互作用等方面。
利用荧光标记的蛋白质，可以在荧光显微镜下观察它们在细胞内的运动轨迹、位置和数量。
荧光蛋白标记的蛋白质可以探测它们在不同生物活动状态下的变化，并可以用于检测蛋白质中某些基因的调控。
3、研究酶的功能及预测酶随时间的变化荧光蛋白技术也可以用于研究酶的功能及预测酶随时间的变化。
利用荧光蛋白标记酶的方法，可以将荧光标记的蛋白质与其他蛋白质结合，形成激酶-底物复合物，并使用荧光显微镜技术进行荧光成像和跟踪。
荧光蛋白技术可以直接监测酶的动态和功能的变化，并预测酶在不同条件下的表达和活性。
总之，荧光蛋白技术在生物分析中具有广泛的应用价值。
它可以提供定量和非侵入式的检测手段，有效地解决了生物分析实验中的多种问题。
对于生物学研究来说，荧光蛋白技术的应用将提高细胞和分子的观测能力，有助于更加深入地理解生命科学中的重要过程。
GFP(绿色荧光蛋白基因)的免疫印迹-2
GFP(绿色荧光蛋白基因)的免疫印迹-2第二部分：免疫印迹染色[仪器、材料与试剂](一)仪器与器具1．电泳仪(要求为大电流低电压)2．电泳转移槽及转移夹3．水平摇床4．小塑料盒5．镊子6．搪瓷盘(二)材料1．醋酸纤维膜2．滤纸3．一次性塑料手套(三)试剂1．转移电泳缓冲液25mmo1／L Tris，192mmo1／L 甘氨酸，20％甲醇，pH 8.36.05gTris + 28．83g Gly + 400mL甲醇，用dH20溶解并定容至2L2．PBS贮存液(10xPBS)0.2mo1／L 磷酸缓冲液，PH＝7.4，含8.7％的NaCl3．PBS缓冲液：10xPBS贮存液用重蒸水10倍稀释4．封闭液：PBS + 5％脱脂奶粉5．漂洗液：PBS + 0.2％Triton X-1006．丽春红染色液：4％三氯醋酸，1％丽春红7．一抗：兔抗GFP血清，用PBS适稀释50-100倍8．辣根过氧化物酶标记的蛋白A (HRP-pA)9．DAB显色液：DAB 1mg，溶于5mL的50mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4-7.6）中，然后加入50微升的0.5％的过氧化氢。
显色液不稳定，要在临用前配制。
[实验操作] （接第一部分的实验操作8往下做）1．将醋酸纤维素膜（AC膜）事先裁成比需要转移的凝胶块略大的小块。
2．在搪瓷盘中加入转移电泳缓冲液，将AC膜在转移电泳缓冲液中浸泡，使完全浸透。
同时把两块海绵也在转移电泳缓冲液中浸透。
3．将转移夹打开，置搪瓷盘中，在有黑色标记的一半上放上一块已浸透了转移电泳缓冲液的海绵，把贴在滤纸上的凝胶块滤纸面向下放在海绵上，在转移电泳缓冲液中使 AC膜紧贴在凝胶上，切勿使AC膜与凝胶间留有气泡。
再把一张滤纸浸透，小心地放在AC膜上，其上再放上另一块海绵。
将转移夹合上，夹紧，做成“三明治”。
4．转移电泳槽中放入转移电泳缓冲液，将“三明治”夹放入，使凝胶块（即黑色的一面）朝向负极，AC膜朝向正极，切勿放错方向，否则蛋白将跑到溶液中，而不是转移到膜上。
荧光蛋白和荧光标记法（FluorescentLabeling）
荧光蛋⽩和荧光标记法（FluorescentLabeling）⼀种发出绿⾊荧光的流⽔母试题研究：荧光蛋⽩和荧光标记法在⽣物学中的研究越来越重要，从某种⾓度来看，⽐同位素标记法有更重要的应⽤。
随着基因⼯程的技术发展，应⽤越来越⼴泛。
以下对荧光蛋⽩及其应⽤作⼀简单介绍以拓展视野。
试题：为研究发育型青光眼患者⾓膜⼩梁细胞中M蛋⽩分泌是否正常，研究者将荧光蛋⽩基因与M蛋⽩基因通过⼀定⽅式分别导⼊Hela细胞中进⾏培养，⼀段时间后检测培养液和细胞中荧光。
实验分组及结果如表。
注：G绿⾊荧光蛋⽩基因；R红⾊荧光蛋⽩基因；M+正常⼈M蛋⽩基因；M-青光眼患者异常M蛋⽩基因；R-M+、G-M+和R-M-均表⽰2个基因拼接成为1个基因。
下列叙述正确的是（）A. 导⼊的R-M+基因具有2个转录的启动部位B. 根据实验结果可知Hela细胞中本来就有M-基因C. 发育型青光眼患者⾓膜⼩梁细胞中M蛋⽩的合成量多于正常⼈D. 在患者的⾓膜⼩梁细胞中导⼊M+基因对控制病情⽆效解析：R-M表⽰2个基因拼接成为1个基因，因此有1个转录的启动部位，A错误；根据1、2、3、4组实验结果可知，在没有M蛋⽩的情况下，荧光标记只存在于细胞内，⽽和正常M蛋⽩基因连接后，荧光标记出现在了培养液中，即正常M蛋⽩合成后会分泌到细胞外，但是和青光眼患者M蛋⽩基因连接后，细胞外将不会出现荧光标记，但不能说明Hela细胞中本来就有M-基因，B错误；发育型青光眼的病因是M蛋⽩基因异常导致其指导合成的M蛋⽩异常，从⽽导致患者细胞中的M蛋⽩不能正常地分泌到细胞外，最终导致⼩梁细胞功能异常，C错误；根据4、5、6组实验结果对⽐可知，对患者细胞内导⼊正常的M蛋⽩基因对于病情的控制⽆效，D正确。
故答案为D。
拓展：荧光蛋⽩有关的知识.1. 荧光蛋⽩的发现20世纪中期，⼀位⽇本科学家下村修才注意到并着⼿研究了⽔母这⼀独特的发光现象，并发现其荧光源⾃⼀种会发光的蛋⽩——⽔母蛋⽩，它可以发出蓝⾊的荧光并将其传递给另⼀种绿⾊荧光蛋⽩，最终使⽔母产⽣绿⾊的荧光。
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荧光蛋白基因实验胡建江，王安博实验一质粒DNA的提取目的及意义：1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
实验原理：溶液I（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA-Na、25mmol/L pH=8.0Tris-HCl）可以分散细胞，螯合金属离子可以使酶失活，防止DNA的降解；溶液II(0.4mol/L NaOH与2%SDS临用前1:1配用）可以使细胞在溶液中降解时，蛋白质与染色体DNA发生变性；溶液III （5mol/L醋酸钾30ml、5mol/L冰醋酸 5.75ml、5mol/L双蒸水14.25ml）使得酸性条件下质粒DNA复性，留在上清液，而DNA和蛋白质—SDS复合物等发生沉淀。
实验用品：1.仪器（恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台、10uL+100uL+1000uL 微量移液器各一支、台式高速离心机、制冰机、混合漩涡器。
）2.材料（事先培养好的含目的基因质粒的菌液、1.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器及取液器吸头、三角瓶、量筒、试剂瓶等）3.试剂（LB培养液：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、pH=7.5；溶液I/II/III；50mg/ml卡那霉素贮存液工作浓度50ug/ml；100mg/ml 氨苄青霉素贮存液工作浓度100ug/ml；抽提液：饱和酚：氯仿：异戊醇+25:24:1 作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离，饱和酚密度大，可使DNA在上清液中，异戊醇防止抽提液气泡；无水乙醇作用:除去DNA水化层，使DNA沉淀；70%乙醇作用：纯化质粒DNA；含RNA酶的ddH2O 作用：溶解DNA）实验步骤：将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中（相应浓度抗生素），37摄氏度培养过夜取培养菌液1.5mL置EP管中，10000rpm，2min，弃上清液后，此步骤重复一次，弃上清液加入100uL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min加入200uL新配置的溶液II，轻轻翻转2-3次，使之混匀，冰上放置5min加入150uL冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min10000rpm 5min，取上清液于另一干净的离心管中向上清液中加入等体积（约400uL）的抽提液，振荡混匀，10000rpm 10min，将上清液转移至新的离心管中加入等体积（约370uL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min，取上清液于新离心管中向上清液加入其2倍体积无水乙醇，混匀，-20摄氏度放置30min 12000rpm 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体加0.8ml70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min加20ul含RNA酶的ddH2O，-20摄氏度保存备用注意事项：1.饱和酚（取下层）单独吸，氯仿：异戊醇（24:1）吸；2.制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈震荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用；3.在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，避免污染。
实验二质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测实验原理：在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。
当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋>线状>开环。
但有时也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量相关。
实验用品：1.仪器：电泳仪、电泳槽、样品槽模板（梳子）、有机玻璃内槽、水平仪、取液器、微波炉、凝胶成像系统。
2.材料：提取的质粒溶液、琼脂糖、锥形瓶、一次性手套、胶铲、封口膜、剪刀、取液器吸头。
3.试剂：Gold view（DNA染液）、1 X TAE缓冲液、上样缓冲液（6 X Loading Buffer）。
实验步骤：1.琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30ml 1 X TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。
待胶液冷却至65摄氏度（不烫手为宜），加入1uL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。
静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。
2.加样：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1 X TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA 5uL与1uL Loading Buffer(6X)混匀，加入胶板上的样品孔内。
3.电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边缘约1-2cm处，停止电泳。
4.观察和拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。
实验三 PCR扩增实验原理：PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火（复性）--延伸三个步骤。
实验步骤：1.在0.2mL EP管内配制50uLPCR反应体系一个：反应物体积（uL）ddH2O 3410 X Buffer 5MgCl2 34X dNTP 2正向引物 1反向引物 1Taq酶 1质粒DNA模板 32.混匀后瞬时离心；3.放入PCR仪中，设置反应程序：①94℃预变性5min；②94℃变性30S；③55℃退火30S；④72℃延伸60S；⑤重复步骤②-④30次；⑥72℃延伸10min；4.取5uL反应液加1uL 10x loading buffer做电泳检测，分析所有目的片段的大小。
实验四酶切实验实验原理：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
PCR是在生物体内进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火--延伸三个步骤，一般重复25-30次，短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。
选择质粒pET-28a作为载体的原因：pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。
宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。
充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
实验用品：1.材料：实验一提取的质粒pEGFP-N3和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套；2.试剂：NotI，BamHI，ddH2O,10xBuffer，引物，琼脂糖，Gold view；3.设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱。
实验步骤：1.分别取两支0.2mlEP管做上标记；2.两个EP管中分别配置下列的30uL体系：①号EP管②号EP管水9uL 水9uL 10xBuffer 3uL 10xBuffer 3uL NotI 1uL NotI 1uLBamHI 2uL BamHI 2uLpET-28a 15uL pEGFP-N3 15uL3.将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h；4.取5uL①②EP管的酶切反应液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果；5.按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。
实验五 DNA的连接重组实验原理：①连接的DNA分子具备的条件：具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构；②：连接反应温度：理论上讲，连接反应的最佳温度是37℃，此时脸姐妹的活性最高。
但37℃粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12-16℃。
此时既可以最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定。
本实验选择16℃。
实验用品：1.材料：酶切后的EGFP、RFP和pET-28a、0.2mlEP管、取液器吸头、一次性手套；2.试剂：T4DNA连接酶、ddH2O、T4DNA连接酶buffer；3.设备：移液器、台式高速离心机、PCR仪。
、实验步骤：1.在EP管中分别配置下列的体系：0.2mlEP管10xBuffer 2.5uL酶切后的pET-28a 7.5uL酶切后的荧光基因片段13uLT4DNA连接酶（考虑连接效率）2uL（X：Y=1:10-30.总体积25uL）2.EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22℃反应20min，-20℃下保存用于转化。
实验六重组质粒转入DH5α扩增实验原理：重组DNA分子的转化原理：细菌处于容易吸收外缘DNA的生理状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建重组DNA分子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA 复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp等）得到表达。
在选择培养基上进行重组子的鉴定。
实验步骤：1.取出感受态细胞DH5α让其在冰上自然解冻，每200uL解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30min；2. 42℃热冲击90S，立即置于冰浴5min；3.再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37℃摇床中培养1h；4. 1h后，6000rpm 3min，去掉上清液（约留200uL的培养液），摇匀菌块；5.用玻璃涂布器将溶液混匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜；6.第二天早上观察结果。
实验七菌落PCR鉴定实验原理：PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火--延伸三个步骤组成：高温变性：94℃下DNA双链解旋为单链；低温退火：55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；中温延伸：72℃时，Taq酶以4种dNTP为原料，引物为复制起点，按5’到3’方向，复制模板的互补链；按此循环，一般重复25-30次，短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。
实验用品：1.材料：DNA模板，4xdNTP，T7正反引物，Taq酶，琼脂糖，MarkerDNA，吸头；2.试剂：10xBuffer，15mmol/L MgCl2，T7启动子正向引物：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’,T7启动子反向引物：5’-TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’；3.仪器：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统。