荧光蛋白基因试验

荧光蛋白基因实验

胡建江，王安博

实验一质粒DNA的提取

目的及意义：1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；

2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

实验原理：溶液I（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA-Na、25mmol/L pH=8.0Tris-HCl）可以分散细胞，螯合金属离子可以使酶失活，防止DNA的降解；溶液II(0.4mol/L NaOH与2%SDS临用前1:1配用）可以使细胞在溶液中降解时，蛋白质与染色体DNA发生变性；溶液III （5mol/L醋酸钾30ml、5mol/L冰醋酸 5.75ml、5mol/L双蒸水14.25ml）使得酸性条件下质粒DNA复性，留在上清液，而DNA和蛋白质—SDS复合物等发生沉淀。

实验用品：

1.仪器（恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台、10uL+100uL+1000uL 微量移液器各一支、台式高速离心机、制冰机、混合漩涡器。）

2.材料（事先培养好的含目的基因质粒的菌液、1.5ml塑料离心管、EP管架、微量取液器及取液器吸头、三角瓶、量筒、试剂瓶等）

3.试剂（LB培养液：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、pH=7.5；溶液I/II/III；50mg/ml卡那霉素贮存液工作浓度50ug/ml；100mg/ml 氨苄青霉素贮存液工作浓度100ug/ml；抽提液：饱和酚：氯仿：异戊醇+25:24:1 作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的

分离，饱和酚密度大，可使DNA在上清液中，异戊醇防止抽提液气泡；无水乙醇作用:除去DNA水化层，使DNA沉淀；70%乙醇作用：纯化质粒DNA；含RNA酶的ddH2O 作用：溶解DNA）

实验步骤：

将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中（相应浓度抗生素），

37摄氏度培养过夜

取培养菌液1.5mL置EP管中，10000rpm，2min，弃上清液后，此步

骤重复一次，弃上清液

加入100uL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min

加入200uL新配置的溶液II，轻轻翻转2-3次，使之混匀，冰上放置

5min

加入150uL冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色

絮状物，冰上放置15min

10000rpm 5min，取上清液于另一干净的离心管中

向上清液中加入等体积（约400uL）的抽提液，振荡混匀，10000rpm 10min，将上清液转移至新的离心管中

加入等体积（约370uL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min，取

上清液于新离心管中

向上清液加入其2倍体积无水乙醇，混匀，-20摄氏度放置30min 12000rpm 5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体

加0.8ml70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干

燥30min

加20ul含RNA酶的ddH2O，-20摄氏度保存备用

注意事项：1.饱和酚（取下层）单独吸，氯仿：异戊醇（24:1）吸；

2.制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈震荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用；

3.在取各种试剂的过程中，一定注意移液器吸头的更换，避免污染。

实验二质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测

实验原理：在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋>线状>开环。但有时也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料

含量相关。

实验用品：

1.仪器：电泳仪、电泳槽、样品槽模板（梳子）、有机玻璃内槽、水平仪、取液器、微波炉、凝胶成像系统。

2.材料：提取的质粒溶液、琼脂糖、锥形瓶、一次性手套、胶铲、封口膜、剪刀、取液器吸头。

3.试剂：Gold view（DNA染液）、1 X TAE缓冲液、上样缓冲液（6 X Loading Buffer）。

实验步骤：

1.琼脂糖凝胶板的制备：称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30ml 1 X TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却至65摄氏度（不烫手为宜），加入1uL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子。

2.加样：胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1 X TAE缓冲液淹没过胶板1mm，用取液器将提取的质粒DNA 5uL与1uL Loading Buffer(6X)混匀，加入胶板上的样品孔内。

3.电泳：将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边缘约1-2cm处，停止电泳。

4.观察和拍照：将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

实验三 PCR扩增

实验原理：PCR是在生物体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火（复性）--延伸三个步骤。

实验步骤：1.在0.2mL EP管内配制50uLPCR反应体系一个：

反应物体积（uL）

ddH2O 34

10 X Buffer 5

MgCl2 3

4X dNTP 2

正向引物 1

反向引物 1

Taq酶 1

质粒DNA模板 3

2.混匀后瞬时离心；

3.放入PCR仪中，设置反应程序：①94℃预变性5min；②94℃变性30S；③55℃退火30S；④72℃延伸60S；⑤重复步骤②-④30次；⑥72℃延伸10min；

4.取5uL反应液加1uL 10x loading buffer做电泳检测，分析所有目的片段的大小。

实验四酶切实验

实验原理：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。PCR是在生物体内进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应，主要有变性--退火--延伸三个步骤，一般重复25-30次，短时间内，使目的基因片段扩增2n（n代表循环次数）。

选择质粒pET-28a作为载体的原因：pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。