荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测

一、背景介绍

1．绿色荧光蛋白

1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非 aequorin。与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。1985到1992年间，科学家 Douglas Prasher 测定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。

绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。

GFP的优点很多：首先，它本身稳定，不需要任何反应底物和辅助因子，且无种属限制，可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光，在450～490nm 蓝光激发下,发光能保持 10min 以上。其次，其分子量小，对目的基因的功能无任何影响，融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质，对细胞没有毒性。最后，GFP观察方便，利用激光扫描共聚焦显微镜，甚至普通显微镜都可以观察到活细胞内蛋白的变化、活动，用肉眼就可对辨别细胞是否表达及其表达水平。

作为一种新型的报告基因，绿色荧光蛋白在生命科学的各个领域得到广泛的应用：利用绿色荧光蛋白的特有发光机制，可将GFP作为蛋白标签。就是利用 DNA 重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染或转化至合适的细胞进行表达，而后借助荧光显微镜观察细胞内活体中标记的蛋白质。绿色荧光蛋白也可用于大规模药物筛选。另外，由于绿色

荧光蛋白独特的光信号传导机制及其在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用影响的特性，极适用于成为活细胞体内的光学感受器。近年来，由于融合抗体具有发射荧光和与抗原结合两种特性，所以将其用做免疫染色的检测试剂，直接用于流式细胞仪、免疫荧光的标记、肿瘤的检测等。

目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，简称EGFP）。EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等

EGFP (720bp)的基因片段: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACA AGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAA GCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATG AAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCA ACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAA GGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAG AAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGC AGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGA CCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTG TACAAGTAA

2.大肠杆菌表达载体及表达系统

大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化筛选标记。（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。